Pedro Alejandro Sánchez Murcia

309 Pages·2013·12.13 MB·English

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Química Orgánica I

INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA COMO DIANA
TERAPÉUTICA EN LA TRANSCRIPTASA INTERNA DEL
VIH-1 Y EN LA TRIPANOTIÓN REDUCTASA DE
LEISHMANIA INFANTUM

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Pedro Alejandro Sánchez Murcia

Bajo la dirección de las doctoras

María José Camarasa
Sonsoles Velázquez

Madrid, 2013

© Pedro Alejandro Sánchez Murcia, 2013
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Química Orgánica I

Tesis Doctoral

INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA COMO
DIANA TERAPÉUTICA EN LA TRANSCRIPTASA
INVERSA DEL VIH-1 Y EN LA TRIPANOTIÓN
REDUCTASA DE LEISHMANIA INFANTUM

Pedro Alejandro Sánchez Murcia

Instituto de Química Médica (CSIC)
Madrid, 2013

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el grupo de investigación Nucleósidos y
análogos como fuente de moléculas bioactivas del Instituto de Química Médica
(CSIC), bajo la dirección de la Prof. María José Camarasa y la Dra. Sonsoles
Velázquez, y dentro del marco de los proyectos SAF 2006-12713-C02-01, SAF
2009-131914-CO2-01 y BIPEDD-CM S-BIO-0214-2006 y S2010/BMD-2457.

El autor agradece la financiación otorgada por el Ministerio de Ciencia e
Innovación (hoy en día Ministerio de Economía y Competitividad) mediante la
concesión de una beca de Formación de Personal Investigador (FPI 2007), gracias
a la que ha sido posible la realización de este trabajo así como una estancia
predoctoral de 4 meses en el la Universidad de Aarhus (Dinamarca).
ÍNDICE

Nota sobre nomenclatura .......................................................................................... i
Nota sobre puntuación ............................................................................................... i
L-aminoácidos y nomenclatura ................................................................................ iii
Abreviaturas empleadas ........................................................................................... v
Abstract ................................................................................................................... vii

INTRODUCCIÓN GENERAL: LAS INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA
COMO DIANA TERAPÉUTICA
Desarrollo de moduladores de IPPs ........................................................................ 3
Algunas estrategias para el descubrimiento de moduladores de IPPs ................... 4

OBJETIVOS GENERALES ...................................................................................... 9

CAPÍTULO 1: PÉPTIDOS CÍCLICOS COMO INHIBIDORES DE LA TI DEL VIH-1
1.1. Introducción .................................................................................................. 11
1.1.1. Estructura y genoma del VIH ........................................................... 12
1.1.2. Ciclo replicativo del VIH-1 y estrategias terapéuticas .................... 13
1.1.3. La Transcriptasa Inversa como diana terapéutica ........................... 16
1.1.4. Inhibidores de la TI del VIH-1 .......................................................... 18
1.2. Antecedentes ................................................................................................ 25
1.2.1. La interfaz de dimerización de la TI como diana terapéutica .......... 25
1.2.2. El asa 7/8 como hot spot en la dimerización de la TI
del VIH-1 .................................................................................................... 30
1.2.3. Desarrollo de péptidos minimalistas del asa 7/8 .......................... 31
1.3. Objetivos ........................................................................................................ 37
1.4. Síntesis ........................................................................................................... 41
1.4.1. Estrategia sintética general .............................................................. 41
1.4.2. Serie 1. Péptidos cíclicos con puentes hidrocarbonados
(1.13-1.17) .................................................................................................. 44
1.4.2.1. Síntesis de los precursores lineales (1.22-1.24) ............. 44
1.4.2.2. Reacción de metátesis .................................................... 48
1.4.2.3. Reacción de hidrogenación ............................................. 54
1.4.3. Serie 2. Péptidos cíclicos con puente de 1,2,3-triazol
(1.18 y 1.19). .............................................................................................. 55
1.4.3.1. Síntesis de los precursores lineales ................................ 55
1.4.3.2. Reacción de cicloadición 1,3-dipolar alquino-azida ......... 58
1.4.4. Serie 3. Péptidos cíclicos con puente amida (1.20 y 1.21) ............. 65
1.5. Estudio conformacional en disolución mediante técnicas de RMN ........ 69
1.5.1. Asignación estructural ...................................................................... 70
1.5.2. Desplazamientos conformacionales ................................................. 72
1.5.3. Coeficientes de temperatura (/T) ............................................... 80
1.5.4. Efecto nuclear Overhauser (NOE) ................................................... 83
1.5.5. Cálculo de estructura usando el programa CYANA ......................... 86
1.6. Evaluación biológica in vitro de los péptidos 1.13-1.21como inhibidores
del proceso de la dimerización del VIH-1 ........................................................... 94
1.7. Bibliografía ...................................................................................................... 95

CAPÍTULO 2: INHIBIDORES DE LA DIMERIZACIÓN DE LA TryR DE
LEISHMANIA INFANTUM
2.1. Introducción ................................................................................................. 115
2.1.1. Ciclo vital de Leishmania ................................................................ 116
2.1.2. Tratamiento actual de la Leishmaniasis ........................................ 117
2.1.3. El metabolismo redox como elemento clave en la supervivencia de
Leishmania ............................................................................................... 119
2.1.4. Inhibidores de la TryR .................................................................... 122
2.2. Antecedentes .............................................................................................. 127
2.2.1. Predicción de hot spots de la interfaz de dimerización
de la Li-TryR ............................................................................................. 127
2.2.2. La interfaz de dimerización de la TryR de L. infantum
como potencial diana terapéutica ............................................................ 130
2.3. Objetivos ...................................................................................................... 133
2.4. Serie 1. Péptidos conformacionalmente restringidos de 2.01 ............... 135
2.4.1. Diseño in silico de los péptidos grapados ...................................... 138
2.4.2. Síntesis de los péptidos grapados 2.06-2.09 ................................ 143
2.4.2.1. Síntesis asimétrica de los aminoácidos cuaternarios
de partida ................................................................................... 144
2.4.2.2. Elongación y reacción de metátesis .............................. 152
2.4.2.3. Síntesis en disolución de los péptidos grapados
saturados .................................................................................... 155
2.4.3. Estudio estructural en disolución .................................................. 158
2.4.3.1. Dicroísmo circular ......................................................... 158
2.4.3.2. Estudios de RMN .......................................................... 164
2.5. Serie 2. Análogos lineales de 2.01 (2.30-2.35) ......................................... 171
2.5.1. Diseño ............................................................................................ 171
2.5.2. Síntesis .......................................................................................... 172
2.5.2.1. Síntesis de los péptidos 2.30 y 2.31 a partir de
la peptidil-resina 2.36 .................................................................. 174
2.5.2.2. Síntesis de los péptidos 2.32-2.35 a partir de
la peptidil-resina 2.37 .................................................................. 175
2.6. Evaluación biológica .................................................................................. 178
2.6.1. Inhibición de la actividad de la Li-TryR .......................................... 178
2.6.2. Inhibición de la dimerización de la Li-TryR .................................... 182
2.7. Estudios de modelización molecular ......................................................... 187
2.7.1. Simulación de DM del monómero de la Li-TryR ............................ 188
2.7.2. Simulación de DM de los péptidos sobre el monómero ................ 192
2.7.2.1.Análisis de las interacciones del prototipo 2.01
con la proteína ............................................................................. 194
2.7.2.2. Análisis de las interacciones de 2.06, 2.07, 2.34
(Glu2Ala) y 2.35 (Glu2Lys) con la proteína ................................ 198
2.7.3. Cálculo de la energía libre de unión péptido–monómero
de la Li-TryR ............................................................................................ 202
2.7.3.1. Descomposición de la G por residuos para el
bind
péptido 2.35 ................................................................................ 203
2.7.4. Modelo de interacción de 2.35 con la enzima ............................... 206
2.8. Bibliografía .................................................................................................... 208

3. CONCLUSIONES GENERALES ...................................................................... 223

4. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................. 229
4.1. Métodos generales ...................................................................................... 230
4.2. Productos comerciales ............................................................................... 233
4.3. Preparación de los productos de partida en disolución ......................... 235
4.4. Protocolos generales en fase sólida ......................................................... 244
4.4.1. Seguimiento de las reacciones en fase sólida .............................. 244
4.4.2. Protocolos generales en la síntesis de péptidos lineales
en fase sólida mediante estrategia Fmoc/tBu ......................................... 244
4.4.2.1. Soporte polimérico ......................................................... 245
4.4.2.2. Determinación de la carga de una resina tras
unión del primer aminácido ......................................................... 245
4.4.2.3. Elongación de la cadena peptídica ................................ 246
4.4.2.4. Acetilación de aminas .................................................... 247
4.4.2.5. Eliminación de los grupos protectores
aliloxicarbonilo (Alloc) y grupos alilo (OAl) .................................. 248
4.4.2.6. Desanclaje de la resina y sedimentación de
los péptidos ................................................................................. 248
4.4.2.7. Purificación de los péptidos ........................................... 249
4.5. Síntesis y caracterización de inhibidores de la dimerización
de la TI del VIH-1 ................................................................................................ 250
4.5.1. Péptidos lineales y cíclicos con puentes hidrocarbonados ........... 250
4.5.1.1. Síntesis de los péptidos lineales 1.22 – 1.24 ................. 250
4.5.1.2. Síntesis de los péptidos cíclicos 1.13 – 1.17 ................. 251
4.5.2. Péptidos lineales y cíclicos con puentes 1,2,3-triazol ................... 258
4.5.2.1. Síntesis de los péptidos lineales 1.38 y 1.39 ................. 258
4.5.2.2. Síntesis de los péptidos cíclicos 1.18 y 1.19 ................. 260
4.5.3. Péptidos lineales y cíclicos con puentes amida............................. 261
4.5.3.1. Síntesis de los péptidos cíclicos 1.20 y 1.21
mediante macrolactamización ..................................................... 262
4.6. Síntesis y caracterización de inhibidores de la dimerización
de la Li-TryR ....................................................................................................... 264
4.6.1. Síntesis de los péptidos grapados insaturados 2.06 y 2.07
mediante reacción de metátesis ............................................................. 264
4.6.2. Síntesis de los péptidos grapados saturados 2.08 y 2.09
mediante hidrogenación catalítica en disolución ..................................... 265
4.6.3. Síntesis de los análogos lineales 2.30-2.35 .................................. 269
4.7. Métodos para la determinación estructural .............................................. 278
4.7.1. Resonancia magnética nuclear (RMN) .......................................... 278
4.7.1.1. Adquisición de las muestras .......................................... 278
4.7.1.2. Asignación de RMN ....................................................... 278
4.7.1.3. Cálculo de estructura mediante el programa CYANA ... 279
4.7.2. Dicroísmo circular ........................................................................... 279
4.8. Métodos de simulación de dinámica molecular........................................ 280
4.8.1. Preparación de los sistemas teóricos ............................................. 280
4.8.2. Definición de residuos no naturales y cofactores ........................... 280
4.8.3. Simulaciones de dinámica molecular ............................................. 280
4.8.4. Cálculo de energías libres de interacción proteína-ligando ........... 281
4.8.5. Análisis y visualización de los datos de las simulaciones de DM .. 282
4.9. Ensayos biológicos ...................................................................................... 282
4.9.1. Ensayos de inhibición de la actividad oxidorreductasa de la Li-TryR
.................................................................................................................. 282
4.9.2. Ensayo de la dimerización de la TryR de L. infantum .................... 283
4.10. Bibliografía .................................................................................................. 284