pdf Aproximación cinética, molecular y proteómica al estudio de podredumbre apical en frutos de

246 Pages·2004·4.13 MB·Spanish

by  Juan Casado Vela

Aproximación enzimática, molecular y
proteómica al estudio de la podredumbre
apical de tomate (Lycopersicon esculentum

M.). Implicación de polifenol oxidasa (PPO)

y enzimas antioxidantes

Juan Casado Vela
MEMORIA DE TESIS DOCTORAL

Aproximación enzimática, molecular y
proteómica al estudio de la podredumbre
apical de tomate (Lycopersicon esculentum
M.). Implicación de polifenol oxidasa (PPO)
y enzimas antioxidantes.

Dr. JUAN CASADO VELA

Departamento de Agroquímica y Bioquímica
Facultad de Ciencias

Universidad de Alicante
2004
El aspirante a Doctor ha disfrutado de una beca de Formación de Personal Investigador (F.P.I.)
del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MCYT) vinculada al proyecto del Plan Nacional de I+D:

AGF99-0396 con título: IMPLICACIÓN Y CONTROL DE POLIFENOL OXIDASA EN LOS
DESÓRDENES FISIOLÓGICOS CAUSADOS POR EL DÉFICIT DE CALCIO EN FRUTOS
DESTINADOS AL CONSUMO HUMANO.

Durante la realización de esta tesis el aspirante ha completado su formación gracias a la
realización de estancias de en los centros de investigación que se relacionan sufragados mediante
ayudas para la realización de estancias breves de investigación del Ministerio de Ciencia y
Tecnología.

1. Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas de Valencia (I.B.M.C.P.-CSIC).

2. Institute of Medical Sciences. Proteome Facility. Aberdeen University. Scotland (UK).

3. Instituto de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad Miguel Hernández.
AGRADECIMIENTOS

Deseo expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que han
contribuido a que este trabajo de investigación se pueda llevar a cabo.

En primer lugar al Dr. Roque Bru, por su apoyo incondicional y diario y por
su contribución a mi formación durante estos últimos cuatro años.

En segundo lugar a Susana Sellés, por su inestimable ayuda y al resto de
compañeros de laboratorio y del Departamento de Agroquímica y Bioquímica por
su apoyo en las tareas de laboratorio.

A mis padres y hermanos, que son los que más me han ayudado en los
momentos más difíciles de mi carrera.

A mis amigos, que siempre me han dado ánimo para poder conseguir mis
objetivos.
PROLOGO Juan Casado Vela

Todas las proteínas, enzimas y substratos que aparecen en este trabajo de investigación
se han nombrado de acuerdo a las recomendaciones de la Unión Internacional de Bioquímica y
Biología Molecular (I.U.B.M.B.). Enzyme Nomenclature, Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme). Hemos utilizado
las traducciones en castellano siempre que ha sido posible (incluyendo abreviaturas utilizadas), sin
embargo, a lo largo del texto aparecen términos en inglés. Algunos de ellos constituyen palabras
clave de esta tesis y cuya traducción no nos ha sido posible encontrar -o bien no está aceptada-
(como MALDI-TOF, score…). En otras ocasiones, a pesar de que sí hemos encontrado
traducciones aceptadas en castellano, el conocimiento de la terminología en inglés resulta vital
para cualquier lector que quiera ampliar información sobre las técnicas y resultados presentados en
este trabajo de investigación (peptides matched, Blossom-end rot…). Los términos en inglés
aparecen en cursiva para llamar la atención al lector sobre este hecho. También se indican en
cursiva los términos en latín y nombres de las especies de plantas.

Durante la redacción se ha evitado, en la medida de lo posible, la utilización de
abreviaturas con la finalidad de favorecer la comprensión de los resultados. Sin embargo, la
descripción de las abreviaturas aparece siempre en el texto (cuando se utilizan por primera vez
durante la redacción).

También hemos seguido las recomendaciones de la I.U.B.M.B. a la hora de nombrar los
genes que codifican para una proteína con letras minúsculas (ejemplo: ppo) y con letras
mayúsculas el producto de dicho gen (ejemplo PPO), siempre que el gen y su producto (la proteína
codificada) presenten la misma terminología. Los plásmidos utilizados para el clonado de
secuencias se denotan con una “p” minúscula (ejemplo: p-GEM easy vector II).

Durante la redacción del texto nos hemos apoyado en numerosas referencias
bibliográficas. Cuando existe más de una cita al final de una frase, estas se enumeran por orden
cronológico. Cuando se citan varios autores que corresponden al mismo año de publicación, su
orden dentro del texto se incluirá por orden alfabético según el apellido de los autores. En el caso
de que exista más de una cita de un mismo autor y en el mismo año, se denotará con una letra
después del año de publicación (ejemplo: Görg y col., 1988a y b).

La numeración de tablas y figuras se ha realizado de forma que el lector pueda identificar
rápidamente el capítulo a que corresponde (ejemplo Tabla 3.1 significa que es la primera tabla del
capítulo 3).
INDICE DE CONTENIDOS Juan Casado Vela

INDICE DE CONTENIDOS

Prologo
˝ndice de contenidos
Abreviaturas................................................................................................................................ 1
I Capítulo I: Introducción general y antecedentes................................................................... 4
1.- Introducci(cid:243)n general .............................................................................................................. 4
2.- Clasificaci(cid:243)n taxon(cid:243)mica e importancia econ(cid:243)mica del cultivo del tomate............................ 5
3.- La podredumbre apical de tomate. Descripci(cid:243)n y antecedentes........................................... 6
4.- Polifenol oxidasas y fenoles en plantas................................................................................. 8
4.1.- Distribuci(cid:243)n, localizaci(cid:243)n y funci(cid:243)n biol(cid:243)gica......................................................... 8
4.2.- Caracter(cid:237)sticas moleculares de la PPO de tomate ................................................ 10
4.3.- Estructura y mecanismo catal(cid:237)tico.......................................................................... 14
4.4.- Fenoles en plantas ................................................................................................ 17
5.- Introducci(cid:243)n a la prote(cid:243)mica.................................................................................................. 19
5.1.- Preparaci(cid:243)n de las muestras.................................................................................. 22
5.2.- Separaci(cid:243)n de prote(cid:237)nas mediante electroforesis bidimensional........................... 22
5.3.-Tinci(cid:243)n, digitalizaci(cid:243)n, anÆlisis de las imÆgenes y recuperaci(cid:243)n de los puntos
25
del gel ....................................................................................................................
5.4.- Identificaci(cid:243)n de prote(cid:237)nas .................................................................................... 25
5.5.- Determinaci(cid:243)n de la funci(cid:243)n de las prote(cid:237)nas identificadas, procesos
bioqu(cid:237)micos en los que participan y significado biol(cid:243)gico de los resultados.......... 28

6.- Hip(cid:243)tesis de trabajo..............................................................................................................
29
Objetivos..................................................................................................................................... 31
INDICE DE CONTENIDOS Juan Casado Vela

II Capítulo 2: Purificación y caracterización cinética de polifenol oxidasa de tomate.......... 32
Introducci(cid:243)n................................................................................................................................. 32
Materiales y mØtodos.................................................................................................................. 34
1.- Consideraciones generales ................................................................................................... 34
2.- Soluciones utilizadas.............................................................................................................. 34
3.- MØtodos................................................................................................................................. 34
Resultados y discusi(cid:243)n................................................................................................................ 38
1.- Extracci(cid:243)n y purificaci(cid:243)n enzimÆtica...................................................................................... 38
2.- Evoluci(cid:243)n de la actividad PPO con la maduraci(cid:243)n y el desarrollo......................................... 42
3.- Niveles de PPO en variedades de tomate............................................................................. 43
4.- Comparaci(cid:243)n de la actividad PPO de tejidos afectados por podredumbre apical y sanos.... 45
5.- Caracterizaci(cid:243)n cinØtica de las fracciones de PPO............................................................... 46
6.- Activaci(cid:243)n de PPO en presencia de cobre............................................................................. 59
III Capítulo 3: Identificación y clonaje de isoenzimas de polifenol oxidasa de tomate.......... 61
Introducci(cid:243)n................................................................................................................................. 61
Materiales y mØtodos.................................................................................................................. 63
1.- Soluciones utilizadas.............................................................................................................. 63
2.- MØtodos................................................................................................................................. 64
Resultados y discusi(cid:243)n................................................................................................................ 72
1.- Extracci(cid:243)n de Æcidos nucleicos.............................................................................................. 72
2.- Diseæo de cebadores degenerados....................................................................................... 73
3.- Retrotranscripci(cid:243)n y amplificaci(cid:243)n de RNA mensajeros de frutos de tomate........................ 74
4.- Clonaje de fragmentos de cDNA de PPO y secuenciaci(cid:243)n................................................... 76
5.- Caracterizaci(cid:243)n del clon D6................................................................................................... 78
6.- Determinaci(cid:243)n de isoenzimas de PPO mediante digesti(cid:243)n con enzimas de restricci(cid:243)n........ 82
INDICE DE CONTENIDOS Juan Casado Vela

IV Capítulo 4: Aproximación proteómica al estudio de podredumbre apical.......................... 85
Introducci(cid:243)n................................................................................................................................. 85
1.- Aplicaci(cid:243)n de la prote(cid:243)mica en plantas.................................................................................. 85
2.- Aplicaci(cid:243)n de prote(cid:243)mica al estudio de podredumbre apical................................................. 87
Materiales y mØtodos.................................................................................................................. 90
1.- Soluciones utilizadas.............................................................................................................. 90
2.- MØtodos................................................................................................................................. 91
Resultados y discusi(cid:243)n................................................................................................................ 98
1.- Optimizaci(cid:243)n de los protocolos.............................................................................................. 98
2.- Ventajas de la utilizaci(cid:243)n de detergente Triton X-114............................................................ 99
3.- Identificaci(cid:243)n de prote(cid:237)nas de frutos de tomate afectados por podredumbre apical
102
mediante anÆlisis de la huella pept(cid:237)dica..............................................................................
4.- Alteraci(cid:243)n del perfil protØico de frutos de tomate afectados por podredumbre apical........... 116
V Conclusiones............................................................................................................................... 129
VI Bibliograf(cid:237)a.................................................................................................................................. 131
VII Anexos........................................................................................................................................ 144
Anexo A....................................................................................................................................... 144
Anexo B....................................................................................................................................... 152
Anexo C....................................................................................................................................... 171
Anexo D....................................................................................................................................... 173
Anexo E....................................................................................................................................... 227
INDICE DE CONTENIDOS Juan Casado Vela

INDICE DE TABLAS PÆg.
TABLAS DEL CAP˝TULO I
Tabla 1.1: peso molecular de precursores y prote(cid:237)nas maduras de PPO de tomate 11
nivel de homolog(cid:237)a (%) entre secuencias de PPO de tomate. Adaptado de Newman
Tabla 1.2: 13
y col., 1993
nomenclatura comœn y sistemÆtica para las polifenol oxidasas (PPOs) segœn las
Tabla 1.3: recomendaciones del ComitØ de Nomenclatura de la Uni(cid:243)n Internacional de 15
Bioqu(cid:237)mica y Biolog(cid:237)a Molecular (NC-IUBMB)
TABLAS DEL CAP˝TULO II
actividad PPO, factor de purificaci(cid:243)n, rendimiento y contenido de fenoles de
Tabla 2.1: preparaciones protØicas de frutos de tomate (cv. Muchamiel) obtenidas mediante 40
protocolo de extracci(cid:243)n utilizando Triton X-114
actividad PPO en diferentes variedades de frutos de tomate, incluyendo variedades
Tabla 2.2: 44
comerciales y locales
niveles de actividad PPO en correlaci(cid:243)n con la aparici(cid:243)n de podredumbre apical en
Tabla 2.3: 46
frutos de tomate cultivar Italian Hungarian Paste
constantes cinØticas determinadas para preparaciones de PPO de frutos de
Tabla 2.4: 49
tomate (cv. Muchamiel ) utilizando dos substratos (4MC y TBC)
Tabla 2.5: constantes Ki para E y E 52
1 2
estructura, longitud de onda (cid:243)ptima y coeficientes de extinci(cid:243)n de los diferentes
Tabla 2.6: 54
substratos ensayados para la medida de la actividad PPO de frutos de tomate
Tabla 2.7: compuestos inhibidores de actividad PPO 57
efecto de diferentes inhibidores sobre la actividad PPO de frutos de tomate cv.
Tabla 2.8: 57
Muchamiel
activaci(cid:243)n por cobre de PPO (fracci(cid:243)n E ). Actividad relativa (%) con respecto a la
Tabla 2.9: 1 59
actividad PPO incubada durante el mismo tiempo en ausencia de cobre en el medio
TABLAS DEL CAP˝TULO III
nœmeros de acceso de secuencias que codifican para PPO de tomate en bases de
Tabla 3.1: 62
datos
Tabla 3.2: reactivos para RT-PCR (Titan One Tube kit) 68
Tabla 3.3: programa de RT-PCR utilizado para la amplificaci(cid:243)n de RNAm de PPO de tomate 68
direcci(cid:243)n de amplificaci(cid:243)n, secuencia y caracter(cid:237)sticas de los cebadores utilizados
Tabla 3.4: 74
para amplificar PPO de frutos de tomate
resultados de la secuenciaci(cid:243)n del fragmento de cDNA clonado en D6 y porcentajes
Tabla 3.5: 77
de similitud con secuencias de PPO de tomate publicadas
nœmeros de acceso EMBL, identificaci(cid:243)n y descripci(cid:243)n de secuencias del inserto
Tabla 3.6: 80
clonado en D6
Tabla 3.7: endonucleasas utilizadas para la determinaci(cid:243)n de isoenzimas de PPO de tomate 82
INDICE DE CONTENIDOS Juan Casado Vela

Tabla 3.8: presencia (+) o ausencia (-) de digesti(cid:243)n de insertos clonados
TABLAS DEL CAP˝TULO IV
Tabla 4.1: composici(cid:243)n de geles de acrilamida 12.5% (p/v) (composici(cid:243)n para 100 ml) 93
caracter(cid:237)sticas de la tripsina utilizada en la digesti(cid:243)n de las prote(cid:237)nas contenidas en
Tabla 4.2: 95
fragmentos de gel
matrices utilizadas para el anÆlisis de prote(cid:237)nas, glœcidos y Æcidos nucleicos con
Tabla 4.3: 96
MALDI-TOF utilizando lÆser de nitr(cid:243)geno (337nm). (Simpson, 2002)
nœmero de puntos detectados en los geles 1 al 6 de la figura 4.4, teæidos con nitrato
Tabla 4.4: 100
de plata y utilizando el programa Image Master Platinum
Tabla 4.5: peso molecular y punto isoelØctrico de super(cid:243)xido dismutasa de tomate (SOD) 108
Tabla 4.6: prote(cid:237)nas de tejido PA1 identificadas mediante anÆlisis de la huella pept(cid:237)dica 110
Tabla 4.7: prote(cid:237)nas de tejido PA2 identificadas mediante anÆlisis de la huella pept(cid:237)dica 111
prote(cid:237)nas y enzimas identificadas agrupadas atendiendo a su funci(cid:243)n y/o proceso
Tabla 4.8: 113
en el que participa, denominaci(cid:243)n y abreviatura utilizada
niveles de expresi(cid:243)n de las prote(cid:237)nas identificadas en los diferentes tejidos
Tabla 4.9: 116
analizados