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129 Pages·2016·30.92 MB·English
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N°:    2009  ENAM  XXXX       UNIVERSITÉ PARIS-EST T H È S E Pour obtenir le grade de docteur délivré par Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Pathologie et recherche clinique présentée et soutenue pu bliquement par Fang FANG Le 15 Avril 2016   Susceptibility to acaricides and genetic diversity of     Sarcoptes scabiei from animals             Directeur de thèse : Pr Jacques GUILLOT   Unité de Pa  rasitologie, Mycologie, Dermatologie, Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, Maisons-Alfort, France   EA 7380 Dynamyc, Faculté de Médecine, Créteil, France Jury M. Pascal DELAUNAY, MCU-PH, Faculté de Médecine de Nice, France Rapporteur M. Michel FRANC, Professeur, Parasitologie, Ecole nationale vétérinaire de Toulouse, France Rapporteur Mme Weiyi HUANG, Professeur, Faculté vétérinaire, Université du Guangxi, Chine Examinateur Mme Françoise BOTTEREL, Professeur, Equipe Dynamyc, Paris-Est Créteil, France Examinateur Mme Lénaïg HALOS, Docteur vétérinaire, Merial, Lyon, France Examinateur M. Olivier CHOSIDOW, Professeur, Dermatologie, Hôpital Henri Mondor, Créteil, France Examinateur M. Rémy DURAND, MCU-PH, Parasitologie, Hôpital Avicenne, Bobigny, France Examinateur 1   Acknowledgements     On  the  occasion  of  the  completion  of  my  dissertation  and  subsequent  PhD,  I  would   like  to  appreciate,  first  and  foremost,  my  director  Professor  Jacques  Guillot.  It  has  been  an   honor  to  be  his  PhD  student.  Jacques  is  someone  who  is  nice  and  cheerful,  who  is  always   optimistic  and  work  productively.  I  have  learned  a  lot  from  him  under  the  influence  of  his   good  characters  during  the  whole  period  of  my  PhD  study.  I  really  appreciate  all  his   contributions  of  time,  ideas,  and  funding  for  my  PhD.     I  am  grateful  to  the  China  Scholarship  Council,  which  provided  a  PhD  grant  for  me  and   gave  me  the  opportunity  to  study  in  France.   I  am  particularly  thankful  to  the  jury  members  of  my  thesis:  Dr  Pascal  Delaunay  and  Pr   Michel  Franc  who  spent  time  to  review  my  thesis,  and  Pr  Weiyi  Huang,  Pr  Françoise   Botterel,  Dr  Lénaïg  Halos,  Pr  Olivier  Chosidow  and  Dr  Rémy  Durand  who  kindly  accepted   to  be  members  of  the  PhD  jury.   Special  thanks  to  Dr  Sarah  Bonnet  from  BIPAR,  who  participated  to  my  “Comité  de   pilotage”  and  gave  good  suggestions  on  my  PhD  project.     I  would  like  to  thank  every  members  of  the  research  team  Dynamyc:  Elise  Melloul,   Charlotte  Bernigaud,  Stéphanie  Luigi,  Françoise  Botterel,  Françoise  Foulet,  Veronica  Risco,   Pascal  Arné,  René  Chermette.  I  would  like  to  express  my  deeply  gratitude  to  Charlotte  and   Elise,  two  other  PhD  students,  who  helped  me  a  lot.  We  worked  and  travelled  together,   had  lots  of  fun.  Thanks  to  them,  my  PhD  life  has  been  cheerful  and  colorful.   I  would  like  to  thank  the  teachers  of  Parasitology  group  in  EnvA.  To  Jacques  Guillot,   Bruno  Polack,  René  Chermette  and  Radu  Blaga,  for  their  excellent  classes  in  veterinary   Parasitology.  To  Odile  Crosaz  who  is  always  nice  and  ready  to  answer  my  questions  with   patience.  To  Radia  Guechi  who  helped  me  in  experiment  preparation. 2   Thanks  to  the  members  of  the  Parasitology  department  of  Avicenne  Hospital:  Dr   Arezki  Izri  who  provided  some  essential  oils  and  products,  Candy  Kerdalidec  who  helped   me  with  in  vitro  tests,  Rémy  Durand  and  Valérie  Andriantsoanirina  who  were  in  charge  of   the  molecular  analysis.   Thanks   to   Thomas   Lilin   and   Francis   Moreau   from   the   Centre   de   Recherche   Biomédicale.     I  really  appreciate  my  families  and  friends.  Words  cannot  express  how  grateful  I  am  to   my  mom  and  dad  for  all  their  love  and  support  on  me.  Million  thanks  to  all  my  friends,   without  them,  my  life  won’t  have  been  so  happy.  My  appreciation  especially  goes  to  my   dear  boyfriend,  who  is  ready  to  encourage  me  no  matter  day  or  night.  His  unconditional   love  and  support  has  enlightened  me  not  only  through  PhD,  but  also  through  life.     Last  but  not  the  least,  I  would  like  to  express  my  deepest  gratitude  to  the  French   people,  who  have  always  attached  great  importance  to  protecting  their  heritages  and   cultures  as  well  as  those  around  the  world.  Thanks  to  their  effort  and  persistent  love  for   art,  I  was  able  to  admire  the  fabulous  museums,  the  splendid  castles  and  all  wonderful   arts  around  the  world.  Here  I  would  like  to  quote  the  words  of  Hemingway  to  express  my   affection  of  the  life  in  Paris:  If  you  are  lucky  enough  to  have  lived  in  Paris  as  a  young  man,   then  wherever  you  go  for  the  rest  of  your  life,  it  stays  with  you,  for  Paris  is  a  moveable   feast. 3     TABLE  OF  CONTENTS     Acknowledgements........................................................................................................1   Table  of  contents...........................................................................................................3   Abstract.........................................................................................................................5   Résumé..........................................................................................................................6     I.  Background  and  outline  of  the  thesis   ........................................................................7   1.  Sarcoptes  scabiei...........................................................................................................8   1.1.  Classification...........................................................................................................8           1.2.  Morphology............................................................................................................9   1.3.  Life  cycle...............................................................................................................11   1.4.  Survival  capacities  and  modes  of  transmission   ..................................................13   1.5.  Variability  and  host  specificity .............................................................................14   1.5.1  Morphological  variability..............................................................................14   1.5.2.  Population  genetics  of  Sarcoptes  scabiei....................................................15   1.5.3.Host  specificity  and  cross-­‐infectivity............................................................23   2.  Infection  by  Sarcoptes  scabiei  in  animals....................................................................26   2.1.  Distribution..........................................................................................................29   2.2.  Clinical  features....................................................................................................30   2.3.  Diagnosis  in  animals.............................................................................................37   2.4.  Animal  models......................................................................................................39   3.  Infection  by  Sarcoptes  scabiei  in  humans...................................................................41   4.  Control.........................................................................................................................47   4.1.  Acaricides.............................................................................................................47   4.2.  Current  treatments  in  animals.............................................................................52   4.3.  Current  treatments  in  humans.............................................................................53   4.4.  Drug  resistance   ...................................................................................................55   5.  Outline  of  the  thesis....................................................................................................56     II.  Evaluation  of  afoxolaner  for  the  treatment  of  Sarcoptes  scabiei  infection  in  pigs......57   1.  Introduction................................................................................................................58   2.  Materials  and  Methods...............................................................................................59   2.1.  Experimental  pig  model.......................................................................................59   2.2.  Study  design.........................................................................................................60   2.3.  Clinical  monitoring...............................................................................................61   2.4.  Afoxolaner  and  ivermectin  pharmacokinetics......................................................63   2.5.  Statistical  Analysis   ..............................................................................................64 4   3.  Results   .......................................................................................................................65   3.1.  Experimental  pig  model.......................................................................................65   3.2.  Clinical  outcomes   ...............................................................................................66   4.  Discussion   ..................................................................................................................71     III.  In  vitro  evaluation  of  acaricides,  repellents  and  essential  oils  for  the  control  of   Sarcoptes  scabiei................................................................................................................75   1.  Introduction................................................................................................................76   2.  Materials  and  Methods...............................................................................................78   2.1  Sarcoptes  mites.....................................................................................................78   2.2  Solutions  preparation  and  bioassays  of  ivermectin  and  moxidectin ....................78   2.3  Products  and  bioassays  for  environmental  control...............................................78   2.4  Essential  oils  and  bioassays...................................................................................80   2.5  Statistical  analyses................................................................................................81   3.  Results   .......................................................................................................................81   3.1  In  vitro  evaluation  of  ivermectin  and  moxidectin  efficacy..................................81   3.2  Evaluation  of  products  for  environmental  control  of  S.  scabiei..........................82   3.3  In  vitro  evaluation  of  essential  oils......................................................................84   4.  Discussion   ..................................................................................................................86     IV.  Characterization  of  the  genetic  diversity  of  Sarcoptes  scabiei  from  animals.............91   1.  Introduction................................................................................................................92   2.  Materials  and  Methods...............................................................................................93   2.1  Collection  of  S.  scabiei  mites   ...............................................................................93   2.2  DNA  extraction  and  gene  amplification   ..............................................................96   2.3  Sequence  and  phylogenetic  analyses   ..................................................................96   3.  Results   .......................................................................................................................97   4.  Discussion   ................................................................................................................100   V.  Conclusion  and  perspectives .......................................................................................103     References........................................................................................................................108     Annexes............................................................................................................................124 5   Abstract   Sarcoptes  scabiei  is  an  ectoparasite  responsible  for  the  emerging/re-­‐emerging  disease  called   scabies  in  humans  or  mange  in  animals.  It  was  reported  in  104  species  across  27  families  of   domestic  and  wild  animals.  Current  treatments  for  scabies/mange  are  limited  and  there  are  no   efficient  products  for  the  environment  control  of  S.  scabiei.  Moreover,  the  taxonomic  status  of  S.   scabiei  is  still  under  controversy  and  the  question  remains  that  whether  it  represents  a  single   species  or  several  taxa.     The  objectives  of  the  thesis  were  to  assess  the  susceptibility  to  acaricides  and  analyse  the   genetic  diversity  of  S.  scabiei  from  animals.  In  the  first  part  of  the  thesis,  an  animal  model  was   used  to  evaluate  the  efficacy  of  afoxolaner,  a  new  acaricide  from  the  isoaxazoline  family.  The   primary  outcome  of  efficacy  was  based  on  the  reduction  in  the  number  of  live  mites  counted  in   skin  scrapings  following  treatment.  At  day  8,  four  afoxolaner-­‐treated  pigs  (out  of  four)  were   mite-­‐free,  while  mites  were  still  found  in  three  (out  of  three)  ivermectin-­‐treated  pigs.  All  treated   pigs  were  cured  at  the  end  of  the  study  (day  35)  and  all  pigs  in  the  control  group  remained   infected.  Secondary  outcomes  included  measures  on  the  reduction  of  skin  lesions  and  pruritus.   The  clinical  lesions  of  scabies  infection  were  allowed  to  disappear  completely  for  all  the  pigs  in  the   afoxolaner  group  but  not  in  the  ivermectin  group  at  14  days  after  the  treatment.  An  increase  of   the  pruritus  was  observed  right  after  treatment,  followed  by  a  decrease  of  the  pruritus  score  in   both  treated  groups.  The  second  part  of  the  thesis  was  to  evaluate  the  scabicidal  effect  of   molecules  or  products  using  an  in  vitro  test.  A  gradient  of  concentrations  of  ivermectin  and   moxidectin  as  well  as  11  essential  oils  have  been  evaluated  in  vitro  against  S.  scabiei.  After  24h  of   exposure  to  ivermectin  and  moxidectin,  the  median  lethal  concentrations  were  150.2±31.4  µg/mL   and  608.3±88.0  µg/mL,  respectively.  Doses  of  ivermectin  under  1  ng/mL  and  moxidectin  under  10   ng/mL   showed   no   scabicidal   effect.   Fumigation   and   contact   bioassays   were   used   for   the   assessment   of   essential   oils   efficacy.   Among   Lavandula   augustifolia,   Melaleuca   altenifolia,   Pelargonium  asperum,  Eucalyptus  radiate,  Leptospermum  scoparium,  Cryptomeria  japonica,  Citrus   aurantium  ssp  amara  and  3  other  unknown  oils  (BOB4,  BOB5,  BOB9)  tested  with  the  contact   bioassay,  the  essential  oil  identified  as  BOB4  demonstrated  the  best  scabicidal  effect  (1%  solution   killed  all  the  mites  in  20  min).  Among  the  10  essential  oils  listed  before  plus  Juniperus  oxycedrus   with  the  fumigation  bioassay,  the  oil  Melaleuca  altenifolia  demonstrated  the  best  scabicidal  effect   (all  the  mites  died  in  only  4  min).  For  environmental  control  of  S.  scabiei,  the  efficacy  of  biocides   or  repellents  was  assessed.  The  median  survival  time  was  calculated  for  permethrin  (4%  and  0.6%),   esdepallethrin   and   bioresmethrin,   bifenthrin,   cypermethrin   and   imiprothrin,   cyfluthrin,   tetramethrin  and  sumithrin,  DEET  (25%  and  50%),  icaridin  and  IR3535.  The  third  part  of  the  thesis   included  the  study  of  the  genetic  diversity  of  populations  of  S.  scabiei  from  animals.  A  part  of  cox1   was  used  for  phylogenetic  analyses.  The  results  showed  that  Sarcoptes  mites  from  dogs  seem  to   derive  from  humans.     Key  words:  Sarcoptes  scabiei,  acaricides,  animal  model,  in  vitro  test,  genetic  diversity. 6   Résumé   Sarcoptes  scabiei  est  un  acarien  ectoparasite  obligatoire.  Sa  présence  dans  la  couche  cornée   de  l’épiderme  est  à  l’origine  d’une  gale  dite  sarcoptique.  Cette  ectoparasitose  a  été  décrite  chez   104  espèces  de  mammifères  représentant  27  familles  distinctes.  Les  traitements  actuels  de  la  gale   sarcoptique   ne   sont   pas   toujours   satisfaisants   et   il   n’existe   pas   de   produits   qui   permettent   d’éliminer  S.  scabiei  dans  l’environnement.  Par  ailleurs,  la  diversité  génétique  de  S.  scabiei  n’est   pas  clairement  définie  et  l’unicité  de  l’espèce  fait  toujours  l’objet  de  controverses.     L’objectif  de  cette  thèse  a  été  d’évaluer  l’efficacité  d’acaricides  vis-­‐à-­‐vis  de  S.  scabiei  en   utilisant  un  modèle  animal  ou  par  le  biais  de  tests  in  vitro.  La  diversité  génétique  d’isolats  d’origine   animale  a  également  été  étudiée.  La  première  partie  du  travail  de  thèse  a  concerné  un  essai   thérapeutique     L’efficacité   d’une   administration   orale   unique   d’afoxolaner,   une   molécule   du   groupe  des  isoaxazolines,  a  été  évaluée  sur  des  porcs  expérimentalement  infestés.  Le  critère   principal  d’évaluation  a  été  la  réduction  du  nombre  de  sarcoptes  mis  en  évidence  dans  les  raclages   cutanés.  Huit  jours  après  le  traitement,  aucun  sarcopte  n’a  été  détecté  sur  les  4  porcs  ayant  reçu   l’afoxolaner  alors  que  des  sarcoptes  étaient  toujours  présents  sur  les  3  porcs  ayant  reçu  de   l’ivermectine.  Tous  les  porcs  traités  étaient  guéris  à  la  fin  de  l’essai  (J35)  alors  que  les  animaux  non   traités   sont   demeurés   infestés.   Les   autres   critères   d’évaluation   étaient   l’évolution   du   score   clinique  et  de  prurit.  Les  lésions  cutanées  ont  rapidement  régressé  dans  le  groupe  traité  par   l’afoxolaner  alors  qu’elles  étaient  encore  présentes  à  J14  dans  le  groupe  traité  avec  l’ivermectine.   La  deuxième  partie  du  travail  de  thèse  a  porté  sur  l’évaluation  in  vitro  de  différentes  molécules  ou   produits  acaricides.  Plusieurs  concentrations  d’une  solution  d’ivermectin  ou  de  moxidectine  ainsi   11  huiles  essentielles  ont  été  testées.  Après  24h  de  contact  avec  l’ivermectine  et  la  moxidectine,  la   dose   létale   50%   étaient   de   150,2±31,4   µg/mL   et   608,3±88,0   µg/mL,   respectivement.   Une   concentration  inférieure  à  1  ng/mL  (pour  l’ivermectine)  ou  à  10  ng/mL  (pour  la  moxidectine)  n’a   aucune  activité  acaricide.  Pour  les  huiles  essentielles,  des  tests  par  fumigation  et  par  immersion   ont   été   réalisés.   Parmi   Lavandula   augustifolia,   Melaleuca   altenifolia,   Pelargonium   asperum,   Eucalyptus  radiate,  Leptospermum  scoparium,  Cryptomeria  japonica,  Citrus  aurantium  ssp  amara   et  3  l’huile  essentielle  identifiée  (BOB4,  BOB5,  BOB9)  testés  par  immersion,  l’huile  essentielle   identifiée  BOB4  s’est  révélée  la  plus  efficace  (une  solution  à  1%  tue  tous  les  acariens  en  20  min).   Parmi  les  10  huiles  essentielles  énumérées  avant,  plus  Juniperus  oxycedrus  testés  par  immersion,   l’huile  essentielle  de  Melaleuca  altenifolia  s’est  révélée  la  plus  efficace  (tous  les  acariens  sont   morts  en  4  min).  Pour  le  contrôle  de  S.  scabiei  dans  l’environnement,  différents  biocides  ou   répulsifs   ont   été   examinés.   La   durée   moyenne   de   survie   a   été   calculée   pour   les   produits   comportant  de  la  perméthrine,  de  l’esdépallethrine  et  de  la  bioresmethrine,  de  la  bifenthrine,  de   la  cyperméthrine  et  de  l’imiprothrine,  de  la  cyfluthrine,  de  la  tétramethrine  et  de  la  sumithrine,  du   DEET,  de  l’icaridine  et  le  produit  IR3535.  La  deuxième  partie  du  travail  de  thèse  a  porté  sur  la   diversité  génétique  d’isolats  de  S.  scabiei  provenant  d’animaux.  Une  partie  du  gène  cox1  a  été   amplifiée.  L’analyse  des  séquences  ainsi  obtenues  semble  montrer  que  les  sarcoptes  circulant   chez  le  Chien  sont  issus  de  population  de  sarcoptes  d’origine  humaine.     Mots  clés  :  Sarcoptes  scabiei,  acaricides,  modèle  animal,  tests  in  vitro,  diversité  génétique. I.  Background   7               I.  Background  and  outline  of  the  thesis I.  Background   8     1.  Sarcoptes  scabiei     1.1 Classification       Sarcoptes   scabiei   is   an   arthropod,   subphylum   Chelicerata,   class   Arachnida,   order   Acarina,  suborder  Astigmata  (Sarcoptiformes)  and  family  Sarcoptidae  (figure  1).         The  word  arthropod  comes  from  the  Greek  words  arthro  that  means  joint  and  podos   that  means  foot.  Arthropods  are  characterized  by  their  jointed  limbs  and  cuticle  made  of   chitin,  often  mineralized  with  calcium  carbonate.  The  Phylum  Arthropoda  includes  the   insects,  myriapods,  crustaceans,  chelicerates  and  trilobites.  There  are  around  1.3  million   different  kinds  arthropods  that  have  been  found,  which  is  the  most  numerous  phylum  of   all  living  organisms  (Averof  and  Akam,  1995;  Mangowi,  2014).  Arachnida  are  a  class  of   arthropods  with  8  legs.  The  order  Acarina  (or  Acari),  including  mites  and  ticks,  contains   numerous  economically  and  medically  important  species  that  are  parasitic  for  humans,   domestic  or  wild  animals,  and  crops,  food,  etc.  The  sub-­‐order  Astigmata  is  a  large  group   of   relatively   slow   moving,   similar   mites   with   thinly   sclerotized   integument   and   no   detectable   spiracles   or   tracheal   system.   The   families   Sarcoptidae,   Psoroptidae   and   Cnemidocoptidae  are  of  major  veterinary  importance.  Sarcoptidae  are  characterized  by   short   legs   and   short   capitulum.   Psoroptidae   are   characterized   by   long   legs   and   long   capitulum;   the   size   of   these   parasites   is   relatively   bigger   than   that   of   Sarcoptidae.   Cnemidocoptidae  (or  Knemidocoptidae)  are  parasites  of  birds.  The  family  Sarcoptidae   includes  three  genera:  Sarcoptes,  Notoedres  and  Trixacarus.  All  of  them  are  parasites  in   mammals  (Mehlhorn  and  Armstrong,  2001;  Taylor  et  al.,  2007). I.  Background   9       Figure  1.  Simplified  classification  of  mites  of  veterinary  importance   1.2  Morphology       Sarcoptes  scabiei  has  a  characteristic  oval,  ventrally  flattened  and  dorsally  convex,   tortoise-­‐like  body.  The  most  striking  parts  of  the  ventral  surface  are  the  chitinous  bars   (called  epimeres),  which  strengthen  the  places  where  forelegs  and  hindlegs  are  inserted  in   the  body.  On  the  dorsal  surface  of  the  mite,  there  are  transversely  arranged  thorns  and  10   pairs  of  spines  arranged  on  two  sides,  3  pairs  on  the  anterior  part  and  7  pairs  on  the   posterior  part  of  the  dorsal  surface.  The  female  is  300  to  500  µm  long  by  230-­‐420  µm   wide,  and  the  male  is  210  to  285  µm  long  by  160-­‐210  µm  wide,  around  two-­‐thirds  the  size   of  the  female.  Larvae  have  six  legs,  nymphs  and  adults  have  eight  legs,  with  suckers   present  on  legs  1  and  2  in  both  sexes  and  leg  4  only  in  male  (figures  2  &  3).  The  anus  is   terminal  in  both  sexes.  The  eggs  are  oval,  whitish  and  glossy,  with  slightly  tapering  at  the   pole  lying  anteriorly  in  the  female  mite,  and  this  pole  is  attached  to  the  floor  of  the   burrow  by  means  of  sticky  substance,  which  may  fasten  the  egg  to  the  burrow  securely.   The   dimensions   of   the   eggs   are   167-­‐175  µm   by   88-­‐97  µm,   and   increase   during   development  (figure  4)  (Heilesen,  1946).

Description:
Macrocyclic Lactones. Macrocyclic lactones (MLs) are a large family of broad-‐spectrum antiparasitic drugs .. member of the macrocyclic lactones, is the only oral drug available for scabies. The drug must be With the trend of “green” consumerism, an increasing importance has been attached to
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