Physiologie de la Nutrition

188 Pages·2015·5.74 MB·French

by  Pr Kheroua Omar

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Laboratoire de Physiologie de la
Nutrition et de Sécurité Alime ntaire

Faculté des Sciences de la Nature et Vie
Département de Biologie

THESE DE DOCTORAT
Spécialité : Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire
Présentée par
Mlle DIB Wafaa

Intitulé :
Caractéristiques et rôle probiotique des bactéries lactiques
isolées à partir du lait de chèvre : Effet immunomodulateur
chez la souris Balb/c.
Soutenue le 02/06/2015
Devant le jury:
Président : C hekroun Abdallah, Professeur, Université d'Oran 1
Rapporteur : K heroua Omar, Professeur, Université d'Oran 1
Examinateur : Haertlé Thomas, Directeur de recherche, INRA Nantes
Examinateur : Kihal Mabrouk, Professeur, Université d'Oran 1
Examinateur : Riazi Ali, Professeur, Université de Mostaganem
Examinateur : Benali Mohamed, Professeur, Université Sidi Bel Abbes
Dédicace

Je dédie ce travail
A mes parents, les piliers de ma vie, pour leur amour, leur
soutien et leur confiance. Pour tout ce que qu’ils me
donnent et m’apportent, Merci Papa et Maman, que ce
travail puisse vous rendre fière de moi.
A mes frères et sœurs, je leur dédie ce travail, signe de ma
gratitude et de mon amour.
A toute ma famille
et à celles qui me sont chères.
Remerciement
Cette thèse est le fruit d’un travail qui a été réalisé au laboratoire de Physiologie de La
Nutrition et de Sécurité Alimentaire, Université d’Oran1, sous la direction du Professeur
KHEROUA Omar, et dans l’ Unité Biopolymères, Interactions et Assemblages de l’INRA de
Nantes, sous la codirection du Professeur HAERTLE Thomas. Outre le financement assuré
par la DGRSDT, ce travail a bénéficié de l’appui d’un projet de coopération Algéro-Français
PHC-TASSILI.
J’adresse un remerciement particulier à Monsieur le Professeur CHEKROUN
Abdallah, Professeur à l’Université d’Oran1, d’avoir accepté de présider ce jury. Qu’il trouve
ici, mes sincères remerciements et toute mon estime.
Ma profonde reconnaissance va tout d’abord à mon directeur de thèse le
Professeur KHEROUA Omar, pour son encadrement rigoureux et méthodique et les
compétences dont il m’a fait bénéficier tout au long de ma formation. Je lui adresse également
ma gratitude pour son aide précieuse, ses conseils fructueux et son soutien continu et ses
encouragements permanents.
Je tiens à remercier infiniment Monsieur le Professeur HAERLTE Thomas, d’avoir
bien voulu m’accueillir au sein de l’Unité Biopolymères, Interactions et Assemblages de
l’INRA de Nantes. J’ai grandement bénéficié de son immense expérience, de son regard avisé
d’expert, de ses précieux conseils et de son soutien permanent. Qu’il accepte ma profonde
reconnaissance d’avoir accepté de juger ce travail.
Je remercie vivement Monsieur le Professeur KIHAL Mabrouk, Professeur à
l’Université d’Oran1, d’avoir accepté de juger ce travail. Je lui exprime mes sincères
remerciements.
Mes vifs et sincères remerciements vont également à Monsieur le Professeur RIAZI
Ali, Professeur à l’Université de Mostaganem qui a bien voulu accepter d’examiner ce
modeste travail. Qu’il trouve ici, l’expression de toute ma reconnaissance.
Mes profonds remerciements s’adressent à Monsieur le Professeur BENALI
Mohamed, Professeur à l’Université de Sid Bel Abbes d’avoir eu l’amabilité d’accepter de
juger ce travail.
Un remerciement particulier est adressé à Monsieur le Professeur SAIDI Djamel,
Vice Recteur à l’Université d’Oran1, membre à laboratoire de Physiologie de La Nutrition et
de Sécurité Alimentaire pour sa contribution à la relecture et aux corrections du manuscrit.
Ses conseils avisés m’ont toujours été bénéfiques.
Mes remerciements les plus chaleureux et respectueux s’adressent à toute l’équipe
Fonctions et Interactions des Protéines du laboratoire Biopolymères, Interactions et
Assemblages de l’INRA de Nantes, tout particulièrement à Monsieur le Professeur
CHOBERT Jean-Marc pour son accueil au sein de son équipe, pour ces corrections
scrupuleuses de mes travaux scientifiques et ces suggestions toujours avisées. Il m’a permis
de clarifier ma pensée. Mes remerciements vont aussi à CHOISET Yvan, RABESONA
Hanitra, SERVENTON Isabelle, DALGALARRONDO Michèle, pour leurs aides et leurs
soutiens.
Mes vifs remerciement s’adressent à BISCOLA Vanessa, EL-GHAISH Shady, El-
MECHERFI Kamel, NEGAOUI Hanane, HAMMOU Habib, GOURINE Hanane,
GUENDOUZ Malika, ZOUAOUI Saida, REDOUANE Dalal, HADDI Abir, BELALIA
Souhila, BOUDERBALA Hajer, KADDOURI Hanane, MEHEDI Nabila, ADDOU Samia,
YOUCEF Narimene, AINAD TABET Soraya, MEZMAZE Fatseh et KHALED Noaman,
pour leurs soutiens.
Je remercie particulièrement Melle GRAR Hadria, Enseignante chercheur à
l’Université de Mostaganem et membre à laboratoire de Physiologie de La Nutrition et de
Sécurité Alimentaire, pour son aide et son soutient indéfectible.
Mes vifs remerciements s’adressent à TALHI Malika et CHAFI Khadidja, YAZI Leila
Amel pour leurs aides et leurs soutiens.
Mes profonds remerciements s’adressent à l’équipe de laboratoire microbiologie de
l’hôpital d’Oran.
Toute ma reconnaissance va à AMIER Lila, BOUTIBA Nawel et à toute l’équipe de
recherche de Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de la Sécurité Alimentaire
Merci enfin à tous ceux qui m’ont soutenu de prés ou de loin dans la réalisation de
cette thèse.
Ce travail reste essentiellement un aboutissement personnel qui me permet de rester
convaincue qu’il faut faire ce en quoi on croit.
Résumé
Les bactéries lactiques possèdent des atouts technologiques remarquables et sont
largement utilisées dans l’industrie laitière pour leur pouvoir acidifiant, leurs activités
protéolytique et antimicrobienne. Elles sont également utilisées comme agents probiotiques.
Dans ce travail nous avons évalué les propriétés technologiques et étudié l’effet
immunomodulateur des bactéries lactiques isolées à partir du lait de chèvre sur la réponse
allergénique aux lactoprotèines bovines chez la souris Balb/c.
Après identification phénotypique et génotypique des bactéries lactiques, nous avons
étudié les paramètres suivants :
- l’activité fermentaire par la mesure du pH et de l’acidité titrable et dénombrement bactérien
- l’activité protéolytique par le dosage des fonctions α–NH2 libérées, et par électrophorèse (SDS-
PAGE)
- l’activité antimicrobienne vis-à-vis de plusieurs souches pathogènes,
- les propriétés probiotiques par l’étude de la résistance à l’acidité gastrique et aux sels biliaires,
- la sensibilité des souches aux antibiotiques et un test de virulence. .
- l’effet préventif des souches administrées par voie orale chez des souris sensibilisées aux
lactoprotéines bovines. Après sacrifice des souris, un dénombrement bactérien est effectué au
niveau de la muqueuse intestinale et des féces, les taux sériques des IgG, IgE, IgG1 et IgG2a
anti-β-Lg et anti-α–Lac sont déterminés par ELISA. La réponse immune intestinale est évaluée
par mesure en chambre de Ussing, du courant de court circuit (Isc) et la conductance (G) des
muqueuses jéjunales. Une étude histologique est réalisée sur des fragments jéjunaux.
Nos résultats nous ont permis d’identifier cinq souches; Enterococcus faecium1,
Enterococcus faecium2, Enterococcus durans, Lactobacillus brevis et Lactobacillus plantarum.
Elles présentent un bon profil fermentaire associé a une production d’acide lactique et une
croissance bactérienne élévées (p<0,0001). L’évaluation de l’activité protéolytique montre que
les lactobacilles hydrolysent à pH neutre les protéines du lait bovin, cette activité est optimale
pour Lactobacillus brevis à 37 et 45°C et pour Lactobacillus plantarum à 37°C. Le test de l’effet
des inhibiteurs montre que les protéases sont principalement des métallo-, des sérines et des
cytéines protéase. L’activité antimicrobienne chez les entérocoques isolés persiste après
traitement avecla catalase, la lypase et l’α- amylase mais disparait en présence des enzymes
protéolytiques, ce qui indique que les agents actifs sont de nature protéique. Cette activité reste
stable sur une large plage de pH (2-10) et après des traitements thermiques sévéres (100°C
pendant 30min). L’analyse des trois souches Enterococcus a montré la présence des entérocines
A, B, P et 31. Les cinq souches sont sensibles à la plupart des antibiotiques. Elles ont également
montré une résistance aux conditions gastriques.
L’effet préventif a été observé avec les cinq souches lorsqu’elles sont administrées par
voie orale chez des souris sensibilisées à la β-Lg et à l’α–Lac. Cet effet se traduit par une
prédominance de bactéries lactiques dans le jéjunum et les féces, une faible production des IgG,
IgG2a et IgE sériques anti β-Lg et anti α–Lac, une absence d’atrophie des villosités, une
infiltration lymphocytaire très peu marquée. Le test de provocation ex vivo en chambre de
Ussing, sur des muqueuses de souris intubées avec les lactobacilles, montre une diminution de
l’Isc induite par l’antigène sensibilisant.
A la lumière de ces résultats, les cinq souches de bactéries lactiques testées peuvent être
considérées comme des probiotiques, et leurs administration par voie orale peut avoir un effet
préventif contre l’allergie aux protéines du lait de vache.

Mots clés : Lactobacillus, Enterococcus, Protéolyse, Activité antimicrobienne, Chambre de
Ussing, APLV, Balb/c.
Sammary

Lactic acid bacteria are widely used in the dairy industry for their interesting properties,
such as acidifying power, proteolytic and antimicrobial activities. They are also used as
probiotics.

In this work, we have evaluated the technological properties and the immunomodulatory
effect of lactic acid bacteria, isolated from goat milk, on the allergenic response of the whey
fraction of bovine milk protein in Balb / c mice.
After phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria, we studied the following
parameters:
- Fermentation activity by measuring the pH, the titratable acidity and the bacterial counts;
- The proteolytic activity, by dosage of α-NH functions and electrophoresis (SDS-PAGE);
2
- Antimicrobial activity against some pathogenic strains;
- The probiotic properties, by studying the resistance to gastric acidity and bile salts;
- The presence of genes encoding different virulence factors and the profile of antibiotic
resistance of the isolates.
- We evaluated the preventive effect of isolated strains in β-Lg or α-Lac-sensitized mice. After
sacrificing mices, a bacterial count was performed at the intestinal mucosa and faeces, serum
IgG, IgE, IgG1 and IgG2a anti-β-Lg and anti- α-Lac were determined by ELISA. The intestinal
immune response was evaluated in Ussing chamber, by measuring the short circuit current (Isc)
and conductance (G) of jejuna mucosa. A histological study was carried out on jejunal
fragments.

We have identified five strains; Enterococcus faecium1, Enterococcus faecium2,
Enterococcus durans, Lactobacillus brevis and Lactobacillus plantarum. These strains have
good fermentation capability on the evaluated matrix associated with lactic acid production and
intense bacterial growth (P <0.0001).
Isolated lactobacilli were able to hydrolyze cow’s milk proteins at neutral pH.
Proteolysis activity is optimal for L. brevis at 37 and 45 °C and for L. plantarum at 37 °C. The
test of inhibitors shows that proteases are mainly metallo, serine and cyteine-proteases. The
antimicrobial activity of isolated enterococci persisted after treatment with the catalase, lypase
and α- amylase, but disappeared in the presence of proteolytic enzymes, which indicates that the
active agents are from proteic nature. This activity remained stable over a wide pH range (2-10)
and after severe heat treatments (100 ° C for 30 min). The three evaluated Enterococcus strains
were able to produce enterocins A, B, P, and 31. The five strains were sensitive to most
antibiotics. They also showed resistance to gastric conditions.
A preventive effect was observed with the five tested strains, when administered orally in
mice previously sensitized with β-Lg and α-Lac. This effect resulted in, high level of lactic acid
bacteria in intestinal mucosa and faeces, low production of IgG, IgG2a and IgE anti β-Lg and
anti α-Lac, an absence of villous atrophy whose height and a very slightly marked lymphocytic
infiltration. Ex vivo provocation test in Ussing chamber, on mouse mucosal intubated with
lactobacilli showed a decrease in Isc induced by the sensitizing antigen.

In the light of these results, the five lactic acid bacteria strains tested can be considered as
probiotics, and their oral administration may have a preventive effect against allergy to cow's
milk protein.

Keyword : Lactobacillus, Enterococcus, Proteolysis, Antimicrobiale activity, Ussing Chamber,
CMA, Balb/c.
صخلم
نابللأا ةعانص يف عساو قاطن ىلع مدختستو ةظوحلم ةيجولونكت ايازم اهل كيتكلالا ضمح ايريتكب
.كيتويبوربك مدختست نأ اهنكمي .يريتكبلا داضتلاو ينيتوربلا ليلحتلا ،ضامحلإا ىلع ةردقلا اهكلاتملإ
،زعاملا بيلح نم ةلوزعملا كيتكلالا ضمح ايريتكبل ةيجولونكتلا صئاصخلا ةساردب انمق لمعلا اذه يف
.Balb/c نارئف دنع بيلحلا لصم تانيتوربل ةيساسحلل ةباجتسلاا هاجت ةعانملا ليدعت ىلع اهرثأ انسرد امك
:ةيلاتلا سيياقملا ةساردب انمق ،بيلحلا ايريتكبل يثارولاو يرهظملا فيصوتلا ىلع فرعتلا دعب
.يريتكبلا دعلاو ينبللا ضمحلا ةبسنو ةضومحلا ةجرد سايقب يرمختلا طاشنلا -
نلاحرلا ةينقتب ينيتوربلا ككفتلا طاشن ةساردبو ،α-NH فئاظو ريرحت سايقب ينيتوربلا ليلحتلا طاشن -
2
.يئابرهكلا
.ةيضرملا ايريتكبلا هاجت تابوركملا تاداضم طاشن -
.ةيوارفصلا حلاملأاو ةيدعملا ةضومحلل ةمواقملا ةسارد للاخ نم كيتويبوربلا صئاصخ -
)Virulence( ةعوفلا رابتخإو ةيويحلا تاداضملل تلالاسلا ةيساسح -
دعب .بيلحلا لصم تانيتوربل ةسسحملا نارئفلا دنع مفلا قيرط نع ةلمعتسملا تلالاسلل يئاقولا ريثأتلا -
ةداضملا ماسجلأا رادقم ديدحت ،زاربلاو يوعملا طاخملا ىوتسم ىلع يريتكبلا دعلا متي ،نارئفلاب ةيحضتلا
نع α-Lac دضو β–Lg دض ةسسحملا نارئفلا قيرط نع ةجتنملا IgG, IgE, IgG1, IgG2a
ةفرغ ةينقت قيرط نع G وIsc سايقب ةيوعملا ةيعانملا ةباجتسلإا ةسارد .ELISA ةينقت قيرط
.ةيوعم عطاقمل ةيجيسن ةسارد .Ussing
Enterococcus faecium1, Enterococcus faecium تلالاس ةسمخ ىلع فرعتلاب انجئاتن انل تحمس
طاشن مهيدل ، Lactobacillus plantarum و Lactobacillus brevis ،Enterococcus durans ،2
ينيتوربلا طاشنلا نأ جئاتنلا ترهظأ .)p<0.0001) يلاع يريتكب ومنو يضماح جاتنإب بوحصم مهم يرمخت
دنع يلاثم ربتعي طاشنلا اذه كلذك ،ةلدتعم ةضومح ةجرد يف تانيتوربلا ليلحت يف نمكي تايصعلا ىدل يلاثملا
ةجرد دنع Lactobacillus plantarumدنعو م°54و م°73 ةرارح ةجرد يف Lactobacillus brevis
métalo-, sérines et des اساسأ يه ةزرفملا زايتوربلا نأ ىلع لدي تاطبثملا ريثأت رابتخا .م°73 ةرارح
،زلاتكلاب ةجلاعملا دعب رمتسي هنأ نيبي ةلوزعملا تاروكملا دنع ميثارجلل داضملا طاشنلا .cytéines protéase
ةعيبط نم وه طيشنلا رصنعلا نأ ىلع ليلد اذهو ،ةينيتورب تاميزنأ دوجو يف يفتخي هنكل زلايمأ - αو زابيل
ةديدشلا ةيرارحلا ةجلاعملا دعبو )01-2( ةضومح ةجرد يف عساو قاطن ىلع ارقتسم ىقبي طاشنلا اذه .ةينيتوريب
Entérocine A , دوجو Enterococcus ثلاثلا تلالاسلل ينيجلا ليلحتلا جئاتن ترهظأ .)د71 ةدمل م°011(
.ةيدعملا فورظلل ةمواقم ترهظأ امك ،ةيويحلا تاداضملا مظعم هاجت ةيساسح اهل سمخلا تلالاسلا .B, P,31
رثأ اهيدل α-Lac و β–Lg ـــب ةسسحملا نارئفلا دنع عمسلا قيرط نع ةلمعتسم ةسمخلا تلالاسلل نأ ظحول
دجاوت ،زاربلاو يوعملا طاخملا ىوتسم ىلع كيتكلالا ضمح ايريتكبل زكرم دجاوتب مجرتي رثلأا اذه ،يئاقو
راشتنا عم يباغزلا رومضلا بايغ ،α-Lac دضو β–Lg دض IgG, IgE, IgG2a ةداضملا ماسجلأل ليئض
تذخأ يتلا نارئفلا ىدل يطاخملا ءاشغلا ىلع Ussing ةفرغ يف ةيساسحلا ريدقت جئاتن تنّيب .تايوافملل ليئض
.Isc يف ضافخنا تايصعلا
دض يئاقو ريثأت اهل نوكي نأ نكمي امك ،كيتويبوربك ةسمخلا تلالاسلا رابتعا نكمي ،جئاتنلا هذه ءوض يف
.رقبلا بيلح تانيتوربل ةيساسحلا
:ةيحاتفملا تاملكلا
ةيساسح ،Ussing ةفرغ ،يبوركيم دض طاشن ،ينيتورب ليلحت ،Enterococcus ،Lactobacillus
.Balb/c ،رقبلا بيلح تانيتورب
Liste des tableaux et figures
Liste des figures
Figure 1 : Position des acides aminés substitués dans les variants A et B de la β-Lg ....... 05
Figure 2 : Structure 3-D de l’α-lactlbumine ....................................................................... 07
Figure 3: Représentation schématique du mécanisme de l’allergie, l'hypersensibilité de
type I ................................................................................................................................... 08
Figure 4 : Recommandation pour l’évaluation d’un probiotique dans le cadre d’une
utilisation alimentaire ......................................................................................................... 13
Figure 5 : Classification universelle des bactériocines ................................................... 21
Figure 6: Modulation de la réponse adaptative dans l’intestin par le microbiote .............. 23
Figure 7: Le dispositif de la chambre d’Ussing ...................................................................... 52
Figure 8 : Amplification du gène spécifique d’Enterococcus ............................................ 58
Figure 9 : Amplification du gène 16S ADN des souches testées ....................................... 58
Figure 10 : RAPD-PCR des cinq souches d’Enterococcus faecium ................................ 58
Figure 11: Cénitique de production de l’acide lactique au cours de la fermentation du lait de
vache à 45°C par Enterococcus faecium (E15), Enterococcus faecium (E10), Enterococcus
durans (E40), Lactobacillus brevis (Lb)et Lactobacillus plantarum (Lp) et lait stérile sans
ferment (T). ......................................................................................................................... 61
Figure 12: Cinétique de variations du pH au cours de la fermentation de lait de vache à 45°C
par Enterococcus faecium (E15), Enterococcus faecium (E10), Enterococcus durans (E40),
Lactobacillus brevis (Lb)et Lactobacillus plantarum (Lp) et lait stérile sans ferment (T) .
............................................................................................................................................. 62
Figure 13: Cinétique de croissance (Log UFC/mL), après fermentation de lait de vache à 45
°C par Enterococcus faecium 1 (E15), Enterococcus faecium 2 (E10), Enterococcus durans
(E40), Lactobacillus brevis (Lb), Lactobacillus plantarum (Lp), T: lait de vache stérile sans
ferment (témoin). ................................................................................................................. 64
Figure 14: Taux des fonctions α-NH libérées (µM/mg), après fermentation de lait de vache à
2
45 °C par Enterococcus faecium 1 (E15), Enterococcus faecium 2 (E10), Enterococcus
durans (E40), Lactobacillus brevis (Lb), Lactobacillus plantarum (Lp), T : lait de vache
stérile sans ferment (témoin). .............................................................................................. 65
Figure 15 : Electrophorèse SDS-PAGE des hydrolysats issue des bactéries inoculées dans le milieu
lait UHT (37°C/24h, 48h et 72h) ..................................................................................................... 67

Figure 16 : Electrophorèse SDS-PAGE des hydrolysats issue des bactéries inoculées dans Caséinate
de sodium (a) et dans lactosérum dénaturé (b), incubé à 37 °Cpendant 3, 6, 9 et 24h .................... 68
Figure 17: Effet du pH sur l’activité protéolytique chez Lactobacillus brevis et Lactobacillus
plantarum après inoculation dans caséinate de sodium (a) et dans lactosérum dénaturé (b) et
incubation à 37°C pendant 24H ........................................................................................ 70
Figure 18: Effet de la température sur l’activité protéolytique des souches inoculées dans
caséinate de sodium (a) dans lactosérum dénaturé (b) pendant 24H. ................................ 71
Figure 19: Effet des inhibiteurs sur l’activité protéolytique de Lactobacillus brevis et
Lactobacillus plantarum. ................................................................................................... 72
Figure 20 : Inhibition de Listeria ivanovii par Enterococcus............................................. 74
Figure 21 : détection des gènes codant des entérocines ..................................................... 81
Figure 22 : Résistance des bactéries lactiques à pH acide (pH2, pH3) pendant 180 min d’incubation à
37 °C. ............................................................................................................................................... 83
Figure 23 : Résistance des bactéries lactiques aux sels biliaires (0,3%) pendant 240 min d’incubation
à 37 °C. ............................................................................................................................................ 84
Figure 24 : Test de type d’hémolyse des bactéries lactiques isolées sur gélose au sang. .. 86
Figure 25 : Titres en anticorps IgG sériques anti β-Lg mesurés chez les souris colonisées par
les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés au
35ème jour. ............................................................................................................................ 89
Figure 26 : Titres en anticorps IgG sériques anti α-Lac mesurés chez les souris colonisées
par les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés
au 35ème jour. ....................................................................................................................... 90
Figure 27 : Titres en anticorps IgE sériques anti β-Lg mesurés chez les souris colonisées par
les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés au
35ème jour. ............................................................................................................................ 91
Figure 28 : Titres en anticorps IgE sériques anti α-lac mesurés chez les souris colonisées par
les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés au
35ème jour. ............................................................................................................................ 92
Figure 29 : Titres en anticorps IgG1 sériques anti β-Lg mesurés chez les souris colonisées
par les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés
au 35ème jour. ....................................................................................................................... 94
Figure 30 : Titres en anticorps IgG2a sériques anti β-Lg mesurés chez les souris colonisées
par les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés
au 35ème jour. ....................................................................................................................... 95
Figure 31 : Titres en anticorps IgG1 sériques anti α-Lac mesurés chez les souris colonisées
par les différentes souches bactériennes, les souris témoins négatif et positif (n=10) sacrifiés
au 35ème jour. ....................................................................................................................... 96