8/21/2015 CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN Se refiere a los procesos (conjunto de métodos) empleados para crear copias idénticas de fragmentos de ADN, copias idénticas de células o copias idénticas de organismos Se pueden clonar organismos células moléculas de ADN CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos que permiten identificar y purificar un fragmento de ADN particular a partir de una mezcla compleja de ADN, y luego reproducirlo en grandes cantidades. ¿PARA QUÉ CLONAR ADN? Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos de un gen específico Identificar y analizar las secuencias reguladoras que controlan la expresión (promotor) de un gen Investigar la función de proteína/enzima/RNA Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con alguna patología de origen genético) 1 8/21/2015 CLONADO MOLECULAR PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR Obtención del ADN a clonar Elección de la fuente de ADN y de la metodología para obtenerlo Purificación del ADN Digestión con las enzimas de restricción apropiadas Obtención del vector Elección del vector apropiado Digestión del vector Ligación Introducción de la molécula de ADN recombinante en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN) Identificación de las células que contienen el ADN recombinante (SELECCIÓN) 2 8/21/2015 La estrategia depende tanto de la información de partida como del objetivo final de mi clonado ¿Con qué información cuento antes de empezar? - Secuencia de la proteína - Ubicación en el genoma (positional cloning) - Secuencia del mRNA - Bibliotecas de cDNA o genómica - Secuencias de ADN desconocidas o conocidas - Producto de PCR ¿Cuál es la fuente del ADN? -ADN (cromosomal, bibliotecas, etc) -ARN -PCR Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca (teniendo información de la secuencia de ADN) 3 8/21/2015 Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca (teniendo información de proteína/anticuerpos) Amplificación de secuencias de ADN por PCR 4 8/21/2015 Amplificación de secuencias de ADN por PCR introduciendo sitios de restricción Mediante el diseño apropiado de los oligos empleados para la amplificación por PCR, se pueden introducir los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción necesarios para el posterior clonado. Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o parcialmente desconocidas por PCR No siempre conozco la secuencia completa que quiero amplificar como para poder diseñar oligonucleótidos específicos. Hay estrategias para poder hacerlo (se verán en detalle en la clase de PCR II): - RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends): Puede ser tanto 5´como 3´. - PCR inversa - Uso de oligonucleótidos degenerados 5 8/21/2015 RT-PCR: Amplificación por PCR cuando el material de partida es ARNm. Trascripción Reversa (RT) seguida de PCR CLONAR/AMPLIFICAR 6 8/21/2015 VECTORES La elección del vector depende de: Tamaño del inserto Tamaño del vector Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción Número de copias Eficiencia del método de transformación Qué tipo de experimentos se realizarán con el inserto clonado: 1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA 2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes clonados 3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica HERRAMIENTAS NECESARIAS PARA CLONAR Enzimas de restricción Vectores ADN Ligasa Células huésped Método de transformación Otras enzimas: 7 8/21/2015 OTRAS ENZIMAS Removes phosphate groups from 5' ends of Alkaline phosphatase DNA (prevents unwanted re-ligation of cut DNA) Joins compatible ends of DNA fragments DNA ligase (blunt/blunt or complementary cohesive ends). Uses ATP Synthesises DNA complementary to a DNA template in the 5'-to-3'direction. Starts DNA polymerase I from an oligonucleotide primer with a 3' OH end Digests nucleotides progressiviely from a Exonuclease III DNA strand in the 3' -to-5' direction Adds a phosphate group to the 5' end of Polynucleotide kinase double-or single-stranded DNA or RNA. Uses ATP RNase A Nuclease which digests RNA, not DNA Heat-stable DNA polymerase isolated from TaqDNA polymerase a thermostablemicrobe (Thermus aquaticus) DIGESTIÓN DEL INSERTO Y DEL VECTOR Antes de realizar la ligación, el fragmento de ADN que se quiere clonar y el vector donde se va a insertar deben ser digeridos con enzimas de restricción. La elección de las enzimas está relacionada con la estrategia diseñada: vector elegido, procedencia del inserto, etc. Es importante considerar la posibilidad de modificar los extremos generados luego del corte. 8 8/21/2015 Extremo 5´protruding • 5' overhangs: La enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento, generando un extremo 5´saliente (protruding) simple hebra. • Ej: Bam HI genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. Extremo 3´protruding • 3' overhangs: La enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento, generando un extremo 3´saliente (protruding) simple hebra. • Ej:KpnI genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. 9 8/21/2015 Extremos romos • Romo (Blunt): La enzima corta las dos hebras del ADN en sitios exactamente opuestos, generando extremos romos, sin ninguna base saliente. • SmaI genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. Convertir un extremo 5’ protruding en romo • Se pueden usar las enzimas Klenow o T4 DNA polimerasa para rellenar con dNTPs los extremos salientes. • Se usa para ligar fragmentos que poseen extremos que so son compatibles. 10
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