ontwikkeling van een hplc-methode ter bepaling van ergosterol met oog op fusarium-kwantificatie ... PDF
Preview ontwikkeling van een hplc-methode ter bepaling van ergosterol met oog op fusarium-kwantificatie ...
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2009-2010 ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-METHODE TER BEPALING VAN ERGOSTEROL MET OOG OP FUSARIUM-KWANTIFICATIE IN GRANEN Jeroen SENAEVE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Interne Promotor Prof. S. De Saeger Externe Promotor Ing. P. Maene, Hogeschool Gent Commissarissen Dr. J. Diana Di Mavungu Dr. L. Vanhaecke UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2009-2010 ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-METHODE TER BEPALING VAN ERGOSTEROL MET OOG OP FUSARIUM-KWANTIFICATIE IN GRANEN Jeroen SENAEVE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Interne Promotor Prof. S. De Saeger Externe Promotor Ir. P. Maene, Hogeschool Gent Commissarissen Dr. J. Diana Di Mavungu Dr. L. Vanhaecke Auteursrecht “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” Gent, mei 2010. De promotor, De auteur, Prof. S. De Saeger Jeroen Senaeve Woord vooraf Deze masterproef is het resultaat van een semester lang onderzoek in het laboratorium voor biowetenschappen en landschapsarchitectuur aan de Hogeschool Gent. Verschillende personen wil ik bedanken voor hun inzet en toewijding gedurende deze periode. Vooreerst wil ik Prof. Sarah De Saeger bedanken voor het nalezen en corrigeren van mijn werk. In het bijzonder dank ik mijn externe promotor, Ir. Peter Maene, voor het opvolgen en begeleiden van mijn masterproef. Ook bedank ik graag Dr. Ir. Kris Audenaert voor de verschillende schimmelstalen die ter beschikking gesteld werden, en Kirsten Willems voor de vlotte samenwerking in het laboratorium. Daarnaast richt ik een woord van dank aan mijn ouders die mij de kans gegeven hebben om hogere studies aan te vatten. Tenslotte wil ik ook mijn kotgenoten en vrienden bedanken voor de steun en de vele fijne momenten. Jeroen Senaeve Gent, mei 2010 1. INLEIDING .................................................................................................................1 2. OBJECTIEVEN ...........................................................................................................3 3. LITERATUURSTUDIE .............................................................................................6 3.1 FUSARIUM ...............................................................................................................6 3.1.1. Inleiding ......................................................................................................6 3.1.2. Voorkomen .................................................................................................6 3.1.3. Pathogeniciteit .........................................................................................7 3.1.3.1 Mycotoxines ............................................................................................7 3.1.3.2 Aantasting van de gewassen .............................................................8 3.1.3.3 Gevaar voor de mens ..........................................................................9 3.2. ASPERGILLUS ..................................................................................................... 11 3.2.1. Inleiding .................................................................................................... 11 3.2.2. Voorkomen ............................................................................................... 12 3.2.3. Pathogeniciteit ....................................................................................... 13 3.3 ERGOSTEROL ....................................................................................................... 14 3.3.1. Inleiding .................................................................................................... 14 3.3.2. Biosynthese in schimmels ................................................................ 15 3.3.3. Ergosterol als maat voor schimmelaantasting ..................... 16 3.4. ACHTERGRONDINFORMATIE BIJ DE EXTRACTIE .................................... 17 3.4.1. Inleiding .................................................................................................... 17 3.4.2. Extractieprocedure voor ergosterol uit graan ....................... 18 3.4.2.1. Verzepingsreactie .............................................................................. 18 3.4.2.2. Fysisch verstoren van de celwand ............................................... 18 3.4.2.3. Extractie en opzuivering .................................................................. 19 3.5 ANALYSEMETHODEN ......................................................................................... 20 4. MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................. 22 4.1. LIJST VAN GEBRUIKTE TOESTELLEN EN REAGENTIA ........................... 22 4.1.1. Toestellen ................................................................................................. 22 4.2.2. Reagentia .................................................................................................. 22 4.2 METHODEN ........................................................................................................... 23 4.2.1. Schimmelgroei ....................................................................................... 23 4.2.2. HPLC ............................................................................................................ 24 4.2.2.1. Standaardreeksen ............................................................................. 24 4.2.2.2. De extracties ....................................................................................... 26 5. DISCUSSIE ............................................................................................................... 28 5.1. RESULTATEN VAN DE HPLC-ANALYSE........................................................ 28 5.1.1. De standaardcurves ............................................................................ 28 5.1.1.1. De eerste standaardcurve ............................................................... 28 5.1.1.2. De tweede standaardcurve ............................................................. 30 5.1.1.3. De derde standaardcurve ................................................................ 31 5.1.1.4. De vierde standaardcurve: berekening van de extractie- efficiëntie ............................................................................................................... 31 5.1.1.5. De vijfde standaardcurve: tweede berekening van de extractie-efficiëntie ............................................................................................ 33 5.1.2. De extractieprocedures ..................................................................... 34 5.1.2.1. De eerste extractie ............................................................................ 34 5.1.2.2. De tweede extractie .......................................................................... 34 5.1.2.3. De derde extractie ............................................................................. 35 5.1.2.4. De vierde extractie ............................................................................ 36 5.2. VALIDATIE VAN DE STANDAARDCURVE .................................................... 37 5.2.1. Inleiding .................................................................................................... 37 5.2.2. Lineariteit ................................................................................................. 38 5.2.3. Detectielimiet ......................................................................................... 38 5.2.4. Kwantificatielimiet ............................................................................... 38 5.2.5. Bereik .......................................................................................................... 39 5.2.6. Juistheid .................................................................................................... 39 5.2.7. Precisie ...................................................................................................... 39 5.2.7.1. Herhaalbaarheid ................................................................................. 40 5.2.7.2. Reproduceerbaarheid ....................................................................... 40 5.2.8. Recovery.................................................................................................... 41 6. CONCLUSIE .............................................................................................................. 42 7. LITERATUURLIJST ................................................................................................ 43 Lijst met gebruikte afkortingen 7-DHC 7-Dehydrocholesterol °C Graden Celsius µg Microgram µm Micrometer An. Analyt ATA Voedingsgerelateerde Toxische Aleukia ATP Adenosinetrifosfaat BMT Beenmergtransplantatie CH OH Methanol 3 Cx Keten van x aantal koolstofatomen Cl- Chloride-ion cm Centimeter Con. Controle DMP Dimethylallylpyrofosfaat DNA Desoxyribonucleïnezuur DON Deoxynivalenol g Gram GC Gaschromatografie FD Fluorescentiedetector FHB Fusarium Head Blight H+ Waterstof-ion H O Water 2 HCl Waterstofchloride / Zoutzuur HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coënzyme A HPLC Hoge Performantie Vloeistofchromatografie IPP Isopentenylpyrofosfaat kg Kilogram KOH Kaliumhydroxide LAF Laiminaire Air Flow kast LOD Detectielimiet LOQ Kwantificatielimiet MAE Microwave-Assisted Extraction MG Moleculair Gewicht mg Milligram min. Minu(u)t(en) mL Milliliter MS Massaspectrometrie N Stikstof 2 Na+ Natrium-ion NaCL Natriumchloride NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Fosfaat NaOH Natriumhydroxide nm Nanometer OH- Hydroxide-ion OTA Ochratoxine A PDA Potato Dextrose Agar pH Zuurtegraad ppm Parts Per Million PT Post-transplantatie QPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction R2 Correlatiecoëfficiënt rRNA Ribosomaal Ribonucleïnezuur s Seconde(n) SOT Solid-Organ Transplantation spp. Species TDI Toegelaten Dagelijkse Inname (HP)TLC (Hoge Performantie) Dunnelaagchromatografie TMCS Trimethylchlorosilaan TMSI Trimethylsilylimidazole UHT Ultra High Temperature Processing UPLC Ultra Performantie Vloeistofchromatografie UV Ultraviolet V.D. Velddosis VWD Variabele Golflengte Detector W Watt WWB Warmwaterbad ZEA Zearalenone 1. INLEIDING Contaminatie van graan door schimmels is van groot economisch belang. Gewassen kunnen gedurende verschillende stadia in de verwerking besmet worden door schimmels. Schimmelaantasting gaat in vele gevallen gepaard met oogstverliezen. Dit heeft een belangrijk nadelig gevolg voor bevolkingsgroepen die voor hun alledaags dieet in grote mate afhankelijk zijn van graansoorten (bv. de Aziatische landen, waar rijst een belangrijke voedingscomponent is). Naast deze wereldwijde complicatie speelt graancontaminatie nog een belangrijke rol in een ander grootschalig probleem. De schimmels die groeien op graansoorten produceren in sommige gevallen schadelijke, secundaire metabolieten. Deze metabolieten worden mycotoxines genoemd en zijn vaak de oorzaak van verschillende aandoeningen die voorkomen bij de mens. Voorbeelden zijn ochratoxine A (OTA), deoxynivalenol (DON) en zearalenone (ZEA). Er wordt geschat dat ongeveer een kwart van alle landbouwgewassen een zekere hoeveelheid aan mycotoxines bevat. De concentratie ervan in graan varieert naargelang het soort mycotoxine. Zo wordt voor OTA, DON en ZEA een mediaan gevonden van respectievelijk 0,021; 5,5 en 0,2 µg/g (Tangni & Pussemier, 2007). Het is van groot belang dat de schimmelaantasting van de gewassen tot een minimum herleid wordt. Fusarium en Aspergillus zijn de twee schimmelsoorten die centraal staan in dit onderzoek. Fusarium is een veldschimmel en tast dus de planten aan tijdens het groeiproces op het veld. Aspergillus daarentegen is een voorraadschimmel. Deze schimmel kan het graan contamineren wanneer het opgeslagen is in silo‟s. Beide fungi produceren mycotoxines en kunnen bijgevolg schadelijk zijn voor de mens of voor vee dat besmet veevoeder eet. Bestrijding van deze schimmels gebeurt aan de hand van fysische (bv. straling) of chemische (fungiciden, organische zuren, ...) middelen. Het doel van dit thesisonderzoek bestaat erin een snelle en betrouwbare methode op punt te stellen voor de bepaling van de mate aan schimmelaantasting. Hierbij wordt gebruik gemaakt van chromatografische methoden en principes. De schimmelaantasting in graanstalen is gerelateerd aan de hoeveelheid ergosterol die teruggevonden wordt. Ergosterol is het meest abundante sterol in celmembranen van schimmels. Het is specifiek voor fungi en is relatief eenvoudig en snel te bepalen met behulp van chromatografische procedures. 1
Description:The list of books you might like
