Papierchromatographie in der Botanik PDF
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PAPIERCHROMATOGRAPHIE IN DER BOTANIK BEARBEITET VON U. BEISS . H. DORFEL . K. FUJISA W A . R. HÄNSEL . A. HAGER H. R. HOHL' H. F. LINSKENS . H. MACHLEIDT . K. MAKINO G. MARTEN . G. A.]. VAN OS . B. PRIJS . H. W.]. RAGETLI A. ROMEIKE . B. D. SANWAL' H. SCHWEPPE . H. SEILER' S. P. SEN L. STANGE' E. STEIN VON KAMIENSKI . C. A. WACHTMEISTER ]. P. H. VAN DER WANT' S. YAMATODANI HERAUSGEGEBEN VON H. F. LINSKENS ZWEITE, ERWEITERTE AUFLAGE MIT 124 ABBILDUNGEN UND 2 FARBTAFELN SPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG GMBH ISBN 978-3-642-87771-1 ISBN 978-3-642-87770-4 (eBook) DOI 10.1007/978-3-642-87770-4 Alle Rechte, insbesondere das der Übersetzung in fremde Sprachen, vorbehalten Ohne ausdrückliche Genehmigung des Verlages ist es anch nicht gestattet, dieses Buch oder Teile daraus auf photomechanischem Wege (Photokopie, Mikrokopie) zu vervielfältigen © by Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1959 Ursprünglich erschienen bei Springer-Verlag Berlin· Göttingen • Heidelberg 1959 Softcover reprint ofthe hardcover 2nd edition 1959 DieWiedergabe von Gebrauchsnamen,Handelsnamen,Vlarenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinn der Warenzeichen- und Markenschutz Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürfen Vorwort Die papierchromatographische Methode hat auf Grund ihres relativ geringen apparativen Aufwandes, des zu erzielenden hohen Trenneffektes und der zur Analyse benötigten geringen Substanzmengen neue Aspekte für die biochemische Analyse im biologischen Laboratorium geboten. Zahlreiche Probleme sind in Angriff genommen worden, die auf Grund des geringen zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterials einer experi mentellen Untersuchung früher nicht zugänglich waren. Vorliegende Dar stellung bringt in 2. Auflage die Anwendung papierchromatographischer Techniken für diejenigen Substanzen, die im Rahmen botanisch-bio chemischer Fragestellungen von Interesse sind. Die Bearbeiter verfügen jeweils über eigene experimentelle Erfahrung im Bereich der dargestellten Stoffgruppe. Die Methoden und ihre Anwendung auf pflanzliche Objekte sind so ausführlich dargestellt, daß ein Nacharbeiten im allgemeinen ohne Hinzuziehen der Originalliteratur möglich ist. Es wurde wiederum nicht angestrebt, alle bisher beschriebenen Methoden zu erfassen. Vielmehr sind die brauchbarsten und erprobten Arbeitsgänge unter besonderer Berück sichtigung der Aufarbeitungsverfahren zusammengetragen. Bezüglich einer ausführlichen theoretischen Grundlegung und der zahlreichen ständig neu entwickelten apparativen Möglichkeiten sei auf die zusammenfassenden Darstellungen in der Bibliographie verwiesen. Mit allem Nachdruck muß wiederum auf die Grenze der papier chromatographischen Methodik hingewiesen werden. Es hat sich in den vergangenen Jahren gezeigt, daß sie zwar eine bedeutsame Erweiterung des methodischen Repertoirs besonders für den Biologen darstellt, jedoch keineswegs die klassischen Verfahren der Mikroanalyse überflüssig macht. Die Stärke liegt vor allem in der Kombination mit anderen chromato graphischen und mikroanalytischen Verfahren. Hinsichtlich der quanti tativen Anwendung muß die Papierchromatographie auf Grund ihrer großen Fehlerbreite als semi-quantitativ bezeichnet werden. Entschei dend für den Erfolg der Anwendung der Papierchromatographie ist wie bei allen experimentellen Arbeiten das Geschick und die Erfahrung des Experimentators. Eine Einführung in die Handhabung der Papier chromatographie im Rahmen des akademischen Unterrichts ist daher für alle jene Wissenschaftler und Praktiker, die sich mit der Zusammen setzung, dem Stoff- und Formwechsel sowie der Anwendung pflanzlicher Stoffe beschäftigen, von großer Bedeutung. Für die Überlassung von Abbildungsvorlagen danken wir den Herren Dr. J. BARROLLIER (Berlin), Dr. G. BAZZIGHER (Zürich), Dr. A. BENsoN (Berkeley), Prof. Dr. D. VON DENFFER (Gießen), Dr. R. NEHER (Basel)!, 1 Die Abbildungen 8, 9, 31, 40, 43 wurden bereits im J. Chromatogr. 1, 122 (1958) veröffentlicht IV Vorwort Prof. Dr. K. A. PIEZ (Bethesda), Dozent Dr. SCHÜMMELFEDER (Bonn), Dr. Y. TSUJISAKA (Osaka), Prof. Dr. F. TURBA (Würz burg), Prof. Dr. A. 1. VIRTANEN (Helsinki), sowie der Schweizerischen Botanischen Ge sellschaft, der Firma E. MERCK (Darmstadt), der Firma LKB-Produkter AB (Stockholm) und dem Archiv des Springer-Verlages (Heidelberg). Zu Dank verpflichtet für die Durchsicht einzelner Teile des Manu skriptes und für wertvolle kritische Hinweise sind wir: Frau Dr. A. LA COURT (Brüssel), den Herren Dr. O. ARMBRUSTER (Köln), Dr. G. BAz ZIGHER (Zürich), Prof. Dr. F. CRAMER (Heidelberg), Dr. M. LEDERER (ArcueiljSeine), Dr. R. NEU (Karlsruhe-Durlach), Prof. Dr. R. PARIS (Paris), PD Dr. H. REZNIK (Heidelberg). Bei der Durchsicht der Korrekturen haben die Herren Dr. W. HEINEN und Dr. C. STUMM (Nijmegen) geholfen. Die Vorlagen zu den übrigen Abbildungen wurden von Herrn A. VON HÖLLERT (Köln) und der Abteilung Med. Illustration der Universität Nijmegen umgezeichnet. Die Abschnitte "Flechtensäuren", "Ascorbinsäure" und "Toco pherole" wurden vom Herausgeber überarbeitet; die Kapitel "Theorie der Papierchromatographie" , "Isotopentechnik", "Wachstumsregula toren", "Antibiotica" und "Nucleinsäuren" aus dem Englischen bzw. Niederländischen übersetzt. NijmegenjNe derland Botanisches Laboratorium der R. K. Universität H. F. LINSKENS Inhaltsverzeichnis Allgemeiner Teil A. Theorie der Papierchromatographie. Von G. A. J. VAN OS 1 1. Einleitung. . . . . . 1 2. Die CRAIG-Methode. . . 1 3. Papierchromatographie . 4 Literatur. . . . . . . . . . 8 B. Einrichtung eines papierchromatographischen Laboratoriums. Von H. F. LINSKENS . . . . . 8 1. Arbeitsraum . . . . . 8 2. Dunkelraum . . . . . 9 3. Chromatographieraum 9 C. Techniken. Von H. F. LINSKENS . 12 I. Eindimensionales Verfahren 13 1. Die absteigende Methode 13 2. Die aufsteigende Methode . 13 3. Die Mikromethode . . . . 14 H. Zweidimensionale Verfahren. 14 IH. Mehrdimensionale Verfahren. 17 IV. Rundfilter-Technik. . . . . 18 V. Präparative Papierchromatographie. 20 VI. Papierelektrophorese . . 21 D. Papiere. Von H. F. LINSKENS. . 24 Sonderpapiere . . . . . . 29 1. Hydrophobierte Papiere. 29 2. Carboxyl.Papiere. . . . 31 3. Austauscher.Papiere . . 31 E. Aufbereitung. Von H. F. LINSKENS 31 I. Extraktion . . 31 H. Störsubstanzen. . . . . . 32 1. Entsalzen. . . . . . . 32 2. Entfernen von Lipoiden 34 3. Entfernen von Eiweiß . 34 IH. Einengen . . . . . . . . 35 F. Auftragen und Trocknen. Von H. F. LINSKENS 35 G. Fehlerquellen. Von H. F. LINSKENS . . . . . 40 H. Auswertung und Dokumentation. Von H. F. LINSKENS . 42 Literatur. . . . . . . . . . . . 48 J. Isotopentechnik. Von B. D. SANWAL . . . . . 50 I. Qualitative Technik . . . . . . . . . 51 1. Lokalisierung durch Autoradiographie ... 51 Arbeitsgänge zur Identifizierung unbekannter radioaktiver Substanzen in einem Gemisch. . . . . . . . . . . . .. 52 a) Einbau der Isotopen in den pflanzlichen Organismus. . 52 b) Extraktion und Identifikation. . . . . . . . . . . . . . 53 VI Inhaltsverzeichnis 2. Zählrohrtechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Analyse einer Mischung von Stoffen mit der Leitisotopen. Technik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 a) Identifizierung nicht markierter Stoffe mit der Leitisotop- Derivat-Technik. . . . . . . . . . . . . . . . . 59 b) Identifizierung von nicht· markierten Substanzen durch Reaktion mit einem radioaktiven Reagens 60 H. Quantitative Technik. . . . . . . . . 61 1. Interpretation des Chromatogramms . . . . . 61 a) Nulleffekt ("background activity"). . . . . 62 b) Handhabung der Proben . . . . . . . . . 62 c) Absorption und Selbst.Absorption der Strahlung. 62 d) Intensitätsbefall . . . . . . . . 62 2. Quantitative Bestimmungen 63 a) Isotop.Derivat.Indicator-Technik 63 b) Kupfer.Chelat. Technik . 64 Literatur .. 65 Spezieller Teil A. Anorganische Kationen und Anionen. Von H. SEILER und B. PRIJS 66 1. Aufbereitung des Materials 66 1. Trockene Veraschung .... . 66 2. Nasse Veraschung ..... . 66 a) Mit rauchender Salpetersäure 67 b) Mit konz. Schwefelsäure .. 68 c) Mit rauchender Salpetersäure und kom:. Schwefelsäure 68 3. Soda-Schmelze zur Bestimmung der Anionen 68 H. Papier, Geräte. . . . . . . . 69 1. Papier und dessen Reinigung 69 2. Pipetten, Büretten. . . . 69 IH. Methode . . . . . . . . . 70 IV. Lösungsmittel und Rp-Werte 71 V. Nachweis . . . . . . . . 76 1. Physikalische Methoden 76 a) Radioaktive Isotope . 76 b) Colorimetrische Methode 76 c) Spektrographische Analyse 76 2. Chemische Methoden. . . . 76 VI. Quantitative Bestimmungsmethoden 78 1. Bestimmung auf dem Papier. . . 78 a) Auf Grund der Fleckengröße . 78 b) Durch Intensitätsmessung 79 2. Isolierung der getrennten Substanzen und anschließende Be- stimmung. . . . . . . . . . 79 3. Spezielle quantitative Methoden . . . 79 a) Alkali- und Erdalkali-Ionen. . . . 79 b) Bestimmung von Molybdän. . . . 80 c) Bestimmung von Kupfer und Eisen 80 Literatur. . . . . . . . . 80 B. Kohlenhydrate. Von L. STANGE ..... . 81 I. Mono-, Oligosaccharide . . . . . . . 81 1. Verarbeitung des Pflanzenmaterials 81 2. Trennung der Zuckergemische. Lösungsmittel 82 3. Nachweis der Zucker. . . . . . . . 87 a) Ammoniakalisches Silbernitrat . . 87 b) Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) . 88 Inhaltsverzeichnis VII c) 3,4-Dinitro-bcnzoesäure 88 d) 3,5-Dinitrosalicylsäure 88 e) Kaliumferricyanid _ . . 89 f) Natriumperjodat. . . . 89 g) Kaliumpermanganat . . 89 h) Naphthoresorcin-Trichloressigsäure 89 i) Naphthoresorcin-Phosphorsäure 92 k) Orcin-Trichloressigsäure 92 1) Phloroglucin-Trichloressigsäure 92 m) Anilin-Phthalsäure. . . 93 n) Anilin-Phosphorsäure. . . 93 0) m-Phenylendiamin. . . . 93 p) p-Amino-dimethylanilin 93 q) p-Anisidin-Phosphorsäure . 94 r) ß-Naphthylamin. . . . . 94 s) Benzidin-Trichloressigsäure 94 t) p-Amino-Hippursäure . . 95 u) Harnstoff-Salzsäure . . . 95 v) 2,4-Dinitrophcnylhydrazin 95 4. Quantitative Bestimmung 95 a) Visueller Vergleich. . . . 96 b) Bestimmung nach der Fleckengröße 96 c) Photometrische Bestimmung des gebildeten Farbstoffes. 96 d) Extraktion des Zuckers und anschließende Mikrobestimmung 97 ()() Oxydation mit dem Kupferreagens nach S0l\10GYI. . 98 ß) Perjodat-Oxydation . . . . . . . . . . . . . . . 98 y) Colorimetrische Bestimmung nach SOl\1oGYI-NELSON . 98 ö) Colorimetrische Bestimmung mit Anilin-Phthalsäure. 98 E) Colorimetrische Bestimmung mit Diphenylamin 98 C) Colorimetrische Bestimmung mit Anthron 99 11. Zucker-Derivate . 99 1. Uronsäuren . . 99 2. Zuckeralkohole 100 3. Aminozucker . 101 4. Zucker-Phosphorsäure-Ester . 103 5. Methylzucker 105 III. Polysaccharide. 107 Litcratur. . . . . 108 c. Organische Säuren. Von H. SCHWEPPE 110 1. Aufbereitung . . . . . . . . 110 1. Extraktionsmittel . . . . . 110 2. Entfernung von Begleitsubstanzcn III II. Zweckmäßige Technik III 1. Papiersorten lli 2. Lösungsmittel. . . 112 a) Saure Lösungsmittelsysteme 113 b) Basische Lösungsmittelsysteme 114 e) Lösungsmittel zur Trennung von Säurederivaten 115 3. Reinigung der Lösungsmittel. . 116 III. Trennung der niederen Fettsäuren 116 1. Hydroxamsäuren . _ . . . . 118 2. Hydrazide . . . . . . . . . 118 IV. Trennung nichtflüchtiger aliphatischer Säuren 119 VIII Inhaltsverzeichnis V. Trennung höherer Fettsäuren . . . . . 122 1. Fettsäuren in unveresterter Form . . 122 a) Trennung der Fettsäuren von C 10 bis C 26 122 b) Trennung der Fettsäuren von C 16 bis C 32 nach dem Allyl- ester-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . 124 2. Bestimmung von esterartig gebundenen Fettsäuren 125 VI. Trennung der Ketosäuren. . . . . . . . . 126 1. Trennung als Chinoxalin-Derivate . . . . 127 2. Trennung als 2,4-Dinitrophenylhydrazone . 127 3. Trennung als Aminosäuren . . . . . . . 127 VII. Trennung aromatischer Säuren. . . . . . . 128 VIII. Quantitative Verfahren zur Bestimmung organischer Säuren. 129 1. Auswertung der Fleckengröße . . . . . . . . . . . . 129 2. Photometrische Bestimmung des gebildeten Farbstoffes. 130 3. Andere quantitative Bestimmungsmöglichkeiten 131 Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . 131 IX. Flechtensäuren. Von C. A. WAOHTMEISTER. 135 1. Aufbereitung . . . . . . 135 a) Extraktion . . . . . . 135 b) Hydrolyse . . . . . . 135 IX) Alkalische Hydrolyse 135 ß) Saure Hydrolyse . . 136 2. Zweckmäßige Technik . . 136 a) Imprägnierung von Papier 136 b) Chromatographie 136 3. Nachweis . . . 138 4. Dokumentation 139 5. Fehlerquellen . 140 Literatur. . . . . . 141 D. Phosphatide und komplexe Lipide. Von U. BEISS 141 I. Verarbeitung des Pflanzenmaterials . 142 II. Papierchromatographie 144 1. Lösungsmittel. . . 144 2. Chromatogramme . 144 3. Nachweisreaktionen 145 III. Papierelektrophorese . 147 Literatur. . . . . . . . 147 E. Proteine und ihre Bausteine 148 I. Aminosäuren. Von H. DÖRFEL . 148 1. Die Analysenlösung . . . . . 148 a) Extraktion von Aminosäuren 148 b) Eiweißhydrolyse . . . . 149 c) Entsalzung . . . . . . 150 2. Qualitativer Nachweis . . 151 a) Chromatographierpapier 151 b) Chromatographiergefäße 152 c) Lösungsmittel. . . . . 152 d) Zweidimensionale Trennungen. 154 e) Eindimensionale Trennungen . 162 f) Farbreaktionen der Aminosäuren auf Filterpapier 164 g) Die Unterscheidung von D- und L-Formen der Aminosäuren. 169 h) Identifizierung der Farbflecken auf den Chromatogrammen 169 i) Einige Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 170 Inhaltsverzeichnis IX 3. Quantitative Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 a) Photometrierung des Kupferkomplexes der Ninhydrinfärbung in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 b) Direkte Photometrierung der Farbstoffe auf dem Papier . . . 174 c) Die "Maximum Density"-Methode ............. 176 d) Extraktion der Aminosäuren aus dem Papier und Umsetzung mit Ninhydrin in Lösung . . . . . . . 176 e) Photometrierung von DNP-Aminosäuren 178 11. Peptide. Von H. DÖRFEL . . . . 179 1. Chromatographische Trennung. 179 a) Chromatographierpapier 179 b) Verteilungsmedien . . . . . 180 c) RrWerte. . . . . . . . . 180 2. Identifizierung. . . . . . . . 181 a) Die Lokalisation der Peptide 182 b) Die Elution der Peptide . . 182 c) Hydrolyse . . . . . . .. . 183 d) Endgruppenbestimmung durch Desaminicrung. 183 e) Endgruppenbestimmung mit Dinitrofluorbenzol nach SANGER 183 Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 IH. Proteine und Proteide. Von H. F. LINSKENS . 185 1. Extraktion und Trennung. 185 2. Nachweise. . . . . . . . 186 IV. Enzyme. Von H. F. LINSKENS 189 1. Gewinnung der Extrakte 189 2. Lösungsmittel . . . . 189 3. RrWerte . . . . . . 189 4. Papierelektrophorese . 190 5. Nachweis-Reaktionen. 190 a) Amylase . . . 191 b) Phosphatase . 191 c) Phosphorylase. 192 d) Carbohydrasen 192 e) Lipase . . 193 f) Katalase . 193 g) Esterasen . 194 h) Proteinase 194 i) Pepsin . . 195 k) Peptidasen 195 1) Urease .. . 195 m) Xanthin-Dehydrase 196 n) Luciferase . . . . 196 6. Enzymaktivität . . . 196 Literatur. . . . . . . . . 197 F. Nucleinsäuren und ihre Bausteine. Von K. FUJISAWA und K. MAKINO 198 1. Isolierung der Nucleinsäuren. . . . . 199 1. Gewinnung von DNS. . . . . . . 199 2. Gewinnung von RNS. . . . . . . 199 3. Gewinnung von Ribonucleinproteid . 200 H. Hydrolyse der Nucleinsäuren 201 1. Hydrolyse von DNS . . . . . 201 a) Hydrolyse mit Perchlorsäure 201 b) Hydrolyse mit Ameisensäure 201 c) Hydrolyse mit Salzsäure . . 201 d) Hydrolyse mit p.üs . . . . 201 x Inhaltsverzeichnis 2. Hydrolyse von RNS . . . . . . . . . . . . . . . . 204 a) Hydrolyse zu Purin- und Pyrimidinbasen . . . . . . 204 b) Hydrolyse zu Purinbasen und Pyrimidin-Nucleotiden 204 c) Hydrolyse zu Nucleotiden. . . . . . . . . . . . . 204 IH. Trennung der NS-Komponenten durch Papier-Elektrophorese 204 1. Trennung der Basen . . . . . . . . . 205 2. Trennung der Nucleoside und Nucleotide . . . . . . . 205 3. Trennung der NS . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 IV. Trennung der NS-Bausteine durch Papierchromatographic 207 1. Lösungsmittel-Systeme 207 2. Papiere. . . . . . . . . . . . . . . . 209 3. RrWerte. . . . . . . . . . . . . . . 209 4. Nachweisreaktionen . . . . . . . . . . 209 a) Nachweis durch Ultraviolett-Absorption 209 b) DIscHE-Reagens. . . . . . 210 c) Modifiziertes DIScHE-Rcagens . . . . . 210 d) Orcein-Perchlorsäure-Reagens. . . . . 210 e) HANES-IsHERwooD-Reagens. . . . . 210 f) Eisenchlorid-Sulfosalicylsäure-Reagens für Nuclcotide 210 g) Perjodatreagens für Nucleoside . . . . . . 211 h) Quecksilber-Nitrat-Reagens für Purin-Basen 211 V. Quantitative Technik. . . . . . . . . . . . . 211 Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 G. Pflanzenviren. Von H. W. J. I~AGETLI und J. P. H. VAN DER WANT 212 I. Einführung . . . . . . . . . . . . . . . 212 H. Gewinnung geeigneter virushaitiger Lösungen 213 II!. Der chromatographische Vorgang. . . . . . 214 IV. Lok,llisierung der Viren im Chromatogramm . 215 V. Papierelektrophorese 217 VI. Ausbaumöglichkeiten 217 Literatur. . . . . . . 218 H. Farbstoffe . . . . . . . . 218 I. Die Chloroplastenfarbstoffe. Von A. HAGER 218 1. Extraktion der Chloroplastenfarbstoffe . 219 2. Die Auftragung des Extraktes. . . . . 220 3. Die Trennung der Farbstoffe am Papier. 221 4. Das Eluieren und Bestimmen der Farbflecke 223 5. Besondere Arbeitsmethoden . . . . . . . . 224 6. Trennung der Chloroplastenfarbstoffe an Glasfaserpapier 226 Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 Ir. Zellsaftlösliche Pigmente (Anthocyane und Flavonoide). Von R.HÄNSEL. . . . . . . . . . . . . 228 1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials 229 2. Lösungsmittel . . . . . . . 230 3. Chromatographische Technik 231 4. Nachweisreagentien 232 a) Alkalische Reagentien 233 b) Eisen-HI-chlorid. . 234 c) Aluminiumchlorid . . 234 d) Andere Metallsalze . . 235 e) BE::"fEDIKTs Reagens . 238 f) Borsäure und aromatische Eorsäuren. 238 g) Azo-Reaktionen . 239 h) Reduktionsproben . . . . . . . . . 241
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