Monoklonale Antikorper: Herstellung und Charakterisierung

494 Pages·1990·12.15 MB·German

by  J. H. Peters

J. H. Peters H. Baumgarten (Hrsg.)
Monoklonale
Antikörper
Herstellung und Charakterisierung
Unter der Mitarbeit von zahlreichen Autoren
Mit einem Geleitwort von Georges Köhler
Zweite, überarbeitete und erweiterte Auflage
Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH
Professor Dr. JOHANN HINRICH PETERS
Abteilung für Immunologie
Zentrum für Hygiene und Humangenetik
der Georg-August-Universität
Kreuzbergring 57
D-3400 Göttingen
Dr. HORST BAUMGARTEN
Diagnostika Forschung der
Boehringer Mannheim GmbH
Bahnhofstraße 9-15
D-8132 Tutzing
Mit 74 Abbildungen
ISBN 978-3-540-50844-1
1. Auflage 1985
1. korrigierter Nachdruck 1988
CIP-Titelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Monoklonale Antikörper: Herstellung und Charakterisierung / J. H. Peters
H. Baumgarten. Unter Mitarb. von zahlr. Autoren. - 2. Aufl.
ISBN 978-3-540-50844-1 ISBN 978-3-662-08842-5 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-662-08842-5
NE: Peters, Johann H. [Mitverf.]; Baumgarten, Horst [Mitverf.]
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© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1985, 1990
Ursprünglich erschienen bei Springer-Verlag Berlin Heidelberg New Y ork 1990
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Satz-
2131/3145-54321 - Gedruckt auf säurefreiem Papier
Geleitwort
Auf der Frühjahrstagung der Immunologen in Freiburg hatte mich
l.H. Peters überzeugt, ein Geleitwort zu seinem und H. Baumgar
tens Methoden-Buch über "Monoklonale Antikörper" zu schrei
ben. Ich tue dies gern und nicht ohne gewissen Stolz. Schließlich
war ich selbst an einer Art Urversion eines solchen Buches, einer in
Englisch verfaßten Laborkursanleitung, beteiligt.
Es gefällt mir, daß der Anleitungs- und "Kochbuch"charakter
trotz des erheblichen Umfangs der vorliegenden Methodenlehre
erhalten blieb.
Die Editoren sind gleichzeitig auch Autoren zahlreicher Kapi
tel. Zusammen mit ihnen haben weitere 30 Autoren mitgewirkt.
Ein Teil von ihnen ist in Firmen beschäftigt, so daß auch Techni
ken der industriellen MAK-Herstellung berücksichtigt sind. Sie al
le haben sich dem Gesamtkonzept untergeordnet, das einen über
sichtlichen und verständlichen theoretischen Hintergrund und klar
gegliederte Rezepturen anbietet. So ist das Buch gleichzeitig auch
ein Kompendium immunologischer Techniken.
Belange des Tier- und Umweltschutzes werden durchgehend
berücksichtigt: bei allen Methoden werden jeweils diejenigen Vari
anten vorgestellt, die mit einem Minimum an Tieren auskommen.
Techniken, welche radioaktive Isotope benötigten, wurden prak
tisch vollständig durch ELISA-Techniken ersetzt. Somit hat dieser
umfangreicher gewordene Nachfolger des beliebten Laborbuches
alle Aussichten, eine Standard-Methodenlehre für die Herstellung
monoklonaler Antikörper zu werden.
Freiburg, den 7.7.1989 G. KÖHLER
Vorwort
Die Herstellung monoklonaler Antikörper (MAK) gehört heute zu
den Standardmethoden in immunologisch arbeitenden Laborato
rien. Mehr und mehr hält sie aber auch Einzug in die anderen Bio
wissenschaften. Ihre Anwendung beschränkt sich nicht mehr allein
auf die Forschung: monoklonale Antikörper haben die Diagnostik
revolutioniert, beginnen auch therapeutisch interessant zu werden
und sind somit auch als wirtschaftlicher Faktor nicht mehr fortzu
denken. Die Entdecker dieser Technik, G. Köhler und C. Milstein,
erlebten, daß ihre Technik sofort anerkannt, übernommen, verbes
sert und dann auf unzählige Fragestellungen angewandt wurde. Sie
sind 1984 für diese epochale Entdeckung mit dem Nobelpreis aus
gezeichnet worden.
Nach der Phase der Entdeckung und des Umbruchs macht je
de Disziplin eine Phase der Systematisierung und Standardisierung
durch. Am Ende dieser Phase ist aus einer Technik, die anfangs
vielleicht nur mit künstlerischem Geschick beherrscht werden
konnte, eine lehr- und lernbare Methode geworden. Zur Optimie
rung und Standardisierung der MAK-Herstellung haben viele
Gruppen in aller Welt beigetragen. Das angesammelte Wissen ist
aber weit gestreut und nicht immer zugänglich.
Herausgeber und Autoren dieses Buchs haben Erprobtes über
nommen, aber auch selbst in erheblichem Maße Einzelschritte so
weit als möglich und nötig systematisiert und optimiert. Nachdem
wir z. B. bei der eigentlichen Fusionsmethode praktisch jeden
Schritt in der Kette optimiert hatten, stellte sich heraus, daß dies zu
einer sehr viel höheren (1-2 Größenordnungen!) Klonausbeute
führte als bis dahin in der Literatur beschrieben worden war. Un
ser Bestreben war es dann, diese Methoden reproduzierbar, lehrbar
und damit beschreibbar zu machen.
Das Konzept der ersten Auflage war somit, dem Anfänger wie
dem Fortgeschrittenen aus sich heraus verständliche Anleitungen
im Stil eines "Kochbuchs" zu geben, wobei jede Methodenbe
schreibung in sich abgeschlossen war. In der hier vorliegenden
zweiten Auflage ist dieses Konzept beibehalten worden. Die Anlei
tungen werden wiederum ergänzt durch eine Reihe von Über
sichtskapiteln sowie durch Anleitungen zur Fehlersuche und -be
seitigung.
VIII Vorwort
Die erste Auflage zeichnete sich durch einen bedeutenden
Nachteil aus: Die Bücher hatten eine hohe Diffusionsrate. So
mußte ein stolzer Besitzer nur zu oft sein Exemplar im Nachbar
labor anstatt auf seinem Arbeitsplatz suchen. Um dem entgegenzu
wirken, haben wir die Masse der zweiten Auflage erheblich erhöht,
und das Fernziel einer späteren Auflage wird es sein, das Gewicht
so weit zu steigern, daß die Bücher nicht mehr transportierbar sind
(im Deutschen nennt man sie dann Handbuch).
Der Umfang des Buches hat tatsächlich erheblich zugenom
men: Zahlreiche weitere Methodenbeschreibungen wurden neu
aufgenommen, vor allem aber der Gesamtbereich der Herstellung
menschlicher MAK. Rechtliche und Aspekte der industriellen Her
stellung wurden mit aufgenommen, stark mitgeprägt durch die neu
hinzugekommenen Autoren aus der Forschungsabteilung der Fir
ma Boehringer Mannheim. Trotzdem ist kein Handbuch daraus ge
worden, weil eine wirkliche Vollständigkeit nicht angestrebt wurde
und ebenfalls wichtige, aber selten benutzte Techniken wie die
Herstellung von MAK der Ratte beiseite gelassen wurden. Statt
dessen nahmen wir uns vor, gerade dort besonders ausführlich zu
sein, wo der Anwender vermutlich die größten Schwierigkeiten
hat; so z. B. im Bereich der Immunisierung, der Zellkultur, der
Massenproduktion und bei praktischen und rechtlichen Fragen,
besonders auch im Zusammenhang mit dem in der Bundesrepu
blik Deutschland geltenden Tierschutzgesetz und mit dem Einsatz
von MAK im Menschen.
Antikörper lassen sich nur mit Hilfe von Immunzellen aus ei
nem lebenden Organismus gewinnen, sodaß der Einsatz von Ver
suchstieren notwendig ist. Auch die Herstellung monoklonaler An
tikörper muß - in der Phase der Immunisierung wie meist in der
Phase der Produktion - in Tieren stattfinden, und vollständig wird
man nie auf Tiere verzichten können. Dennoch gibt es eine Reihe
von Möglichkeiten, den Tierbedarf ganz erheblich zu senken. Hier
auf wird in den jeweiligen Kapiteln ausführlich eingegangen. Vor
allem betrifft dies die tiergerechte Haltung (Kap.2.1.2), die mög
lichst effiziente Immunisierung (Kap. 3.4 und 3.5), die Technik der
Gefrierkonservierung von Zellen (Kap. 5.3) und die Einsparung
von Feederzellen und Ersatz durch Wachstumsfaktoren (Kap. 5.2).
Am wichtigsten ist es aber, daß alle Möglichkeiten genutzt werden
sollen, von der Produktion der Antikörper in der Maus wegzukom
men und alle Möglichkeiten der Zellkultur zu nutzen (Kap. 7.3 und
7.4). Daher wurden alle Methoden, bei denen es um Versuchstiere
geht, so abgefaßt, daß man mit einem Minimum an Versuchstieren
auskommt.
Einige Kapitel stellen Originalinformationen dar, wie z. B. die
Ergänzung der in-vitro-Immunisierung menschlicher Zellen durch
akzessorische Zellen. So sind wir sicher, daß das Buch wieder eine
Fundgrube an Methoden und Tricks darstellt und wünschen uns,
Vorwort IX
daß es seinen Platz wiederum mehr im Labor als in den Regalen
der Bibliotheken findet.
Der Leser darf die Sicherheit haben, daß alle aufgeführten
Methoden bei uns praktisch erprobt worden sind. Dennoch kön
nen sich Fehler eingeschlichen haben: Für Hinweise auf Fehler
und für Ergänzungsvorschläge sind wir dankbar.
Die Methodenbeschreibungen enthalten wieder genaue Pro
dukt- und Firmenangaben. Diese Angaben gelten insofern, als wir
die Reagenzien selbst erprobt haben. Sie besagen nicht, daß ein
nicht aufgeführtes Konkurrenzprodukt nicht ebenso gut oder bes
ser ist. Insofern erheben unsere Angaben keinen Anspruch auf
Vollständigkeit. Bisweilen haben wir der Firma ein "z. B." vorange
stellt, um damit anzudeuten, daß dieses Produkt in vermutlich glei
cher Qualität auch bei vielen anderen Firmen zu erhalten ist. Und
trotz der Nähe zu Firmen und Firmenprodukten - irgendwelche
Beeinflussungen hat es nicht gegeben, so daß aUe Benennungen al
lein Entscheidungen der Autoren und Herausgeber waren.
Dem Ziel, ein möglichst einheitliches Buch zu gestalten, haben
sich die Autoren bereitwillig untergeordnet: Die Herausgeber
möchten den Autoren hierfür ganz besonders danken, da sie sich
viele Striche, Umstellungen und Ergänzungswünsche gefallen las
sen mußten.
Von den Herausgebern der ersten Auflage mußte Dr. M.
Schulze leider ausscheiden, da er sich anderen wissenschaftlichen
Aufgaben zuwandte; unter den Autoren der Einzelartikel gab es
ebenfalls einige Umschichtungen, vor allem konnten aber kompe
tente Autoren hinzugewonnen werden, die das Spektrum der
Aspekte erheblich vergrößerten.
Mit Ratschlägen, Hinweisen, Diskussionen und Arbeit am
Manuskript, wurde uns geholfen, vor allem von Herrn Dr. Christi
an Klein, Herrn Dr. Konrad Kürzinger und Herrn Dr. Göran Ock
lind. Herr Dip!. Bio!. Robert Gieseler hat die graphische Gestal
tung übernommen, Frau Dorothea Fey und Herrn Detlef Fried
richs danken wir für ihre unermüdliche praktische Laborarbeit,
Frau Rita Kuhn und Frau Ingrid Teuteberg für die Mitarbeit an
der Fertigstellung des Manuskriptes. Frau Ursula Peters, Frau
Prof. Anneliese Schimpl und Frau Dr. Hübner-Parajsz haben Teile
des Manuskriptes durchgesehen. Den Genannten und Ungenann
ten danken wir für ihre Mithilfe.
J. H. PETERS
H. BAUMGARTEN
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Prinzipien der Zellhybridisierung . . . . . . . 1
1.2 Eigenschaften und Bedeutung monoklonaler
Antikörper .................. ..... 4
1.3 Einsatz von monoklonalen Antikörpern am
Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . .. ...... 11
2 Vorbedingungen für die Hybridomtechnik . 17
2.1 Tierexperimentelles Arbeiten 17
2.1.1 Rechtliche Situation . . . . . . . . 17
2.1.2 Tierhaltung . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Ausrüstung des Zellkultur-Labors . 31
2.3 Ausrüstung für immunologische und biochemische
Nachweisverfahren ................ . 38
2.4 Organisation des Arbeitsablaufes (Zeitplan) und
Aufwandsabschätzung . . . . . . . . . . . . . . . 39
3 Immunisierung ................... . 41
3.1 Prinzipien und Strategien der Immunisierung von
Tieren ........... . 41
3.2 Auswahl des Immunogens . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.1 Native Antigene ................... 42
3.2.2 Modifizierte oder synthetisch hergestellte Antigene 44
3.3 Immunisierung von größeren Versuchstieren zur
Herstellung von Antiseren . . . . . . . . . . . . . . 47
3.4 Immunisierung von Mäusen. . . . . . . . . . . . . 48
3.4.1 Prinzipielles zur Immunisierung von Mäusen für die
Hybridomproduktion ........ 48
3.4.2 Methodik der Maus-Immunisierung . . . . . . . .. 51
3.5 Beeinflussung der Immunantwort . . . . . . . . . .. 58
3.5.1 Beeinflussung der Immunantwort durch die Wahl des
Mausstammes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 58
3.5.2 Beeinflussung der Immunantwort durch Adjuvantien. 58
3.5.3 Beeinflussung der Immunantwort durch
Toleranzinduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 63
3.5.4 Beeinflussung der Immunantwort durch Cytostatika . 67
3.5.5 Beeinflussung der Immunantwort durch Maskierung
besonders immunogener Epitope mit Antikörpern .. 68
XII Inhaltsverzeichnis
3.5.6 Beeinflussung der Immunantwort für die Erzeugung
bestimmter Immunglobulin-Subldassen . 69
4 Blutentnahme und Präparation von Zellen 71
4.1 Blutentnahme bei Versuchstieren 71
4.1.1 Blutentnahme bei der Maus . . 71
4.1.2 Blutentnahme bei der Ratte . . . 73
4.1.3 Blutentnahme beim Kaninchen . 75
4.1.4 Blutentnahme bei Schaf und Ziege 77
4.2 Präparation von Lymphozyten aus Milz und
Lymphknoten. . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.3 Präparation von humanen Lymphozyten aus
peripherem Blut, Tonsillen und Milz . 80
4.4 Anreicherung von antigenspezifischen
Lymphoblasten für die Fusion .... 82
4.5 Präparation von Maus-Peritoneal-Makrophagen als
Feederzellen 86
5 Zellkultur . . 89
5.1 Voraussetzungen für die Zellkultur 89
5.1.1 Reinigen, Desinfizieren und die Vermeidung von
Toxizität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5.1.2 Plastikware, Wasser, Medien, Seren und Zusätze 92
5.1.3 Die Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.2 Zusätze zu Medien: Wachstumsfaktoren,
konditionierte Medien . . . . . . . . . . . 99
5.3 Gefrierkonservierung. . . . . . . . . . . . . 102
5.3.1 Gefrierkonservierung von Zellen unmittelbar nach der
Fusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.3.2 Gefrierkonservierung von Hybridomzellen in
Zellkulturplatten . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
5.3.3 Lagern von Lymphozyten in der Kälte. . . . . 109
5.3.4 Computerverwaltung von eingefrorenen Zellen . 110
5.4 Bakterien-und Pilzinfektionen . . . . . . . . . . 111
5.5 Eingrenzen einer Infektion in Mehrnapfschalen . . 114
5.6 Mykoplasmen ................... . 115
5.6.1 Mykoplasmen-Anreicherungskulturen auf Nährböden 118
5.6.2 Fluoreszenztest zum Nachweis von Mykoplasmen
Infektionen in Kulturen adhärenter und suspendierter
Zellen ........................... 124
5.6.3 Immunologische und genetische Mykoplasmen-Tests . 129
5.6.4 Reinigung Mykoplasmen-inflZierter Zellen .... . 131
5.6.4.1 Mykoplasmen-Elimination durch Antibiotika. .. . 131
5.6.4.2 Reinigung Mykoplasmen-infizierter Zellen durch
Kokultur mit Makrophagen . . . . . . . . . . . .. . 132
5.7 Fluoreszenztest zur Bestimmung der Vitalität von
Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 135
Inhaltsverzeichnis XIII
6 Herstellung von Hybridomen . . . . . . . . . . . .. . 139
6.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 139
6.1.1 Eigenschaften und Herstellung von Myelom- und
Tumorlinien . . . . . . . . . . . . . . . .139
6.1.2 Selektionsprinzipien . . . . . . . . . . . . . . . · 141
6.1.3 Übersicht über Maus-Myelom-Linien ..... · 149
6.2 Zellfusion zur Herstellung von monoklonalen
Antikörpern der Maus . . . . . . . . . . . . . . · 150
6.3 Human-Hybridomtechnik ........... . · 158
6.3.1 Fusionspartner-Linien und Methoden zur Herstellung
menschlicher monoklonaler Antikörper . . . . . 158
6.3.2 Grundlagen der in-vitro-Immunisierung . . . . . 165
6.3.3 Vorbereitung humaner B-Lymphozyten für die
in-vitro-Immunisierung: Prinzipien . . . . . . . . 170
6.3.4 Vorbereitung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . 171
6.3.4.1 Entfernung von T-Lymphozyten durch Panning . . 171
6.3.4.2 Gewinnung von Monozyten durch Adhärenz .. . 172
6.3.4.3 Differenzierung akzessorischer Zellen aus Monozyten 173
6.3.4.4 Entfernung Lysosomen-reicher Zellen . . . . 175
6.3.5 Zusätze zu Immunisierungsansätzen . . . . . 176
6.3.5.1 T-Zell-Rosettierung und Gewinnung eines
konditionierten Mediums . . . . . . . . . . · 176
6.3.6 Ansätze für die in-vitro-Immunisierung menschlicher
Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178~
6.3.7 Fusion menschlicher Zellen . . . . . . . . . . . . 181
6.3.8 Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformation und
EBV-Hybridom-Technik ............ . · 182
6.3.8.1 EBV-Transformation .............. . · 182
6.3.8.2 Heteromyelomtechnik: Fusion EBV-transformierter
B-Lymphozyten mit Maus-Myelomzellen . . 185
6.3.8.3 Transfektion des Geneticin-Resistenz-Gens . 186
6.3.9 Fusion mit Cytoplasten . . 187
6.3.10 DNA-Transformation . . . 189
6.4 Andere Fusionsmethoden . 191
6.4.1 Fusion mit Viren . . . . . . 191
6.4.2 Elektrofusion . . . . . . . . 191
6.5 Berechnung der zu erwartenden Zahl von
Hybridom-Klonen . . . . . . . . . . . . . . 193
6.6 Kultur und Anreicherung von Hybridomen . 195
6.6.1 Anzucht von Hybridomen, Probeaussaat . . . 195
6.6.2 Fehlersuche bei der Herstellung und Aufzucht von
Hybridomen .......... . 198
6.7 Zellklonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 203
6.7.1 Limiting-Dilution-Klonierung. . . . . . . . . . .. . 204
6.7.2 Zellklonierung mit Hilfe der Durchflußzytometrie . 206
6.8 Identifizierung von humanem Genom in
Maus-Mensch-Hybridomen . . . . . . . . . . . .. . 212