¿PARA QUÉ CLONAR ADN?

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8/21/2015
CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN
Se refiere a los procesos (conjunto de métodos)
empleados para crear copias idénticas de
fragmentos de ADN, copias idénticas de células o
copias idénticas de organismos
Se pueden clonar organismos
células
moléculas de ADN
CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos que
permiten identificar y purificar un fragmento de
ADN particular a partir de una mezcla compleja
de ADN, y luego reproducirlo en grandes
cantidades.
¿PARA QUÉ CLONAR ADN?
 Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos
de un gen específico
Identificar y analizar las secuencias reguladoras
que controlan la expresión (promotor) de un gen
Investigar la función de proteína/enzima/RNA
Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con
alguna patología de origen genético)
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CLONADO MOLECULAR
PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR
Obtención del ADN a clonar
Elección de la fuente de ADN y de la metodología para
obtenerlo
Purificación del ADN
Digestión con las enzimas de restricción apropiadas
Obtención del vector
Elección del vector apropiado
Digestión del vector
Ligación
Introducción de la molécula de ADN recombinante
en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN)
 Identificación de las células que contienen el ADN
recombinante (SELECCIÓN)
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La estrategia depende tanto de la información de
partida como del objetivo final de mi clonado
¿Con qué información cuento antes de empezar?
- Secuencia de la proteína
- Ubicación en el genoma (positional cloning)
- Secuencia del mRNA
- Bibliotecas de cDNA o genómica
- Secuencias de ADN desconocidas o conocidas
- Producto de PCR
¿Cuál es la fuente del ADN?
-ADN (cromosomal, bibliotecas, etc)
-ARN
-PCR
Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca
(teniendo información de la secuencia de ADN)
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Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca
(teniendo información de proteína/anticuerpos)
Amplificación de secuencias de ADN por PCR
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Amplificación de secuencias de ADN por
PCR introduciendo sitios de restricción
Mediante el diseño
apropiado de los oligos
empleados para la
amplificación por PCR, se
pueden introducir los
sitios de reconocimiento
para las enzimas de
restricción necesarios
para el posterior clonado.
Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o
parcialmente desconocidas por PCR
No siempre conozco la secuencia completa que
quiero amplificar como para poder diseñar
oligonucleótidos específicos. Hay estrategias
para poder hacerlo (se verán en detalle en la
clase de PCR II):
- RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends):
Puede ser tanto 5´como 3´.
- PCR inversa
- Uso de oligonucleótidos degenerados
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RT-PCR:
Amplificación por
PCR cuando el
material de
partida es ARNm.
Trascripción
Reversa (RT)
seguida de PCR
CLONAR/AMPLIFICAR
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VECTORES
La elección del vector depende de:
 Tamaño del inserto
 Tamaño del vector
 Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
 Número de copias
 Eficiencia del método de transformación
 Qué tipo de experimentos se realizarán con el
inserto clonado:
1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos
de DNA
2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes
clonados
3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de
promotores y secuencias regulatorias de la expresión
génica
HERRAMIENTAS NECESARIAS PARA CLONAR
 Enzimas de restricción
 Vectores
 ADN Ligasa
 Células huésped
 Método de transformación
 Otras enzimas:
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OTRAS ENZIMAS
Removes phosphate groups from 5' ends of
Alkaline phosphatase DNA (prevents unwanted re-ligation of cut
DNA)
Joins compatible ends of DNA fragments
DNA ligase (blunt/blunt or complementary cohesive
ends). Uses ATP
Synthesises DNA complementary to a DNA
template in the 5'-to-3'direction. Starts
DNA polymerase I
from an oligonucleotide primer with a 3' OH
end
Digests nucleotides progressiviely from a
Exonuclease III
DNA strand in the 3' -to-5' direction
Adds a phosphate group to the 5' end of
Polynucleotide kinase double-or single-stranded DNA or RNA.
Uses ATP
RNase A Nuclease which digests RNA, not DNA
Heat-stable DNA polymerase isolated from
TaqDNA polymerase a thermostablemicrobe (Thermus
aquaticus)
DIGESTIÓN DEL INSERTO Y DEL VECTOR
 Antes de realizar la ligación, el fragmento de
ADN que se quiere clonar y el vector donde se
va a insertar deben ser digeridos con enzimas
de restricción.
 La elección de las enzimas está relacionada
con la estrategia diseñada: vector elegido,
procedencia del inserto, etc.
 Es importante considerar la posibilidad de
modificar los extremos generados luego del
corte.
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Extremo 5´protruding
• 5' overhangs: La enzima corta asimétricamente
dentro del sitio de reconocimiento, generando un
extremo 5´saliente (protruding) simple hebra.
• Ej: Bam HI genera un extremo de este tipo al
digerir el ADN.
Extremo 3´protruding
• 3' overhangs: La enzima corta asimétricamente
dentro del sitio de reconocimiento, generando un
extremo 3´saliente (protruding) simple hebra.
• Ej:KpnI genera un extremo de este tipo al digerir
el ADN.
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Extremos romos
• Romo (Blunt): La enzima corta las dos hebras del
ADN en sitios exactamente opuestos, generando
extremos romos, sin ninguna base saliente.
• SmaI genera un extremo de este tipo al digerir el
ADN.
Convertir un extremo 5’ protruding en romo
• Se pueden usar las
enzimas Klenow o T4
DNA polimerasa para
rellenar con dNTPs los
extremos salientes.
• Se usa para ligar
fragmentos que poseen
extremos que so son
compatibles.
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