Oxidative damage is one of the most important causes of death of Thitarodes xiaojinensis (Lepidoptera: Hepialidae) larvae under heat stress PDF
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昆虫学报!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!!"#$%&’(!)*"*#$*12+**1 -../&()(01%21 氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫 不能存活的重要原因 王梦龙’!%! 朱K未%! 张继红%! 徐安英’! 王红托% 李K蠧%! 周桂灵%! 张K寰%! 秦启联%!! "’:江苏科技大学蚕业研究所!江苏镇江%’%&’3%%:中国科学院动物研究所!农业虫害鼠害 综合治理研究国家重点实验室!北京’&&’&’# 摘要! &目的’小金蝠蛾H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7是冬虫夏草菌@:9+’"’.0/"1:77+&1&7+7的寄主昆虫!生活于高海拔)高寒 地区!低温适应性强!但在室温下"%)m%*N#不能正常存活( 本研究检测了热胁迫"%*N#对小金蝠蛾幼虫消化酶 及抗氧化系统的影响!以期揭示小金蝠蛾室温不耐受的生理机制( &方法’小金蝠蛾3龄幼虫分两组进行处理$高 温组于%*N下饲养!对照组于’1N下饲养( 处理%( F后观察虫体状态!并解剖!取中肠及血淋巴( 透射电镜观察 中肠细胞线粒体结构!分别测定中肠总蛋白酶和糖基水解酶活性!血淋巴丙二醛"[cJ#含量!以及血淋巴保护酶系 中超氧化物歧化酶".Sc#)过氧化氢酶">J^#和过氧化物酶"VSc#的活性( &结果’两组幼虫中肠总蛋白酶及糖基 水解酶活性均随反应温度"’1m,*N#升高而增强( 协方差分析显示!高温组幼虫酶活性极显著低于对照组"4L &:&’#( 然而!高温组幼虫在%*N下的酶活性与对照组幼虫在’1N下的酶活性无显著差异"4L&:&)#( 热胁迫下 虫体血淋巴中丙二醛含量显著升高"4L&:&)#!提示出现了氧化损伤( 透射电镜结果显示!高温组中肠细胞线粒体 肿胀!膜受损!嵴排列混乱!结构破坏( 对活性氧起清除作用的, 种保护酶中!仅VSc活性显著升高"4L&:&)#! .Sc和>J^活性均无显著变化"4p&:&)#( &结论’消化酶活性的变化可能不是小金蝠蛾室温不耐受的重要因素% 氧化损伤是其热胁迫下不能正常存活的一个重要原因( 关键词! 小金蝠蛾% 热胁迫% 保护酶% 消化酶% 氧化损伤% 线粒体结构% 酶活性 中图分类号! O21)KK文献标识码! JKK文章编号!&()(01%21"%&’(#&*0&*120&3 6M)3,-)G$3,5,+$)0’*$’1-/$5’0-)5#’%-,*-&,"0$0’13$,-/ ’1 67.*)"$%&28.)$9.0&02.2"J$#)3’#-$%,$ S$#),()3,$# (,%G,$"*3$%/$,-0-%$00 YJ/W[@=D0P<=D’!%! QRTY@7%! QRJ/W!70R<=D%! UTJ=0u7=D’! YJ/WR<=D0^"<%! P-U"6=%! QRSTW"70P7=D%! QRJ/WR"6=%! O-/O70P76=%!!"’:^F@.@?7;"#E"?6#H@A@6?;F -=AE7E"E@! !76=DA" T=7I@?A7E$<Z.;7@=;@6=C ^@;F=<#<D$! QF@=w76=D! !76=DA" %’%&’3! >F7=6% %:.E6E@d@$P6G<?6E<?$<Z -=E@D?6E@C [6=6D@5@=E<ZV@AE-=A@;EA6=C H<C@=EA! -=AE7E"E@<ZQ<<#<D$! >F7=@A@J;6C@5$<Z.;7@=;@A! X@7w7=D’&&’&’! >F7=6# 740-%,&-$ &J75’ ^F@DF<AE5<EF! H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7"P@B7C<BE@?6$ R@B76#7C6@#! 7A6F<AE7=A@;E<Z >F7=@A@;6E@?B7##6?Z"=D"A"@:9+’"’.0/"1:77+&1&7+7#:P7I7=D6EF7DF 6#E7E"C@6?@6! H5<+$’R+&1&7+77A\@## 6C6BE@C E<EF@;<#C @=I7?<=5@=E! \F7#@Z67#AE<A"?I7I@"=C@??<<5E@5B@?6E"?@"H^! %) +%*N#:^< @#";7C6E@EF@BF$A7<#<D7;6#5@;F6=7A5<ZC@6EF "=C@?H^! EF@@ZZ@;EA<ZF@6EAE?@AA"%*N# <= EF@ C7D@AE7I@@=_$5@A6=C 6=E7<‘7C6=EA$AE@5<Z#6?I6#H5<+$’R+&1&7+7\@?@7=I@AE7D6E@C:&[@EF<CA’ ^F@3EF 7=AE6?#6?I6@<ZH5<+$’R+&1&7+7\@?@E?@6E@C 7= E\<D?<"BA$ EF@F7DF E@5B@?6E"?@D?<"B 567=E67=@C 6E%*N 6=C EF@;<=E?<#D?<"B 567=E67=@C 6E’1N:JE%( F 6ZE@?E?@6E5@=E! EF@#7I7=DAE6E@<Z#6?I6@\6A <GA@?I@C! 6=C 57CD"EA6=C F@5<#$5BF \@?@<GE67=@C EF?<"DF C7AA@;E7<=:^F@?@#6E7I@;<=E@=EA<Z 56#<=C76#C@F$C@"[cJ# 7= EF@F@5<#$5BF \@?@5@6A"?@C:^F@57E<;F<=C?76AE?";E"?@A<ZEF@57CD"E ;@##A\@?@<GA@?I@C "=C@?E?6=A57AA7<= @#@;E?<= 57;?<A;<B@"^4[#:^F@6;E7I7E7@A<Z@=_$5@A7=;#"C7=D EF@E<E6#B?<E@6A@A6=C D#$;<A$#F$C?<#6A@7= EF@57CD"E! A"B@?<‘7C@C7A5"E6A@@=_$5@".Sc#! ;6E6#6A@ ">J^#! 6=C B@?<‘7C6A@"VSc# 7= EF@F@5<#$5BF \@?@E@AE@C:&H@A"#EA’ ^F@6;E7I7E7@A<ZEF@E<E6# 基金项目$国家自然科学基金项目",’%*%,11#%中国科学院重要创新方向项目"d.>U%0uY0W0&*1# 作者简介$王梦龙!男!’233年生!山东威海人!硕士研究生!研究方向为昆虫生理生态!40567#$\5#33’’&38D567#:;<5 !通讯作者><??@AB<=C7=D6"EF<?!40567#$97=9#87<_:6;:;= 收稿日期H@;@7I@C$%&’(0&%0%&%接受日期J;;@BE@C$%&’(0&10’* KK**& 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 B?<E@6A@6=C D#$;<A$#F$C?<#6A@7= G<EF D?<"BA7=;?@6A@C \7EF EF@?@6;E7<= E@5B@?6E"?@"’1 +,*N#: ><I6?76=;@6=6#$A7A7=C7;6E@C EF6EEF@@=_$5@6;E7I7E7@A<ZEF@F7DF E@5B@?6E"?@D?<"B \@?@A7D=7Z7;6=E#$ #<\@?EF6= EF6E<ZEF@;<=E?<#D?<"B "4L&:&’#:R<\@I@?! G<EF B?<E@6A@6=C D#$;<A$#F$C?<#6A@6;E7I7E7@A 7= EF@F@6EE?@6E@C #6?I6@E@AE@C 6E%*N ?@6;E7<= E@5B@?6E"?@\@?@=<EA7D=7Z7;6=E#$C7ZZ@?@=EZ?<5EF6E7= EF@;<=E?<##6?I6@E@AE@C 6E’1N ?@6;E7<= E@5B@?6E"?@"4L&:&)#:^F@[cJ;<=E@=E7= EF@F@5<#$5BF 7=;?@6A@C A7D=7Z7;6=E#$6ZE@?F@6EAE?@AA! 7=C7;6E7=DEF6E<‘7C6E7I@C656D@<;;"??@C:^F@^4[6=6#$A7A<Z 57E<;F<=C?76AF<\@C EF6E57E<;F<=C?76#AE?";E"?@\6AC656D@C \7EF ;?7AE6@C7A6??6=D@C 6=C 57E<;F<=C?76# 5@5G?6=@G?<]@=:J5<=DEF@B?<E@;E7I@@=_$5@A! <=#$EF@VSc6;E7I7E$7=;?@6A@C A7D=7Z7;6=E#$"B<= F@6EAE?@AA"4L&:&)#! \F7#@[email protected]=C >J^6;E7I7E7@AC7C =<EA7D=7Z7;6=E#$;F6=D@"4p&:&)#: &><=;#"A7<=’ ^F@;F6=D@<ZC7D@AE7I@@=_$5@6;E7I7E7@A56$=<EG@EF@75B<?E6=EZ6;E<?Z<?EF@7=E<#@?6=;@ <ZH5<+$’R+&1&7+7#6?I6@"=C@?H^:S‘7C6E7I@C656D@7A<=@<ZEF@5<AE75B<?E6=E;6"A@A<Z#6?I6#C@6EF <ZEF@5<EF "=C@?F@6EAE?@AA: 8$. 2’%30$ H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7% F@6EAE?@AA% B?<E@;E7I@@=_$5@A% C7D@AE7I@@=_$5@A% <‘7C6E7I@ C656D@% 57E<;F<=C?76#AE?";E"?@% @=_$5@6;E7I7E$ KK小金蝠蛾 H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7隶属于鳞翅目 $):! %&’&#( 小金蝠蛾的消化酶已适应于低温环境! 蝙蝠蛾科"R@B76#7C6@#钩蝠蛾属 H9+#$.’017!其幼虫 在热胁迫下能否正常地发挥作用!为虫体提供充足 是我国名贵中药材冬虫夏草菌 @:9+’"’.0/"1:7 的能量来源!对于小金蝠蛾的高温生存具有重要 7+&1&7+7" X@?]:# ."=D! ."=D! R$\@#0!<=@A6=C 意义( .B6E6Z<?6的寄主昆虫"涂永勤等!%&’’#!主要分布 具有很强氧化活性的超氧阴离子自由基"S*+#) % 于我国四川省小金县及小金县与金钏县交界的空卡 氢氧自由基"RS*#和过氧化氢"RS#等活性氧 % % 山海拔 , &&& m( 3&& 5的高寒地区"涂永勤等! "HS.#!是生物体生命过程中产生的具有多种功能 %&’,#!因而具有很强的低温适应性( 小金蝠蛾最 的物质( 生物体在正常代谢过程中会有&:%M的氧 适生长温度为’1N!在&N仍能正常取食活动( 与 形成活性氧".E0V7@??@1#$):! %&&%#!它参与调节细 此相对应的是!小金蝠蛾生长缓慢)发育历期长( 自 胞周期"X<<=AE?66=C V<AE! %&&(#及细胞凋亡过程 然环境下!小金蝠蛾完成一个世代一般需要 ( 年 "d6A6F6?61#$):! ’22*#!但同时对生物大分子!如蛋 "涂永勤等!%&’’#!在室内进行人工饲养繁殖!也需 白质)糖类和核酸等有损伤作用( 正常情况下!细胞 要’ 年左右的时间( 提高小金蝠蛾的生长速度!缩 内自由基水平很低!不会对细胞造成伤害!因为细胞 短其发育历期!对于小金蝠蛾资源的保护利用!以及 内存在着自由基清除系统!即保护酶系统!用于清除 冬虫夏草的人工培植意义重大( 然而!小金蝠蛾对 生物体内的活性氧!保护结构免遭损伤!行使正常功 高温不耐受!在室温下"%) m%*N#不能正常存活( 能( 这套保护酶系统包括超氧化物歧化酶 研究小金蝠蛾的室温不耐受及其生理机制!不仅对 " A"B@?<‘7C@ C7A5"E6A@! .Sc#! 过 氧 化 物 酶 其人工饲养具有实际指导意义!同时也丰富了小金 "B@?<‘7C6A@! VSc#和过氧化氢酶";6E6#6A@! >J^# 蝠蛾幼虫生理生化方面数据!填补了冬虫夏草寄主 "a?7C<I7;F! ’2**#( .Sc可将 S*+催化歧化为 S 和 % % 昆虫高温胁迫相关研究的空白!为冬虫夏草寄主昆 RS!RS 能与S*+形成毒性更强的 RS*"[;><?C % % % % % 虫的热驯化研究提供一定的参考( 6=C a?7C<I7;F! ’212#( 但由于细胞内还有 >J^和 消化酶与底物作用!将食物分解成能被机体吸 VSc!这两种酶可将 RS 分解为 RS和 S"a@#E<= % % % % 收利用的小分子物质!进而为机体提供营养及能量! 6=C ."55@?A! ’22)#( 在 .Sc!>J^及 VSc, 种酶 是一类功能类似的酶的总称!主要包括蛋白水解酶) 协调一致下!细胞内自由基的产生与清除处于一种 糖苷酶等!其活性的变化直接影响生物体的生命活 动态平衡状态!使自由基维持在一个低水平!保护细 动( 消化酶的酶活性一般随着温度的升高而升高! 胞不受HS. 的损伤( 生物体在逆境条件下会增加 达到一定峰值后!则随温度升高而急剧下降 HS.的产生"李周直等!’22(#( 崔亚东等"%&’&#等 "V6I6A<I7;1#$):!%&&(#( 家蚕体内蛋白酶也具有相 报道!二化螟) 龄幼虫暴露于,,N!,1N和,2N , 似规律"屠洁和王国基!%&&)#!而对黄尾餷的研究 种不同温度下!其体内的HS.与对照"%3N#相比显 表明!后肠蛋白酶活性在低温时显著升高"[7@D@#1# 著提高( 植物在逆境胁迫下也会导致大量 HS. 产 *期 王梦龙等$ 氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫不能存活的重要原因 KK**’ 生"W7##6=C ^"E@w6!%&’&#( 保护酶能否有效应对骤 应体系如下$)& !P消化酶粗提液加’&& !P&:)M 增的活性氧!使生物体免遭氧化损伤!对逆境下生物 淀粉溶液!分别在’1N!%*N和,*N下反应(& 57=! 体的生存意义重大( 加’&& !P显色液") D,!)0二硝基水杨酸!) D氢氧 为从小金蝠蛾幼虫消化酶及抗氧化系统两个角 化钠!’ D苯酚!&:%) D无水亚硫酸钠!定容至 )&& 度!阐释小金蝠蛾高温不耐受的生理机制!本研究将 5P#!2&N加热) 57=!冰浴冷却后加(M的四水合酒 小金蝠蛾3 龄幼虫分两组进行处理$高温组于%*N 石酸钾钠,& !P!读取))& =5的吸光值( 糖基水解 下饲养!对照组于’1N下饲养!%( F 后分别对消化 酶活性定义为反应时间内 Sc 变化’ 为一个糖基 ))& 酶活性及抗氧化系统进行测定( 中肠总蛋白酶活性 水解酶活性单位"T#( 采用茚三酮法进行测定!糖基水解酶活性采用 c/. 9;@:血淋巴丙二醛$UT7%含量测定 显色法进行测定%以^XJ法测定血淋巴中氧化损伤 丙二醛是机体内的活性氧作用于脂质所产生 标志物///丙二醛含量!利用透射电子显微镜观察 的过氧化产物( 生理学上!丙二醛常作为过氧化 中肠细胞线粒体形态结构!以确定其是否受到氧化 的标志物!用来反映机体内氧化损伤的程度( 由 损伤!并分别测定血淋巴中, 种保护酶的活性!即采 于脂质是生物膜的构成组分!因此丙二醛也成为 用核黄素法测定总超氧化物歧化酶活性!钼酸铵法 膜损伤的标志性物质!其含量水平反映了膜脂损 测定过氧化氢酶活性!以及邻苯三酚法测定过氧化 伤的程度( 丙二醛的测定参考 !6=@?<"’22&#和 物酶活性( 4AE@?G6"@?和 >F@@A@56="’22&#!并进行改进( 具 体如下$冰上剪开虫体的第, 或第( 对腹足!取’& 9:材料与方法 !P血淋巴加入 %&& !P&:1M ^XJ溶液"先用 ’ 5<#kP/6SR溶解!再用’&M ^>J溶液定容#沸水 9;9:供试昆虫 浴’) 57=!迅速冷却后!(N ( &&& D离心!取上清 小金蝠蛾 H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7蛹采自四川省 在),) =5下测 Sc值!以 Sc 值表示 [cJ在两 ),) 小金县!在室内羽化)交配)产卵!孵化的幼虫在实验 组间的相对含量( 室内’1N全黑暗条件下用胡萝卜饲养( 9;A:中肠细胞线粒体透射电镜$ELU%观察 9;<:不同温度处理小金蝠蛾幼虫 取不同温度处理小金蝠蛾幼虫的中肠组织!用 取大小相近的小金蝠蛾3 龄幼虫%( 头!随机分 戊二醛固定!包埋)超薄切片由中国农业大学生命科 成高温组"%*N#和对照组"’1N#( 每组 ’% 头幼 学中心完成( 电镜型号!4[0’%,&!加速电压3& ]o! 虫!分别置于最适生长温度’1N和热胁迫温度%*N 观察线粒体形态结构( 下处理%( F!观察不同处理的小金蝠蛾幼虫的活动 9;B:保护酶活性测定 情况!以及虫体特征和对外界刺激的反应程度!以每 冰上用剪刀从虫体第, 或第( 对腹足剪开!取 头幼虫为一个重复!分别进行以下生理指标或活性 血淋巴( 的测定( 对.Sc!>J^和VSc, 种保护酶进行酶量梯度 9;?:消化酶活性测定 实验!验证实验体系的线性关系及可靠性( 蛋白含 在蜡盘上解剖虫体!取出整个中肠( 将中肠在 量的测定采用试剂盒"购自碧云天#!参照其说明书 ’:) 5P4V管中剪碎!每管 ’ 头!(N下 ( &&& D离 测定( 心!取上清!为消化酶粗提液( 总蛋白酶活性测定采 .Sc活性测定参照 [7A?6和 a?7C<I7;F"’2*%#! 用茚三酮比色法"蔡红和沈仁芳!%&&)#!反应体系 并略改进( 反应体系为 BR*:3 的&:&% 5<#kPVX. 如下$)& !P消化酶粗提液加’)& !P茚三酮0抗坏血 缓冲液%&& !P!’2) 55<#kP甲硫氨酸%& !P!’:’%) 酸溶液"% D茚三酮!&:&% D抗坏血酸用 BR):3 的 55<#kP/X^(& !P!&:, 55<#kP4c^J0/6’& !P! % 乙酸0乙酸钠缓冲液定容至’&& 5P#!分别在’1N! 1& !5<#kP核黄素溶液’& !P!血淋巴) !P!光照’) %*N和,*N下反应(& 57=!经沸水浴’) 57=!冷却 57= 后)1& =5下测Sc值( .Sc酶活性定义为反应 后加’&& !P&:%M的 d-S 溶液!分光光度计读取 时间内 Sc 变化 ’ 为一个过氧化物酶活性单位 , )1& )*& =5的吸光值( 总蛋白酶活性定义为反应时间 "T#( 内Sc 变化’ 为一个蛋白酶活性单位"T#( 糖基 >J^活性测定参照程鲁京和孟泽"’22(#!缩小 )*& 水解酶测定采用 c/. 显色法"黎军胜等!%&&(#!反 反应体系!(&) =5下测吸光度( 反应体系如下$ KK**% 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 &:2M RS"用&:&% 5<#kP!BR*:( 的VX.稀释#,& 消化酶活性的统计分析采用协方差分析!以独立样 % % !P!血淋巴% !P!室温反应’ 57=!加,%:( 55<#kP 本#检验分别检验热胁迫组%*N与正常组’1N下 的钼酸铵%&& !P!’% &&& D离心) 57=!取%&& !P上 的消化酶活性)丙二醛相对含量及保护酶活性的差 清测(&) =5的 Sc值( >J^活性定义为反应时间 异( 用W?6BFV6C V?7A5):& 软件绘图( 内Sc 变化’ 为一个过氧化氢酶活性单位"T#( (&) VSc活性测定参照 >F6=;@等"’2*2#!略有 <:结果 改进( 反应体系为BR*:( 的&:&% 5<#kPVX. 缓冲 液’(& !P!2:)M RS ’& !P!&:)M 邻苯三酚 (& <;9:不同温度处理下的小金蝠蛾幼虫体征 % % !P"BR1:) VX. 配制#!血淋巴 ( !P!,*N反应 ) 高温组"%*N# 下小金蝠蛾幼虫与对照组 57=!(*& =5下测定 Sc值( VSc活性定义为反应 "’1N#相比!虫体色泽灰暗无光泽!外形干瘪!行动 时间内 Sc 变化 ’ 为一个过氧化物酶活性单位 迟缓!对外界刺激反应迟钝%而对照组虫体色泽鲜 (*& "T#( 亮!虫体饱满!且活跃好动!对外界刺激敏感"图’#( 9;C:数据统计与分析 高温组在处理%( F后即陆续出现濒死个体!一般于 使用-X[.V.. .E6E7AE7;A%’ 软件进行统计分析( % m, 日内全部死亡( 图’K不同温度处理下的小金蝠蛾3龄幼虫 a7D:’K^F@3EF 7=AE6?#6?I6@<ZH9+#$.’017<+$’R+&1&7+7567=E67=@C 6EC7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@A J$’1N处理%(F的3龄幼虫3EF7=AE6?#6?I6567=E67=@C6E’1NZ<?%(F%X$%*N处理%(F的3龄幼虫3EF7=AE6?#6?I6567=E67=@C6E%*NZ<?%(F: <;<:热胁迫对小金蝠蛾幼虫中肠消化酶活性的 &:&&’#%控制反应温度因素的影响后!高温组与对 影响 照组的蛋白酶活性的差异极显著"0;l’! =l KK消化酶活性测定结果显示"图% 和,#!在’1 m %1:,’&! 4L&:&&’#( 测定糖基水解酶的反应温度 ,*N的反应温度范围内!无论热胁迫组还是正常组! 对两种温度处理组的酶活性的影响同样存在极显著 幼虫中肠总蛋白酶和糖基水解酶活性均随温度升高 差异"0;l’! =l(&:’%%! 4L&:&&’#!控制该因素 而增强( 在同一反应温度下!高温组幼虫总蛋白酶 的影响后!高温组与对照组的糖基水解酶活性差异 与糖基水解酶活性均低于对照组( 协方差分析表 极显著"0;l’! =l’! 4l&:&&3#( 即热胁迫后对 明!蛋白酶的反应温度对高温组和对照组间的酶活 虫体的蛋白酶和糖基水解酶活性的影响均极显著( 性的影响差异极显著"0;l’! =l%1:,’! 4L 考虑到不同处理组幼虫的生存温度不同!将热胁迫 *期 王梦龙等$ 氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫不能存活的重要原因 KK**, 图%K不同温度处理%( F后小金蝠蛾3龄幼虫中肠 液总蛋白酶在不同反应温度下的酶活性 a7D:%KV?<E@6A@6;E7I7E7@A7= EF@57CD"EZ#"7C <ZEF@3EF 图(K不同温度处理%( F后小金蝠蛾3龄 7=AE6?#6?I6@<ZH9+#$.’017<+$’R+&1&7+7567=E67=@C 幼虫血淋巴中丙二醛的相对含量 6EC7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@AZ<?%( F a7D:(K^F@?@#6E7I@;<=E@=EA<Z5@EF6=@C7;6?G<‘$#7; 图中数据为平均值i标准误%下图同( c6E67=EF@Z7D"?@6?@5@6=i 6#C@F$C@"[cJ# 7= EF@F@5<#$5BF <ZEF@3EF 7=AE6?#6?I6@<Z ,%:^F@A65@Z<?EF@Z<##<\7=DZ7D"?@A: H9+#$.’017<+$’R+&1&7+7567=E67=@C6EC7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@AZ<?%(F 以对照组Sc 值为’( 柱上星号表示高温组与对照组的丙二醛相 ),) 对含量经#检验差异显著"4L&:&)#( ^F@Sc I6#"@<ZEF@;<=E?<# ),) D?<"B"’1N# 7AA@E6A’:^F@6AE@?7A] 6G<I@G6?A7=C7;6E@AA7D=7Z7;6=E C7ZZ@?@=;@<ZEF@?@#6E7I@[cJ;<=E@=EG@E\@@=EF@F7DFE@5B@?6E"?@D?<"B 6=CEF@;<=E?<#D?<"BG$#0E@AE"4L&:&)#: 构差异明显( 可以看到对照组中线粒体膜结构完 整!线粒体内嵴排列有序!且形态正常%而高温组 中!线粒体内嵴排列混乱!线粒体出现不同程度的 肿胀)空泡!线粒体膜破损"图 )#( 这表明 %*N 图,K不同温度处理%( F后小金蝠蛾3龄幼虫中肠 下!小金蝠蛾幼虫存在严重的线粒体氧化损伤!造 液糖基水解酶在不同反应温度下的酶活性 成结构性的破坏( a7D:,KW#$;<A$#F$C?<#6A@6;E7I7E7@A7= EF@57CD"EZ#"7C <;A:热胁迫对小金蝠蛾幼虫血淋巴? 种保护酶 <ZEF@3EF 7=AE6?#6?I6@<ZH9+#$.’017<+$’R+&1&7+7 $!6T#>6T#=7E%活性的影响 567=E67=@C 6EC7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@AZ<?%( F KK%*N胁迫处理 %( F 后!小金蝠蛾血淋巴中的 处理组在%*N的蛋白酶活性及糖基水解酶活性分 .Sc与>J^活性均无显著变化"4 l&:1’*! 4 .Sc >J^ 别与正常组在’1N下的进行#检验!结果显示!两种 l&:’,*#!仅VSc活性显著提高"4l&:&,’#"图1#( 酶的活性差异均不显著"蛋白酶 4l&:,3’!糖基水 为此!可能VSc活性的提高不足以维持热胁迫下虫 解酶4l&:)*%#( 体的活性氧代谢平衡!导致活性氧积累!由此造成热 <;?:热胁迫对小金蝠蛾幼虫血淋巴丙二醛含量的影响 胁迫下![cJ水平上升!线粒体受损等氧化损伤( 对血淋巴中丙二醛含量的测定结果显示"图 (#!给予%*N胁迫后!小金蝠蛾幼虫体内的丙二醛 ?:讨论 含量显著升高至对照组的近% 倍!#检验二者差异极 显著"4l&:&&(#!提示热胁迫处理的小金蝠蛾幼虫 究竟是什么原因导致生物在经受热处理后最终 体内的活性氧不能被充分消解!脂质被超量的活性 死亡- X<\#@?等"’2*,#提出!热对细胞膜的破坏是 氧严重过氧化( 关键原因( c@=#7=D@?和P@@"’223#加入了生物的整 <;@:热胁迫对小金蝠蛾幼虫中肠细胞线粒体结构 体观!提出了耐热性的分级机制!即大分子|细胞|组 的影响 织|整个的生物体( 迄今为止!在相关文献中!尚不 KK%*N热胁迫处理后!高温组与对照组相比!结 能将热致死原因归为一种( KK**( 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ )*卷 图)K小金蝠蛾3龄幼虫中肠细胞线粒体透射电镜照片 a7D:)K^4[<Z57E<;F<=C?767= EF@57CD"E;@##<ZEF@3EF 7=AE6?#6?I6@<ZH9+#$.’017<+$’R+&1&7+7 J$’1N处理%( F的3龄幼虫的中肠细胞!图中可见线粒体"箭头所示#结构完整!线粒体嵴排列正常有序^F@57CD"E;@##<ZEF@3EF 7=AE6?#6?I6 567=E67=@C6E’1NZ<?%(F!AF<\7=D6=7=E6;E57E<;F<=C?7<="7=C7;6E@CG$6??<\# \7EF=<?56#;?7AE6@%X$%*N处理%(F的3龄幼虫的中肠细胞!图 中可见线粒体"箭头表示#肿胀!出现空泡!膜破裂!线粒体嵴排列混乱^F@57CD"E;@##<ZEF@3EF7=AE6?#6?I6567=E67=@C 6E%*N Z<?%( F!AF<\7=D A\<##@=57E<;F<=C?76"7=C7;6E@C\7EF6??<\A# \7EFG?<]@=5@5G?6=@!I@A7;#@A6=CC7A6??6=D@C;?7AE6@: KK小金蝠蛾主要生活在高海拔地区!经过长期进 吸链的线粒体内膜容易受到氧化损伤!造成线粒体 化适应了低温的生活环境!在室温下不适应)无法正 内膜脂质的过氧化反应)膜流动性降低)膜脂质降解 常生存( 高温热胁迫下!虫体的消化酶活性显著下 等!从而影响跨越线粒体膜的质子梯度!使线粒体合 降!然而!由于在’1 m,*N的反应温度范围内!酶活 成J^V的功能发生障碍( 与此同时!线粒体的功能 性随反应温度升高而增高!致使 %*N热胁迫组在 障碍又可导致自由基产生增多!过多的氧自由基不 %*N下的酶活性与’1N正常组在’1N下的酶活性 能被及时清除!进一步引起生物膜结构蛋白质和脂 差异不显著( 为此!我们推测消化酶活性的变化可 质过氧化!损害线粒体膜的通透性!引起电子传递链 能并非小金蝠蛾室温不耐受的一个重要因素( 活性的进一步下降!进而形成恶性循环!使氧自由基 热胁迫组小金蝠蛾幼虫血淋巴中氧化损伤标志 生成进一步增加!氧化损伤加剧!线粒体结构和功能 物丙二醛的含量显著升高!说明温度胁迫后!小金蝠 遭到严重破坏( 线粒体损伤可引起一系列的细胞功 蛾幼虫体内活性氧积累!发生了严重的氧化损伤( 能障碍!最终造成细胞及组织的死亡( 而且丙二醛容易与蛋白质和c/J结合!破坏生物大 生物体内活性氧的清除是在保护酶系统的, 种 分子的结构与功能".@6#1#$):! %&&,#!对虫体可造 酶的协同作用下完成的( .Sc是最重要的清除自 成进一步的损害( 线粒体的透射电镜结果显示! 由2 基的酶之一!首先将S*+自由基形成 RS!再由 % % % %*N下!小金蝠蛾幼虫线粒体膜受损!结构破坏!证 >J^和VSc将RS 分解( VSc清除RS!需要还 % % % % 实了热胁迫已对线粒体造成了严重损伤( 线粒体是 原性底物!且对RS 亲和力高!>J^则不需要还原 % % 细胞能量代谢最重要的细胞器!在氧化磷酸化的过 力!并具有较高活性!但对 RS 亲和力弱"杜秀敏 % % 程中可产生一定量的自由基!由于抗氧化防御体系 等!%&&’#( .Sc!>J^和VSc三者相对水平的高低 的存在!在生理状态下二者维持动态平衡!从而保护 对 于 它 们 抗 氧 化 作 用 的 有 效 发 挥 很 线粒体不被损伤( 但在自由基产生过多时!靠近呼 重要(褐飞虱取食转基因抗虫水稻后!.Sc和>J^ *期 王梦龙等$ 氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫不能存活的重要原因 KK**) 图1K不同温度处理%( F后小金蝠蛾3龄幼虫血淋巴中.Sc"J#)>J^"X#和VSc">#的活性 a7D:1K^F@6;E7I7E7@A<ZA"B@?<‘7C@C7A5"E6A@"J#! ;6E6#6A@"X# 6=C B@?<‘7C6A@"># 7= EF@F@5<#$5BF <ZEF@ 3EF 7=AE6?#6?I6@<ZH9+#$.’017<+$’R+&1&7+7567=E67=@C 6EC7ZZ@?@=EE@5B@?6E"?@AZ<?%( F 柱上星号示高温组与对照组的保护酶活性经#检验差异显著"4L&:&)#( ^F@6AE@?7A]6G<I@G6?A7=C7;6E@AA7D=7Z7;6=EC7ZZ@?@=;@7=EF@6;E7I7E7@A<Z B?<E@;E7I@@=_$5@AG@E\@@=EF@F7DFE@5B@?6E"?@D?<"B6=CEF@;<=E?<#D?<"BG$#0E@AE"4L&:&)#: 活性显著升高!VSc活性没有变化"吕仲贤等! 参考文献 $K$1$%$*&$0% ’22*#( 我们的研究结果显示!热胁迫下!.Sc和 >J^活性没有显著变化!仅VSc活性显著升高( 前 X<<=AE?6!! V<AE!J! %&&(:[<#@;"#6?@I@=EA6AA<;76E@C \7EF ?@6;E7I@ 述丙二醛含量的升高和线粒体结构的破坏!表明热 <‘$D@=AB@;7@A6=C;@##;$;#@B?<D?@AA7<=7=56556#76=;@##A:D1&1! ,,*$’+’,: 胁迫下!小金蝠蛾的抗氧化系统不能有效地清除活 X<\#@?d!c"=;6= >!! W#6C\@##H^! c6I7A<= ^a!’2*,:>@##"#6?F@6E 性氧!已造成严重的氧化损伤!这意味着热胁迫下! 7=w"?$: 8’(:$.$#+G1 -+’"91(+7#./ $&0 49/7+’)’*/ 4$.# !$ 仅仅VSc活性的提高不足以维持体内原有的活性 49/7+’)’*/!()"%#$((’+()&: 氧代谢平衡!导致活性氧大量积累!对机体造成损 >67R! .F@= Ha! %&&):c@E@?57=6E7<= <ZA<7#B?<E@6A@6;E7I7E$\7EF 伤!宏观上表现为虫体不适)死亡( 5<C7Z7@C =7=F$C?7= ;<#<?75@E?$:!"#$ 410’)’*+"$ ,+&+"$! (%"%#$ ,&1+,’,:+蔡红!沈仁芳!%&&):改良茚三酮比色法测定土壤 %*N胁迫后小金蝠蛾幼虫 .Sc与 >J^活性变 蛋白酶活性的研究:土壤学报!(%"%#$,&1+,’,, 化不显著!这其中可能是小金蝠蛾幼虫的温度感应 >F6=;@X! .7@AR! X<I@?7AJ! ’2*2:R$C?<B@?<‘7C@5@E6G<#7A57= 相关的某个重要基因不表达或低表达造成的!导致 56556#76=<?D6=A:49/7+’)’*+"$)?1G+1L7!)2",#$)%*+1&): 虫体中.Sc及 >J^不能对胁迫温度产生响应!从 >F@=DP!! 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QF6=DcP! >F@= ^! >F@= .!!%&’,:c7AE?7G"E7<= <Z 根!嵇保中!’22(:几种昆虫体内保护酶系统活力的研究:昆 F<AE<Z@:9+’"’.0/"1:77+&1&7+70A1:+$)27<+$’R+&1&7+7:,’2#9L17# 虫学报!,*"(#$,22+(&,, 89+&$E’2.&$)’;!*.+"2)#2.$),"+1&"17!%1")#$%’1*+%’12:+涂 PIQU!u" UV! QF@=DU.! >F@= 
