Peptides antimicrobiens des entérobactéries Antimicrobial peptides

169 Pages·2007·3.55 MB·French

Peptides antimicrobiens des entérobactériesEtude de la
voie de maturation et du mécanisme d’import de la
microcine J25, peptide antimicrobien inhibiteur de
l’ARN polymérase
Sophie Duquesne
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Sophie Duquesne. Peptides antimicrobiens des entérobactériesEtude de la voie de maturation et du
mécanisme d’import de la microcine J25, peptide antimicrobien inhibiteur de l’ARN polymérase.
Biochimie [q-bio.BM]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007. Français. ￿NNT: ￿. ￿tel-
00193192￿
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS 6
Spécialité Biochimie

Présentée par Sophie DUQUESNE

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS 6

Peptides antimicrobiens des entérobactéries

Etude de la voie de maturation et du mécanisme d’import de la microcine J25,

peptide antimicrobien inhibiteur de l’ARN polymérase

Antimicrobial peptides from enterobacteria

M aturation process of the antibacterial RNA polymerase inhibitor microcin J25,

and study of its bacterial uptake mechanism

Soutenue le 14 mai 2007, devant le jury composé de :

Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
Jean-Michel Camadro
(Institut Jacques Monod, Paris)
Professeur Rapporteur
Jean-Marie Frère
(Institut de Chimie, Liège, Belgique)
Professeur Examinateur
Solange Lavielle
(Université Paris VI)
Professeur Examinateur
Mohamed Marahiel
(Philipps Universität, Marburg, Allemagne)
Président du Muséum National d'Histoire Examinateur
André Ménez
Naturelle, Paris (Président)
Chargée de recherche CNRS Directeur de thèse
Delphine Destoumieux-Garzόn
(Ifremer, Montpellier)
Professeur Directeur de thèse
Sylvie Rebuffat
(Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris)

A mes grands-parents et à mes parents,
A Julie,
A mon amour Jean,
A tous ceux qui m’ont épaulée ces dernières années.

Remerciements

Cette étude a été effectuée dans l’Unité de Chimie et Biochimie des Substances
Naturelles du Muséum National d’Histoire Naturelle, UMR 5154 CNRS-MNHN, dirigée par
Monsieur le Professeur Bernard Bodo. Je tiens à lui adresser mes sincères remerciements
pour m’avoir permis de réaliser ces travaux au sein de son unité.

Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur Jean Michel Camadro, Directeur de
Recherche au CNRS (Laboratoire d’Ingénierie des Protéines et Contrôle Métabolique,
Institut Jacques Monod, Paris) et Monsieur Jean Marie Frère, Professeur (Institut de
Chimie, Université de Liège, Belgique) de m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail et d’en
être les rapporteurs. Je remercie de même Madame Solange Lavielle, Professeur
(Laboratoire de Synthèse, Structure et Fonction de Molécules Bioactives, Université Paris
VI), et Messieurs Mohamed Marahiel, Professeur (Laboratoire de Chimie et Biochimie,
Philipps Universität, Marburg, Allemagne) et André Menez, Président du Muséum National
d’Histoire Naturelle (Paris), d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse.

Je tiens à remercier tout particulièrement ma directrice de thèse, Madame Sylvie
Rebuffat, Professeur au MNHN dans l’Unité de Chimie et Biochimie des Substances
Naturelles, pour les discussions scientifiques que nous avons pu avoir, son encadrement et sa
franchise. Je lui exprime ici toute ma reconnaissance pour m’avoir permis de réaliser ce
travail de thèse et pour m’avoir soutenue tout au long de ce travail.

Je tiens à remercier très vivement Madame Delphine Destoumieux-Garzón pour
avoir confirmé mon goût pour la recherche, grâce à son encadrement patient et son
optimisme quotidien. Je lui suis très reconnaissante pour tout l’intérêt qu’elle a continué à me
porter malgré son départ de l’Unité, et toutes les connaissances théoriques et pratiques
qu’elle m’a transmises. Je souhaite aussi remercier Monsieur Jean Péduzzi pour son soutien
dans les moments difficiles, sa sincérité, ainsi que pour m’avoir fait part de sa grande
expérience dans le domaine de la biochimie.
Je remercie sincèrement Mademoiselle Séverine Zirah, pour sa grande contribution à
ces travaux de recherche, et notamment aux expériences de spectrométrie de masse, pour sa
confiance et ses conseils scientifiques et personnels précieux.

Je tiens à exprimer mes remerciements à Messieurs Lionel Dubost et Arul Marie pour
la réalisation des spectres de masse. Mes plus vifs remerciements s’adressent cependant à
Monsieur Christophe Goulard pour son aide journalière et surtout efficace, ainsi qu’à
Monsieur Gérard Gastine et Mademoiselle Manon Vandervennet pour leur aide très
appréciée à la préparation des milieux bactériologiques, ainsi que pour le partage de leur
joie de vivre dans des moments parfois délicats.

Mes remerciements vont également à toutes les personnes avec lesquelles j’ai eu la
chance de pouvoir collaborer au cours de cette étude, et en particulier Mesdames Lucienne
Letellier et Pascale Boulanger pour m’avoir accueillie au Laboratoire de Transport
Membranaire de Macromolécules de l’Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et
Cellulaire (IBBMC, UMR 9619 CNRS, Orsay) et m’avoir ainsi permis de réaliser les
expériences de chromatographie d’exclusion en présence de radioactivité, ainsi que Monsieur
Michel Desmadril et Madame Magali Niçaise, du Laboratoire de Modélisation et
d’Ingénierie des Protéines (IBBMC, UMR 9619 CNRS, Orsay) pour avoir dirigé les
expériences de microcalorimétrie et Madame Geneviève Auger, du laboratoire Enveloppes
Bactériennes et Antibiotiques (IBBMC, UMR 9619 CNRS, Orsay) pour la réalisation des
composition en acides aminés en présence de radioactivité. Je souhaite aussi remercier
Messieurs Jean-Claude Tabet, du Laboratoire de Chimie Structurale Organique et
Biologique (UMR 7613, Université Paris VI), Jean Michel Camadro, du Laboratoire
d’Ingénierie des Protéines et Contrôle Métabolique (Institut Jacques Monod, Paris) et
Michael C. Marden de l’Unité INSERM U779 du Kremlin-Bicêtre, pour les accès respectifs
au spectromètre de masse à trappe d’ion, à la plateforme de spectrométrie de masse, et au
spectropolarimètre de dichroïsme circulaire. Je remercie aussi Monsieur Philippe Grellier et
Madame Nathalie Dogna, du Laboratoire de Biologie Fonctionnelle des Protozoaires (USM
0504, Muséum National d’Histoire Naturelle), pour avoir supervisé la production d’anticorps
chez la souris. Enfin, je remercie Mohamed Marahiel, du Laboratoire de Chimie et
Biochimie (Philipps Universität, Marburg, Allemagne) pour m’avoir accueillie dans son
laboratoire dans le cadre du projet PROCOPE.

Enfin, je tiens à remercier très vivement tous les membres de l’Unité pour leur bonne
humeur et en particulier Mesdames Catherine Pougault, Christelle Edmond, sans qui rien
n’aurait pu se faire, ainsi que Mesdames Gaelle Vassiliadis, Fabienne François-Vadrot,
Vanessa Petit, Julie N’Guyen-Pouplin, Séverine Amand et Christine Bailly, et encore
Messieurs Bastien Nay, Laurent Evanno et Alexandre Deville pour leur grand sens de
l’humour et leur soutien. C’est grâce à eux tous que ce travail a été non seulement une
véritable expérience professionnelle mais aussi une merveilleuse expérience humaine.
Sommaire

INTRODUCTION ....................................................................................................1

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES: LES MICROCINES.....................................9
I. Les Microcines : peptides antibactériens des entérobacteries synthétisés
selon la voie ribosomique.................................................Erreur ! Signet non défini.

Publication n°1 : Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from
enterobacteria....................................................................Erreur ! Signet non défini.

II. Les microcines E492, J25 et C7/C51 : diversités structurelle et fonctionnelle
des microcines.........................................................................................................38

Publication n°2: Structural and functional diversity of microcins, gene-encoded
antibacterial peptides from enterobacteria............................................................39

MATERIELS ET METHODES.............................................................................49
I. Souches bactériennes, plasmides et milieux.................................................49
I.1. Souches bactériennes et plasmides..............................................................................................49
I.2. Milieux de culture........................................................................................................................53

II. Clonage et transformation..............................................................................56
II.1. Purification et dosage d’ADN....................................................................................................56
II.2. Obtention d’inserts d’ADN........................................................................................................56
II.3. Réactions enzymatiques.............................................................................................................58
II.4. Transformation...........................................................................................................................60
II.5. Séquençage.................................................................................................................................60

III. Production et purification de peptides et protéines.......................................60
III.1. Microcine J25 intacte et clivée à la thermolysine.....................................................................60
III.2. McjA, précurseur de MccJ25....................................................................................................62
III.3. McjB et McjC, enzymes de maturation de MccJ25..................................................................66
III.4. FhuA, récepteurs aux sidérophores...........................................................................................67

IV. Caractérisation des peptides et protéines.................Erreur ! Signet non défini.
IV.1. Dosage de solutions de peptides et protéines............................................................................68
IV.2. Electrophorèse sur gel d’acrylamide SDS................................................................................69
IV.3. Western Blot.............................................................................................................................70
IV.4. Digestion à la trypsine..............................................................................................................70
IV.5. Spectrométrie de masse............................................................................................................71
IV.6. Dichroïsme circulaire................................................................................................................73

V. Anticorps polyclonaux anti-[His -McjB] et anti-[His -McjC]......................74
6 6
VI. Mise en évidence d’interactions moléculaires...............................................74
VI.1. Chromatographie d’exclusion...................................................................................................75
VI.2. Microcalorimétrie.....................................................................................................................75

VII. Analyse fonctionnelle des peptides et protéines ............................................77
VII.1. Activité antimicrobienne.........................................................................................................77
VII.2. Activité enzymatique de McjB et McjC..................................................................................77
VII.3. Test antiviraux sur phage T5...................................................................................................78

CHAPITRE I : MECANISME D’IMPORT DE MCCJ25 DANS LES
BACTERIES ..........................................................................................................80
I. Publication n°3: The iron-siderophore transporter FhuA is the receptor for
the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11-Pro16 beta-
hairpin region in the recognition mechanism.......................................................82

II. Synthèse des résultats.....................................................................................90

CHAPITRE II : ETUDE DE LA VOIE DE MATURATION DE MCCJ25........92
I. Publication n°4: Two enzymes catalyze the maturation of a lasso peptide in
Escherichia coli.......................................................................................................94

II. Synthèse des résultats...............................................Erreur ! Signet non défini.

III. Résultats complémentaires.......................................Erreur ! Signet non défini.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...............................................................110

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.............................................................124
Liste des Abréviations

ACN Acétonitrile
ADN Acide déoxyribonucléique
ADNase Désoxyribonucléase
AmpR Résistant à l’ampicilline
ARN Acide ribonucléique
ARNase ribonucléase
ATP Adénosine triphosphate
BCIP Bromochlorylindolophosphate
BET Bromure d’éthidium
Bq Becquerel
BSA Sérum albumine bovine
cfu “Colony forming unit”, unité formant colonie
CMB Concentration minimale bactéricide
CMI Concentration minimale inhibitrice
ChlR Résistant au chloramphénicol
cpm Coups par minute
Da Dalton
DC Dichroïsme circulaire
dNTP 2'-déoxynucléoside 5'-triphosphate
DO Densité optique
DSC “Differential scanning calorimetry”, calorimétrie différentielle à balayage
DTT Dithiothréitol
EDTA Acide éthylènediamine tétraacétique
ESI-QTOF “Electrospray ionisation-quadripole-time of flight”, ionisation par
électronébulisation, avec analyseur quadripole-temps de vol
FA Acide formique
FPLC “Fast performance liquid chromatography”, chromatographie liquide à
performance rapide
GST Gluthatione-S-Transférase
HPLC “High performance liquid chromatography”, chromatographie liquide à haute
performance
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside