Obtención de carotenoides con la microalga Scenedesmus incrassatulus en un biorreactor tipo airlift

74 Pages·2017·2.52 MB·Spanish

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TÍTULO DEL TRABAJO:

Obtención de carotenoides con la microalga

Scenedesmus incrassatulus en un biorreactor tipo

air lift

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERA BIOTECNÓLOGA

PRES ENTA:
XIMENA LEMU S VILLAFUERTE

ASESORES

Asesor externo Dra. Rosa Olivia Cañizares Villanueva
Asesor interno Dr. Luis Fernández Linares

México, D. FM. é x iJcuon,i oD . F . J u n2i0o0 280 09
RESUMEN

Los carotenoides son metabolitos primarios producidos por las microalgas para que
cumplan su función como pigmentos accesorios de la fotosíntesis y como moléculas
fotoprotectoras. Se ha reportado la producción de carotenoides secundarios en microalgas
en respuesta a algún tipo de estrés. En el presente trabajo se aplicaron dos condiciones de
estrés, nutricional y lumínico, por separado y en conjunto, para inducir la carotenogénesis
en la microalga Scenedesmus incrassatulus CLHE-Si01. Se llevaron a cabo cultivos con
fotoperiodo y con luz continua en fotobiorreactores de 2L, en un medio mineral, con un
flujo de aireación de 0.5 vvm y una iluminación de 400m-2 s-1. Una vez que los cultivos
hubieron alcanzado la máxima concentración volumétrica de carotenoides totales, se aplicó
el estrés. En caso de estrés nutricional se realizó un lavado celular y se sustituyó el medio
mineral por agua, mientras que en el caso de estrés lumínico se agregaron 350m-2 s-1 de luz.
Los resultados obtenidos indican que el estrés lumínico y nutricional estimularon la
carotenogénesis y que además, la luz continua es una forma adicional de estresar a la
célula. El crecimiento e inducción con fotoperiodo permitió obtener una mayor cantidad de
biomasa y de carotenoides, mientras que el crecimiento con luz continua aumentó el
porcentaje de carotenoides secundarios y la degradación de éstos. El aumento en los
carotenoides secundarios estuvo representado por el aumento de la concentración de
astaxantina+violaxantina. El fotobiorreactor que presentó el máximo contenido específico
de cetocarotenoides fue el sometido a estrés nutricional con fotoperiodo (1.2%).
AAAAGGGGRRRRAAAADDDDEEEECCCCIIIIMMMMIIIIEEEENNNNTTTTOOOOSSSS

A mi papá, por siempre alentarme a cumplir mis metas.

A mi mamá por darme siempre su cariño y apoyo.

A Fabi, por ser una verdadera hermana.

A la Dra. Rosa Olivia Cañizares, por su asesoría, por permitirme realizar el
proyecto en su Laboratorio y también aprender en él.

Al Dr. Hugo Perales, por su asesoría y por enseñarme el amor a la
investigación.

A Alfredo, por ser un compañero, un asesor y un amigo.

A mis amigos de la UPIBI, del taller de teatro de la UPIBI y de Gato
Encerrado, por ayudarme a reír cuando más lo necesitaba.

“One song glory, beyond the cheap colored lights… Time flies”
[RENT]

“No hay árbol que el viento no haya sacudido.”
Proverbio hindú
ÍÍÍÍNNNNDDDDIIIICCCCEEEE

Página
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Los carotenoides…………………………………………………………..…. 1

1.1.1 Descripción..……………………………………………………………..…. 1
1.1.2 Clasificación……………………………………………………………..…. 2
1.1.3 Características químicas…………………………………………………… 3
1.1.5 Importancia en la salud humana ………………………………………….... 3
1.1.6 Importancia industrial……………………………………………………… 7
1.2 Los carotenoides y las microalgas………………………………………… 9
1.2.1 Descripción general…………………………………………… ………….. 9
1.2.2 Función fisiológica…………………………………………………………... 10
1.2.3 Scenedesmus…………………………………………………………………………...... 12
1.2.4 Biosíntesis …………………………………………………………………......... 1 5
1.2.5 Factores que afectan la biosíntesis……………………………………….……… 1 8
1.3 Producción industrial: síntesis química vs. Biosíntesis………………… 20
1.4 Fotobiorreactores………………………………………………………………… 21

2. ANTECEDENTES………………………………………………………………. 21

3. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS……………………………………………... 23

4. OBJETIVOS……………………...………………………………………………… 25

5. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 26
5.1 Scenedesmus incrassatulus. …….……………………………………...… 25
5.2 Medio de Cultivo mineral……..………………………………………………... 25
5.3 Biorreactor airlift………………………………………………………………. 2 5
5.4 Protocolo experimental………….....……………………………………………. 27
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 31
6.1 Crecimiento celular con fotoperiodo (FP) y luz continua………………………… 31
6.2 Fotobiorreactores con luz continua……………………………………………….. 33
6.2.1 Cuantificación de clorofilas y carotenoides totales…………………………….. 33
6.2.3 Contenido específico de carotenoides totales…………………………………... 36
6.2.4 Análisis por HPLC-DAD………………………………………………………. 37
6.2.5 Cuantificación de cetocarotenoides…………………………………………….. 38
6.3 Fotobiorreactores con fotoperiodo……………………………………………….. 40
6.3.1 Cuantificación de clorofilas y carotenoides totales…………………………….. 40
6.3.3 Contenido específico de carotenoides totales…………………………………... 42
6.3.4 Análisis por HPLC-DAD………………………………………………………. 43
6.3.5 Cuantificación de cetocarotenoides…………………………………………….. 44
6.4 LC y FP después de la aplicación de estrés………………………………………. 45
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………. 48
8. RECOMENDACIONES PARA TRABAJOS FUTUROS…………………..…….. 4 9

9. REFERENCIAS…………………..………………………………………………... 5 0

9. ANEXOS………………………..……………………………………………….…. 54
Anexo I. Composición de algunas soluciones nutricionales para el cultivo en
laboratorio del género Scenedesmus ………………………………………………… 54
Anexo II. Método del lavado celular ………………………………………………… 57
Anexo III. Metodología para la cuantificación de pigmentos con metanol caliente….. 58
Anexo IV. Metodología para la cuantificación de la proporción de xantofilas
por Cromatografía de Alta Resolución (HPLC)…………………………………….. 59
Anexo V. Metodología para la cuantificación de cetocarotenoides con
Dimetilsulfóxido (DMSO) …………………………………………………………. 61
Anexo VI. Fotografía de los fotobiorreactores……………………………………….. 62
Anexo VII. Cromatogramas de los fotobiorreactores……………………………….. 64
ÍÍÍÍnnnnddddiiiicccceeee ddddeeee ttttaaaabbbbllllaaaassss yyyy ffffiiiigggguuuurrrraaaassss

Tabla 1. Actividades biológicas de los carotenoides en el ser humano 5
Tabla 2. Carotenoides de mayor importancia industrial 8
Tabla 3. Características generales de las microalgas 9
Tabla 4. Características generales del subgénero Scenedesmus 14
Tabla 5. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con luz
continua 37
Tabla 6. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con
fotoperiodo 43

Figura 1. Ejemplo de carotenoides: el β-caroteno 1
Figura 2. Carotenos y xantofilas presentes en distintos organismos 2
Figura 3. Estructura del retinol 4
Figura 4. Carotenoides presentes en microalgas 10
Figura 5. Esquema del transporte de electrones y el ciclo de las xantofilas 12
Figura 6. Especie del subtipo Desmodesmus 14
Figura 7. Especie del subtipo Scenedesmus 14
Figura 8. Ruta del mevalonato a prenil fosfatos 15
Figura 9. Ruta de 1-deoxixilulosa-5-fosfato a prenil pirofosfatos 16
Figura 10. Síntesis de geranilgeranil pirofosfato (GGPP) 16
Figura 11. Biosíntesis de carotenoides en microalgas 17
Figura 12. Biorreactor airlift 26
Figura 13. Diagrama de bloques del desarrollo general de cada experimento 27
Figura 14. Cinética de crecimiento por PS y recuento celular directo en
fotobiorreactores con FP y LC 31
Figura 15. Cuantificación de pigmentos con FP y LC durante crecimiento 32
Figura 16. Cinética de crecimiento en experimentos con luz continua 33
Figura 17. Recuento celular en fotobiorreactores con luz continua 34
Figura 18. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con luz continua 35
Figura 19. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores con
luz continua 36
Figura 20. Porcentajes relativos de carotenoides identificados
por HPLC-DAD (LC) 37
Figura 21. Cuantificación de cetocarotenoides en fotobiorreactores con luz continua 39
Figura 22. Cinética de crecimiento de fotobiorreactores con fotoperiodo 40
Figura 23. Recuento celular directo en fotobiorreactores con fotoperiodo 41
Figura 24. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con fotoperiodo 41
Figura 25. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores
con fotoperiodo 42
Figura 26. Porcentajes relativos de carotenoides identificados
por HPLC-DAD (FP)
Figura 27. Cuantificación de cetocarotenoides en experimentos con fotoperiodo 44
Figura 28. Disminución del porcentaje de cetocarotenoides en el fotobiorreactor con FP
después de la aplicación de estrés nutricional y lumínico 45
1 INTRODUCCIÓN
1.1 Los carotenoides
1.1.1 Descripción
Los carotenoides son pigmentos terpenoides liposolubles, compuestos por 8 unidades de de
isopreno. Cuentan con una estructura básica lineal con dobles enlaces conjugados que
representa el grupo cromóforo, el cual absorbe la energía luminosa en la región visible del
espectro y le confiere a la molécula su coloración distintiva. La longitud de onda máxima a
la que absorbe cada carotenoide depende, entre otros factores, del número de dobles enlaces
conjugados y de la existencia de anillos cerrados en la molécula (Zechmeister, 1944, 1962),
de tal manera que se requieren 7 dobles enlaces conjugados para que un carotenoide
muestre un color perceptible (Meléndez-Martínez et al., 2007). Los carotenoides absorben
luz en la región azul y verde del espectro, y reflejan las longitudes de onda de las regiones
del amarillo, el naranja y el rojo.

Todos los carotenoides se derivan de la estructura C H la cual al sufrir reacciones de:
40 56,
hidrogenación, dehidrogenación, ciclización y oxidación, da lugar a diferentes compuestos
de este tipo. Como ejemplo se puede mencionar al β caroteno, (Fig. 1) el cual cuenta con
dos anillos en los extremos de su molécula.

Figura 1. Ejemplo de carotenoides: el β-caroteno (Eonseon, 2003)

Se han aislado alrededor de 600 carotenoides a partir de fuentes naturales. Los carotenoides
son sintetizados por una gran variedad de organismos, incluyendo las plantas, los hongos,
las bacterias y las algas (Fig. 2). Se estima que en la naturaleza se producen anualmente
más de 100.000.000 de toneladas de carotenoides (Meléndez-Martínez et al., 2004). La
mayor parte de esta cantidad se encuentra en forma de fucoxantina (en diversas algas) y en
los tres principales carotenoides de las hojas verdes: luteína, violaxantina y neoxantina.

1
1.1.2 Clasificación
De acuerdo a su composición química, los carotenoides se dividen en dos tipos:
Carotenos o compuestos hidrocarbonados
Xantofilas u oxicarotenos, que presentan oxígeno generalmente en los anillos
terminales de su estructura

Otro criterio de clasificación implica la forma en la que los carotenoides son sintetizados en
los organismos, y de acuerdo con esto, los carotenoides primarios son aquellos sintetizados
bajo condiciones normales y que favorecen el crecimiento, mientras que los carotenoides
secundarios se producen bajo condiciones especiales de estrés, principalmente estrés
nutricional, tal como la deficiencia de nitrógeno (Britton, 1988).

Figura 2. Carotenos y xantofilas presentes en distintos organismos (Umeno, 2005)
2
1.1.3 Características químicas
Debido a su naturaleza, los carotenoides son insolubles en agua y solubles en disolventes
no polares. Su grado de solubilidad dependerá de los grupos funcionales sustituyentes de la
molécula. Los carotenos son muy solubles en éter de petróleo y hexano, mientras que las
xantofilas se disuelven mejor en metanol o etanol. La solubilidad de los carotenoides es una
característica muy importante, puesto que influye directamente en la extracción y
purificación en los procesos industriales.

Otras propiedades de los carotenoides son: sensibilidad a la luz, el oxígeno, compuestos
ácidos y a temperaturas elevadas. Su mayor degradación se produce por reacciones de
oxidación. Dichas propiedades se reflejan en otras características como la atenuación del
nivel energético o “quenching” de los singuletes de oxígeno y el bloqueo de las reacciones
mediadas por radicales libres, también llamado “scavenging” o “trapping”.

Los carotenoides, en general, son más estables en sistemas con alto grado de insaturación
como los fotosistemas, ya que este tipo de sistemas acepta más fácilmente oxígeno y
radicales libres antes que el carotenoide. Por el contrario, en sistemas con lípidos saturados,
los carotenoides presentan mayor inestabilidad. En consecuencia estos compuestos pueden
actuar como prooxidantes o antioxidantes dependiendo del sistema donde se encuentren.
(Olmedilla et al., 2001)

Por lo anterior, se recomienda trabajar con los carotenoides en una atmósfera inerte
(nitrógeno), a baja temperatura (20ºC), en oscuridad o luz difusa, en condiciones libres de
ácido y con solventes libres de peróxido. (Pfander, 1992).

1.1.4 Importancia en la salud humana
Algunos carotenoides, además de otorgar un color atractivo a los distintos organismos
fotosintéticos, tienen la propiedad de presentar actividad como provitamina A, lo que
incrementa su importancia a nivel fisiológico y nutricional.

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