Paola Ximena Dalgo Aguilar DIRECTORA

67 Pages·2012·1.2 MB·English

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja

Titulación de Bioquímico Farmacéutico

“Caracterización de proteínas LEA 3
(Late Embryogenesis Abundant, familia 3) de especies de
Fabáceas”

Trabajo de Fin de Titulación

AUTORA:
Paola Ximena Dalgo Aguilar

DIRECTORA:
Augusta Yadira Cueva Agila, Ph.D.

LOJA – ECUADOR
2012

I
CERTIFICACIÓN

Ph.D.

Augusta Cueva Agila

DIRECTORA DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN

CERTIFICA:

Que el presente trabajo, denominado: “Caracterización de proteínas LEA 3
(Late Embryogenesis Abundant, familia 3) de especies de Fabáceas” realizado
por el profesional en formación: Srta. Paola Ximena Dalgo Aguilar, cumple con
los requisitos establecidos en las normas generales para la Graduación en la
Universidad Técnica Particular de Loja, tanto en el aspecto de forma como de
contenido, por lo cual me permito autorizar su presentación para fines
pertinentes.

Loja, septiembre 2012

f)
CI:
Augusta Cueva Agila, Ph.D

DIRECTORA

II
CESIÓN DE DERECHOS

“Yo Paola Ximena Dalgo Aguilar declaro ser autora del presente trabajo y
eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus
representantes legales de posibles reclamos o acciones legales”.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto
Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte
pertinente textualmente dice: “Forman parte del patrimonio de la Universidad la
propiedad intelectual de investigaciones, trabajos científicos o técnicos y tesis
de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero, académico, o
institucional (operativo) de la Universidad”.

f)
CI:
Paola Ximena Dalgo Aguilar

TESISTA

III
DEDICATORIA

Cada esfuerzo tenas, supone un sacrificio, pero cada sacrifico, nos hace
avanzar a la meta que un día nos fijamos al comienzo de mi vida
estudiantil, y justo es que superando las dificultades y todos los sin
sabores que la vida otorga dedique con amor este proyecto de fin de
carrera a mis queridos padres Jorge y Fanny, por enseñarme la magia
del mundo, amigos que Dios y la vida me regaló.
A mis hermanos Karla y Jorge seres que más quiero en este mundo por
sus acertados consejos y buenos ejemplos.
A mi pequeña sobrina Sofy por alegrarme la vida.
A todos los que creyeron en mí…

IV
AGRADECIMIENTO

Agradezco primeramente a Dios por permitirme soñar y alcanzar mis
metas.

A la Universidad Técnica Particular de Loja, de manera especial a la
Escuela de Bioquímica y Farmacia por brindarnos los conocimientos
teóricos y prácticos que me hicieron un buen profesional.

Al Departamento de Ciencias Naturales por poner a disposición el
material necesario para el desarrollo de este proyecto.

A mi directora de tesis Ph.D. Augusta Cueva, por ser mi maestra y amiga
y compartir conmigo sus sabios conocimientos.

Al Ing. José Miguel Romero por su colaboración en el presente trabajo.

A todos los docentes del Departamento de Ciencias Naturales,
compañeros y pasantes por su apoyo incondicional.

V
ÍNDICE DE CONTENIDOS

CONTENIDO PÁG.
Portada I
Certificación II
Contrato de Cesión de Derecho de Tesis III
Dedicatoria IV
Agradecimiento V
Índice de Contenidos VI
Índice de Figuras VIII
Índice de Tablas VIII
Artículo Científico IX

1. PRESENTACIÓN DEL FIN, PROPÓSITO Y COMPONENTES DEL 1
PROYECTO.
1.1 Fin del proyecto. 1
1.2 Propósito del proyecto. 1
1.3 Componentes del proyecto. 1
2. INTRODUCCIÒN. 2
2.1 Almacenamiento de semillas forestales 2
2.1.1. Clasificación de las semillas según requerimientos para
2
almacenaje.
2.2 Estrés hídrico. 3
2.3 Tolerancia a la deshidratación. 5
2.4 Embriogénesis. 6
2.5 Late Embryogenesis Abundant Proteins (LEA). 8
2.5.1 Clasificación de las proteínas LEA. 9
2.5.2 Estructura de las proteínas LEA. 10
2.5.3 Funciones fisiológicas de las proteínas LEA. 10
3. MATERIALES Y MÉTODOS. 12
3.1. Selección de especie. 12
3.2. Extracción de ADN. 13
3.3. Diseño y estandarización de controles positivos. 13
3.3.1. Estandarización de genes de referencia. 14
3.3.2. Caracterización de actina. 14
3.4. Extracción de ARN y síntesis de cDNA. 14
3.5. Cebadores para la amplificación de proteínas LEA3. 15
VI
3.6. Amplificación mediante PCR. 15
3.7. Electroforesis. 15
3.8. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. 16
3.8.1. Cepas bacterianas. 16
3.9. Cloning y amplificación de productos. 16
3.10. Protocolos de transformación. 16
3.10.1. Shock Térmico. 16
3.11. Extracción de ADN plasmídico. 17
3.12. Digestión enzimática. 17
3.13. Secuenciación. 17
3.14. Análisis de secuencias nucleotídicas. 18
4. RESULTADOS 19
4.1. Extracción de ADN. 19
4.2. Diseño y estandarización de controles positivos. 20
4.2.1. Estandarización de genes de referencia. 20
4.2.2. Caracterización de actina. 22
4.3. Extracción de ARN y síntesis de cDNA. 25
4.4. Cebadores para la amplificación de proteínas LEA 3. 26
5. DISCUSIÓN. 29

6. CONCLUSIONES. 32

7. ANEXOS. 33

7.1. Protocolo de extracción de ADN genómico (Wisard® de Promega). 33
7.2. Protocolo de extracción de ARN (kit Plant Rneasy Mini de Quiagen). 34
7.3. Protocolo de síntesis de cDNA (Applied Biosystem). 35
7.4. Protocolo de Cloning (kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning de
36
Invitrogen).
7.5. Protocolo de extracción de ADN plasmídico (kit GenEluteTMHP 37
plasmid miniprep de Sigma Aldrich).

VII
ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURAS. PÁG.
1. Hipótesis de señalización para la inducción de genes específicos. 5
2. Fases de la embriogénesis. 7
3. Semillas deshidratadas de la familia Fabaceae. 12
4. Vector TOPO Blunt II. 16
5. ADN de las especies Senna alata y Senna mollisima. 19
6. Productos amplificados de la especie Senna alata con distintos
21
cebadores.
7. Productos amplificados de la especie Senna mollisima con distintos
22
cebadores.
8. Producto de PCR de la especie Caesalpinea spinosa. 22
9. ADN de la especie Caesalpinea spinosa. 23
10. ARN de las especies Caesalpinea spinosa y Senna mollisima. 25
11. Producto de PCR-Touch down de la especie Caesalpinea spinosa. 27
12. Producto de PCR anidada de la especie Caesalpinea spinosa. 27

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA. PÁG.
1. Clasificación de las proteínas LEA. 9
2. Especies de Fabáceas con diferente porcentaje de deshidratación y
13
comportamiento de conservación.
3. Cebadores utilizados para la estandarización de actina en especies de
20
Fabáceas.
4. Secuencia de nucleótidos a partir de los cuales se predijo la proteína
23
actina de la especie Caesalpinea spinosa.
5. Porcentaje de aminoácidos en la proteína analizada. 24
6. Relación de la proteína actina de la especie Caesalpinea espinosa con
25
proteína actina de otras especies.
7. Cebadores para la amplificación de las proteínas LEA, familia 3. 28
8. Similaridad de la proteína codificada por las secuencias amplificadas con
29
los cebadores seleccionados con otras proteínas caracterizadas.

VIII
RESUMEN

Uno de los principales problemas en el almacenamiento de semillas es que no toleran
condiciones de deshidratación extrema. La acumulación de proteínas LEA (Por sus
siglas en inglés, Late Embryogenesis Abundant) ha sido relacionada con la capacidad
para tolerar condiciones de desecación durante el desarrollo vegetal y en la última
etapa de desarrollo de la semillas, por lo que la caracterización y estudio funcional de
estas proteínas es de gran importancia en la conservación de semillas a largo plazo.
En el presente estudio se realizaron varios ensayos con el fin de caracterizar una
proteína LEA familia 3 en semillas con distinto porcentaje de deshidratación y diferente
comportamiento de conservación, en especies de fabáceas Senna alata, Senna
mollisima y Caesalpinea spinosa. Para la estandarización del método se secuenció un
gen de ACTINA de la especie Caesalpinea spinosa con un cebador diseñado para el
presente estudio: Actin_Syzy-Fw GCTGGATTCTGGTGATGGTG, Actin_Syzy-Rv
TGGTTGGAACAGGACCTCTG. La caracterización del gen codificante para proteínas
LEA se realizó con cebadores degenerados obtenidos de un estudio realizado por Yu.
et al. 2010. Se obtuvo una proteína asociada a hidrolasa sugiriendo que las
condiciones de almacenamiento como la humedad relativa y la temperatura
provocaron que las semillas reasuman su actividad metabólica.

Palabras clave: Late Embryogenesis Abundant Proteins (LEA), condiciones de
conservación, gen ACTINA, proteínas hidrolasas asociadas a la pared celular.

IX
UNIVERSIDAD TÉCNICA
Trabajo de fin de
PARTICULAR DE LOJA
titulación
La Universidad Católica de Loja

Characterization of LEA proteins III (Late Embryogenesis
Abundant, family III) in species Fabaceae
Paola Ximena Dalgoa*, Augusta Cueva Aa.
a Departamento de Ciencias Naturales
Universidad Técnica Particular de Loja/San Cayetano Alto
P.O.Box 11-01-608 Loja - Ecuador.
a*[email protected]

Abstract:
One of the major problems on seed’s storage is the intolerance to extreme dehydration
conditions. In the present study we performed several tests in order to characterize the
Late Embryogenesis Abundant proteins family III, in seeds with different percentage of
dehydration and conservation behavior in different species of Fabaceae: Senna alata,
Senna mollisima and Caesalpinea spinosa. For the standardization of the method the
ACTIN gene was sequenced of Caesalpinea spinosa using a primers designed for this
study: Actin_syzy-Fw GCTGGATTCTGGTGATGGTG, TGGTTGGAACAGGACCTCTG
Actin_Syzy-Rv. The characterized gene codify an Actin protein. We used degenerate
primers obtained from a study by Yu et al. 2010 in order to characterize LEA genes,
however with these primers, hydrolase protein associated to cell wall was obtained
suggesting that the storage conditions such as relative humidity and temperature had
caused that the seed resume their metabolic activity.
Key Words: Late Embryogenesis abundant proteins (LEA), conservation behavior,
ACTIN gene, hydrolase protein associated to cell wall.
X