Papierchromatographie in der Botanik

265 Pages·1955·10.99 MB·English

by  H. Dörfel, R. Hänsel, B. Prijs, A. Romeike, H. Schweppe (auth.), S. P. Sen

PAPIERCHROMATOGRAPHIE
IN DER BOTANIK
BEARBEITET VON
H. DORFEL · R. HÄNSEL · H. F. LINSKENS · B. PRI]S
A. ROMEIKE · B. D. SANWAL · H. SCHWEPPE · H. SEILER
S. P. SEN · L. STANGE · C. A. WACHTMEISTER
S. YAMATODANI · H. ZÄHNER
HERAUSGEGEBEN VON
H. F. LINSKENS
,\;\JT 63 TEXTABBILDUNGEN
SPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG GMBH
1955
ALLE RECHTE, INSBESONDERE DAS DER ÜBERSETZUNG
IN FREMDE SPRACHEN, VORBEHALTEN
OHNE AUSDRÜCKLICHE GENEHMIGUNG DES VERLAGES IST ES AUCH NICHT
GESTATTET, DIESES BUCH ODER TEILE DARAUS AUF PHOTOMECHANISCHEM
WEGE (PHOTOKOPIE, MIKROKOPIE) ZU VERVIELFÄLTIGEN
COPYRIGHT 1955 BY SPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG
URSPRÜNGLICHERSCHIENENBEI SPRINGER-VERLAG OHG. BERLIN • GÖTTINGEN • HEIDELBERG 1955
ISBN 978-3-662-12667-7 ISBN 978-3-662-12666-0 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-662-12666-0
BRÜHLSCHE UNIYERSITÄTSDRUCKEREI GmSSEN
Vorwort.
Die papierchromatographische Methode bietet auf Grund ihres
relativ geringen apparativen Aufwandes, des zu erzielenden hohen
Trenneffektes und der zur Analyse benötigten geringen Substanzmengen
neue Aspekte für die biochemische Arbeit im biologischen Laboratorium.
Zahlreiche Probleme können nunmehr angegangen werden, denen auf
Grund des geringen zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterials bisher
eine experimentelle Untersuchung verschlossen war.
Vorliegende Darstellung bringt die Anwendung papierchromato-
graphischer Techniken für diejenigen Substanzen, die im Rahmen
botanisch-biochemischer Fragestellungen von Interesse sind. Die
Bearbeiter verfügen jeweils über eigene experimentelle Erfahrung im
Bereich der dargestellten Stoffgruppe. Die Methoden und ihre Anwen-
dung sind so ausführlich dargestellt, daß ein Nacharbeiten im allgemeinen
ohne Hinzuziehung der Originalliteratur möglich ist. Eine vollständige
Erfassung sämtlicher bisher beschriebener Methoden wurde nicht
angestrebt. Vielmehr sind die brauchbarsten und erprobtesten Arbeits-
gänge unter besonderer Berücksichtigung der Aufarbeitungsverfahren
zusammengetragen.
Bezüglich der theoretischen Grundlegung und der allgemeinen papier-
chromatographischen Methodik sei auf die folgenden zusammenfassenden
Darstellungen verwiesen:
J. N. BALSTON,- F. E. TALBOT: A Guide to Filter Paper Chromato-
graphy. London 1952.
R. J. BLOCK, - E. L. DuRRUM - G. ZWEIG: A Manual of Paper
Chromatography and Paper Electrophoresis. New York 1955.
R. C. BRIMLEY, - F. C. BARRETT: Practical Chromatography.
London 1954.
F. CRAMER: Papierchromatographie, 3. Auflage. Weinheim 1954.
H. HELLMANN: Papierchromatographie, in "Moderne Methoden der
Pflanzenanalyse" Bd. I (im Druck).
E. LEDERER, - M. LEDERER: Chromatography. Amsterdam 1954.
H. M. RAUEN: Chromatographie, in "Handbuch der Physiologischen
und Pathologisch-Chemischen Analyse", I, 217. Berlin 1953.
T. J. WILLIAMS: The Elements of Chromatography. Glasgow 1954.
Mit Nachdruck muß auf die Grenze der papierchromatographischen
Methodik hingewiesen werden; sie stellt eine bedeutsame Erweiterung
des methodischen Repertoirs dar, macht jedoch keineswegs die klassi-
schen Verfahren der Mikroanalyse überflüssig. Ihre Bedeutung liegt
vor allem auf der qualitativen Anwendung, während sie infolge der
IV Vorwort.
relativ großen Fehlerbreite als semi-quantitativ bezeichnet werden muß.
Die papierchromatographische Technik ist in der Hand des geübten
Experimentators eine wertvolle Ergänzung und Erweiterung der analy-
tischen und präparativen Möglichkeiten. Eine stärkere Berücksichtigung
und Einführung in die Handhabung durch den akademischen Unter-
richt dürfte daher wünschenswert sein.
Für die "Überlassung von Abbildungsvorlagen sagen wir Dank Herrn Professor
D. VON DENFFER (Gießen), Herrn Dr. BENBON (Californien), Herrn Dozenten Dr.
SmrüMMELFEDER (Bonn). Die Vorlagen zu den übrigen Abbildungen wurden von
Herrn ARNo VON HöLLERT in einheitlicher Technik umgezeichnet.
Für die Durchsicht einzelner Teile des Manuskriptes danken wir den Herren
Prof. Dr. H. ERDTMAN (Stockholm), Prof. Dr. H. ERLENMEYER (Basel), Prof. Dr.
F. G. FISCHER (Würzburg), Prof. Dr. R. PoHL (Freiburg), Frau Dr. A. GRÜNE
(Velbert), Herrn Dr. H. TIETZ (Leverkusen), Herrn Dr. G. WERZ (Wilhelmshaven)
und Herrn Studienreferendar S. BELLARTZ (Köln).
Die Abschnitte "Isotopentechnik", "Wachstumsregulatoren" und "Anti-
biotica" wurden vom Herausgeber aus dem Englischen übersetzt.
Köln, im Januar 1955. H. F 0 LINSKENS
Inhaltsverzeichnis.
Allgemeiner Teil. Von H. F. LINSKENS . . . . . I
A. Einrichtung eines papierchromatographischen Laboratoriums I
B. Techniken . . . . . . . . . . 2
I. Eindimensionale Verfahren . 3
1. Die absteigende Methode . 3
2. Die aufsteigende Methode . 4
3. Die Mikro-Methode . . . 5
II. Zweidimensionale Verfahren. 5
III. "Mehrdimensionales" Verfahren 6
IV. Rundfilter-Verfahren. 7
V. Papierelektrophorese 9
C. Papiere 10
D. Aufbereitung . . . . 15
I. Extraktion . . 15
II. Störsubstanzen 15
1. Entsalzen. . . . . . 16
2. Entfernen von Lipoiden 18
3. Entfernung von Eiweiß . 18
III. Einengen . . . . . . . . 19
E. Trocknungsanlagen und Sprüher 19
F. Auftragen und Anreicherung, Fehlerquellen . 20
G. Dokumentation . . . . . . . . . . 24
Literatur . . . . . . . . . . . . . 29
H. Isotopentechnik. Von B. D. SANWAL. 30
I. Qualitative Technik . . . . . 30
1. Lokalisierung durch Autoradiographie 30
2. Zählrohrtechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3. Identifizierung von nicht-markierten Substanzen durch Reaktion
mit einem radioaktiven Reagens . . 39
II. Quantitative Technik . . . . . . . . . 40
1. Interpretation des Chromatogramms . 40
a) Nulleffekt ("background activity") 40
b) Handhabung der Proben . . . . . . . . . . . 40
c) Absorption und Selbst-Absorption der Strahlung 41
d) Intensitätsabfall . . . . 41
2. Quantitative Bestimmungen 41
Literatur . . . 42
Spezieller Teil. 43
A. Anorganische Kationen und Anionen. Von H. SEILER und B. PRIJS . 43
I. Aufbereitung des Materials 43
1. Trockene Veraschung. . . • . . . . . . . . . . . . . . 43
VI Inhaltsverzeichnis.
2. Nasse Veraschung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
a) Mit rauchender Salpetersäure . . . . . . . . . . . . . . . 44
b) Mit konzentrierter Schwefelsäure . . . . . . . . . . . . . 44
c) Mit rauchender Salpetersäure und konzentrierter Schwefelsäure 44
3. Soda-Schmelze zur Bestimmung der .Anionen 45
II. Geräte, Papier. . . . . . . 45
111. Methode . . . . . . . . . 46
IV. Lösungsmittel und Rp-Werte 47
V. Nachweis . . . . . . . . . 49
1. Physikalische Methoden . 49
2. Chemische Methoden. . . 49
VI. Quantitative Bestimmungsmethoden 51
1. Bestimmung auf dem Papier . . 51
a) .Auf Grund der Fleckengröße . 51
b) Durch Intensitätsmessungen . 52
2. Isolierung der getrennten Substanzen und anschließende Bestim-
mung . . . . . . . . . . . . 52
3. Spezielle quantitative Methoden . . . . 52
a) .Alkali- und Erdalkali-Ionen . . . . 52
b) Bestimmung von Molybdän . . . . 53
c) Bestimmung von Kupfer und Eisen . 53
Literatur . . . . . . . . . . . 53
B. Kohlenhydrate. Von L. STANGE. . . . . . 54
I. Mono-, Oligosaccharide . . . . . . . 54
1. Verarbeitung des Pflanzenmaterials 54
2. Trennung der Zuckergemische. Lösungsmittel . 55
3. Nachweis der Zucker. . . . . . . . 59
a) .Ammoniakalisches Silbernitrat . . 60
b) Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) 60
c) 3,4-Dinitrobenzoesäure . . . . . 61
d) 3,5-Dinitrosalicylsäure . . . . . . 61
e) Kaliumpermanganat. . . . . . . 61
f) Naphthoresorcin-Trichloressigsäure 64
g) Naphtharesorcin-Phosphorsäure. 64
h) Orcin-Trichloressigsäure . . . . 64
i) Phloroglucin-Trichloressigsäure . 64
k) .Anilin-Phthalsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
I) .Anilin-Phosphorsäure. . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
m) m-Phenylendiamin . . . . 65
n) p-.Amino-Dimethylanilin . . 65
o) p-.Anisidin-Phosphorsäure . 66
p) ß-Naphthylamin . . . . . 66
q) Benzidin-Trichloressigsäure. 66
r) p-.Amino-Hippursäure . . 67
s) Harnstoff-Salzsäure . . . 67
t) 2,4-Dinitrophenylhydrazin 67
4. Quantitative Bestimmung . 67
a) Visueller Vergleich . . . . . 68
b) Bestimmung nach der Fleckengröße . . . . . . . . . . . . 68
c) Photometrische Bestimmung des gebildeten Farbstoffes . . . 68
d) Extraktion des Zuckers und anschließende Mikrobestimmung 69
cx) Oxydation mit dem Kupferreagens nach SOMOGYI . 70
ß) Perjodat-Oxydation . . . . . . . . . . . . . . 70
y) Kolorimetrische Bestimmung nach SoMOGYI-NELSON 70
!5) Kolorimetrische Bestimmung mit .Anilin-Phthalsäure 70
e) Kolorimetrische Bestimmung mit Diphenylamin . . . 70
C) Benzidin-Essigsäure . . . . . . . . . . . . . . . 71
Inhaltsverzeichnis. VII
II. Zucker-Derivate . 71
1. Urensäuren . . 71
2. Zuckeralkohole 71
3. Aminozucker . 73
4. Zucker-Phosphorsäure-Ester. 74
5. Methylzucker 77
III. Polysaccharide. . . . . . . . 78
Literatur . . . . . . . . . . . . . 80
C. Organische Säuren. Von H. ScHWEPPE. 82
I. Aufbereitung . . . . . . . . . 82
1. Extraktionsmittel . . . . . . 82
2. Entfernung von Begleitsubstanzen . 83
II. Zweckmäßige Technik . . . . . 83
1. Pap iersorten . . . . . . . . . . 83
2. Lösungsmittel. . . . . . . . . . 84
a) Saure Lösungsmittelsysteme . . 85
b) Basische Lösungsmittelsysteme . 86
3. Reinigung der Lösungsmittel . . . 87
III. Trennung der niederen Fettsäuren . . 87
IV. Trennung der niederen Fettsäuren in Form von Derivaten 88
1. Hydroxamsäuren . . . . . . . . . . . 88
2. Hydrazide . . . . . . . . . . . . . . 89
V. Trennung nichtflüchtiger aliphatischer Säuren 90
VI. Trennung höherer Fettsäuren . . . . . . . 92.
1. Fettsäuren in unveresterter Form . . . . . . . 93
2. Bestimmung von esterartig gebundenen Fettsäuren 94
ot) Herstellung von Acetylpapier . . . . . . . . 94
ß) Vorbereitung eines Fettes zur Chromatographie 94
VII. Trennung der Ketosäuren . . . . . . . . . . . . . 95
Arbeitsvorschrift zur Trennung der Ketosäuren als 2,4-Dinitro-
phenylhydrazone. . . . . . . . . . . . . . . . . 96
VIII. Trennung aromatischer Säuren . . . . . . . . . . 96
IX. Quantitative Verfahren zur Bestimmung organischer Säuren 97
1. Auswertung der Fleckengröße . . . . 97
2. Andere quantitative Bestimmungen . . 97
Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
X. Flechtensäuren. Von C. A. WACHTMEISTER 99
1. Aufbereitung . . . . . . . 99
a) Extraktion . . . . . . . 99
b) Hydrolyse . . . . . . . 100
ot) Alkalische Hydrolyse . 100
ß) Saure Hydrolyse . . . 100
2. Zweckmäßige Technik . . . 100
a) Imprägnierung von Papier 101
b) Chromatographie 101
3. Nachweis . . . . 102
4. Fehlerquellen . . . 104
Literatur . . . . . . . . . 104
D. Proteine und ihre Bausteine. Von H. DöRFEL. 105
I. Aminosäuren . . . . . . . . . . 105
1. Die Analysenlösung . . . . . . 105
a) Extraktion von Aminosäuren 105
b) Eiweißhydrolyse . . . . . . 105
c) Entsalzung. . . . . . . . . 106
VIII Inhaltsverzeichnis.
2. Qualitativer Nachweis . . . 108
a) Chromatographierpapier . 108
b) Chromatographiergefäße . 108
c) Lösungsmittel . . . . . . 109
d) Zweidimensionale Trennungen 110
e) Eindimensionale Trennungen . . . . . . . . . . 117
f) Farbreaktionen der Aminosäuren auf Filterpapier . . . . . 119
g) Die Unterscheidung von D- und L-Formen der Aminosäuren . 120
h) Identifizierung der Farbflecken auf den Chromatogrammen . 120
3. Quantitative Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
a) _Pho~ometrierung des Kupferkomplexes der Ninhydrinfärbung
m Losung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
b) Direkte Photometrierung der Farbstoffe auf dem Papier . . 124
c) Die "Maximum Density"-:(\'lethode ............ 126
d) Extraktion der Aminosäuren aus dem Papier und Umsetzung
mit Ninhydrin in Lösung. . . . . . . ; 126
e) Photometrierung von DNP-Aminosäuren. 128
Il. Peptide . . . . . . . . . . . . 129
I. Chromatographische Trennung 129
a) Chromatographierpapier . . 130
b) Verteilungsmedien . . . . 130
c) Rp-Werte . . . . . . . . 130
2. Identifizierung . . . . . . . . 132
a) Die Lokalisation der Peptide . 132
b) Die Elution der Peptide . . . 133
c) Hydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
d) Endgruppenbestimmung durch Desaminierung . . . . . . . 134
e) Endgruppenbestimmung mit Dinitrofluorbenzol nach SANGER 134
Literatur . . . . . . . . . . . . . 134
III. Enzyme. Von H. F. LINSKENS. 135
1. Gewinnung der Extrakte 135
2. Lösungsmittel . . . . . . . 136
3. Rp-Werte. . . . . . . . . 136
4. Besondere Arbeitsbedingungen 136
5. Papierelektrophorese . 137
6. Nachweisreaktionen 137
a) Amylase ... 138
b) Phosphatase . 138
c) Phosphorylase 139
d) Lipase .•. 139
e) Maltase .. 139
f) Invertase . 139
g) Peptidasen . 140
·-
h) Urease ... 140
i) Proteinase . . . . . . 141
k) Polygalakturonesterase 141
1) Pektinesterase 141
m) Pepsin ...... . 142
Literatur ........... . 142
E. Nucleinsäuren und ihre Bausteine. Von H. F. LINSKENS 142
I. Extraktion von RNS und DNS . . 142
I. Extraktion mit Trichloressigsäure 143
2. Extraktion mit Perchlorsäure . • 143
3. Extraktion durch Salzlösungen . 143
II. Papierelektrophorese der Nucleinsäuren . 144
Inhaltsverzeichnis. IX
III. Hydrolyse der Nucleinsäuren ..... 144
I. Hydrolyse zur Freisatzung von Purinen. . 145
2. Hydrolyse zur Freisatzung der Pyrimidine 145
3. Hydrolyse auf Nucleotide . . . . . 145
4. Hydrolyse auf Nucleoside . . . . . 145
IV. Papierchromatographische Trennung . 145
I. Nucleotide und Nucleoside ... . 145
a) Nachweisreaktionen ....... . 147
b) Papierelektrophorese der Nucleotide. 147
2. Purine und Pyrimidine ..........• 148
Nachweisreaktionen für Purine und Pyrimidine 148
V. Quantitative Bestimmung. 152
Literatur. 152
F. Wirkstoffe 153
I. Wachstumsregulatoren und verwandte Stoffe. Von S. P. SEN 153
I. Analyse von bekannten Stoffen 153
a) Geräte. . . . . . . 153
b) Papiere . . . . . . . . . 155
c) Lösungsmittel . . . . . . 155
d) Nachweisreaktionen . . . . 158
e) Die Reagentien . . . . . . 158
2. Analyse von unbekannten Substanzen 159
a) Extraktionsmethode. . . 159
b) Fraktionierung . . . . . 160
c) Bioautographie . . . . . 161
3. Quantitative Bestimmungen. 165
a) Mikrochemische Methoden 165
b) Biologischer Test . . . . 167
4. Molekulargewichts-Bestimmungen 167
5. "Tracer"-Methodik. . 168
6. Papierelektrophorese . . . . 168
Literatur . . . . . . . . . . . . . 169
II. Vitamine. Von H. F. LrnsKENS 170
Der mikrobiologische Test . 170
I. Vitamine des B-Komplexes 172
a) Lösungsmittel .. . 172
b) Nachweise .... . 172
c) Papierelektrophorese. 173
2. Vitamin C . . . . . . 173
Nachweisreagentien . . 174
Quantitative Methode . 175
3. Nicotinsäure und -derivate 176
Extraktgewinnung 176
RF-Werte ..... 176
Nachweisreaktionen 177
4. Pantothensäure . . 178
5. Biotin ..... o 178
6. p-Aminobenzoesäure 179
7. Vitamin D 179
8. VitaminE 180
Literatur. o o •• 180
X Inhaltsverzeichma.
G. Hemmstoffe 181
I. Antibiotica. Von S. YAMATODANI 181
1. Vorbereitung der Proben . . . 181
2. Material und Arbeitsbedingungen 182
3. Rp-Werte nnd Positions-Konstanten 184
4. Nachweismethoden ...•.. 185
a) Mikrobiologischer Nachweis ... 185
oc) Versuchsgefäße . . . . . . . 185
ß) Testorganismen . . . . . . . 186
y) Nährböden • . . . · . . . . . . 186
!5) Vorbereitung der Versuchsplatten 187
e) Nachweisverfahren ...... . 187
b) Farbnachweise . . . . . . . . . . 188
oc) Für Streptomycine . . . . . . . . . . . . 188
ß) Für Chloromycetin und seine Abbauprodukte 189
y) Für Tetracycline ............ . 189
c) Fluorescenz-Nachweis ........... . 190
5. Quantitative Bestimmung . . . . . . . . . . . 190
6. Sammel-Chromogramme ("summarized papergrams") 191
7. Papierelektrophorese . . . . 192
Literatur ............ . 193
II. Welketoxine. Von H. ZÄHNER. 194
1. Lycomarasmin 194
2. Fusarinsäure 195
3. Diaporthin 196
Literatur ..... . 197
H. Pigmente . . . . . . 197
I. Strukturgebundene Farbstoffe. Von H. F. LrNSKENS . 197
1. Chloroplastenfarbstoffe . . . . 197
a) Vorbereitung der Proben .. 197
b) Lösungsmittel . . . . . . 198
c) Chromatogramme ..... 198
d) Besondere Arbeitsmethoden 200
e) Quantitative Bestimmung . 201
2. Chromoproteide . . . . . . . 201
Literatur ............. . 201
II. Zellsaftlösliche Pigmente. Von R. HXNSEL 202
1. Extraktion des Pflanzenmaterials 202
2. Chromategraphische Technik 203
3. Lösungsmittel . . . . 205
4. Nachweisreagentien . . 206
a) Eisen-III-chlorid . . 206
b) Aluminiumchlorid . 207
c) Andere Metallsalze . 207
d) BENEDmTs Reagens . . . . . . . . 210
e) Reaktion nach WILSON und TAUBÖCK 210
f) Azo-Reaktion. • . 211
g) Reduktionsproben. . . . . . . . . 212
5. RF-Werte. . . . . . . . . . . . . . 213
6. Vergleichssubstanzen. . . . . . . . . 213
7. Anwendungsbeispiel . . . . . . . . . 217
a) Chromategraphische Fraktionierung. 218
b) Qualitative Hydrolyse ...... . 218
c) Quantitative Hydrolyse ..... . 218
d) Stellung der Zuckerreste im Molekül. 219
Literatur ................. . 219