monitoraggio biologico dell'esposizione ad inquinanti aerodispersi nei luoghi di vita e di lavoro

165 Pages·2008·2.15 MB·Italian

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA
DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE DELLA PREVENZIONE
XX CICLO (2005-2007)

MONITORAGGIO BIOLOGICO DELL’ESPOSIZIONE
AD INQUINANTI AERODISPERSI NEI LUOGHI DI
VITA E DI LAVORO: SVILUPPO DI NUOVI
INDICATORI IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA

Coordinatore:
Chiar.mo Prof. ANTONIO MUTTI

Tutor:
Dott. PAOLA MANINI

Dottoranda:
ROBERTA ANDREOLI
RIASSUNTO

La diminuzione dei livelli di esposizione negli ambienti di lavoro e l’aumento degli
inquinanti urbani hanno reso sempre più complessa la caratterizzazione
dell’esposizione, evidenziando la necessità di sviluppare nuovi indicatori di esposizione
e di effetto sufficientemente sensibili per distinguere le due condizioni.  
La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ha permesso di: (i)
individuare nuovi indicatori di esposizione, in grado di quantificare l’esposizione ad
inquinanti presenti in tracce nell’ambiente di vita o di lavoro, garantendo l’affidabilità e
la precisione della misura analitica; (ii) approfondire le conoscenze sugli indicatori di
effetto e sui meccanismi che ne regolano le alterazioni in soggetti esposti a basse dosi di
inquinanti ambientali ed occupazionali; (iii) contribuire alla validazione di una nuova
matrice, il condensato dell’aria espirata, per il monitoraggio biologico di indicatori di
esposizione e di effetto per sostanze pneumotossiche, il cui interesse principale è
condizionato dall’importanza del polmone come organo bersaglio degli inquinanti
aerodispersi.
ABSTRACT

Exposure levels at the workplace are continuously decreasing while the concentration of
environmental pollutants shows an opposite increasing trend, thus making the exposure
characterization a complex issue. For this reason, it is necessary to develop novel
exposure and effect biomarkers capable to distinguish between the two different
conditions.
Liquid chromatography tandem mass spectrometry allowed: (i) to develop new
exposure biomarkers for human biological monitoring in living and working
environments with adequate reliability and satisfying precision even at the trace level;
(ii) to widen the knowledge of effect biomarkers and to study mechanisms that cause
their modifications in subjects exposed to low levels of environmental and occupational
xenobiotics; (iii) to contribute to the validation of a new biological matrix, the exhaled
breath condensate, arising from the lungs and useful for the biological monitoring of
exposure and effect of pneumotoxic substances.
Sommario

1. INTRODUZIONE ................................................................................ 1
1.1 La spettrometria di massa ....................................................................................... 2
1.2 Applicazioni della spettrometria di massa in campo occupazionale ...................... 4
1.3 Nuovi sviluppi nel monitoraggio biologico ............................................................ 5
1.4 Stress ossidativo ...................................................................................................... 7
1.5 Il condensato dell’aria espirata ............................................................................... 9
1.5.1 Indicatori biologici determinabili nel condensato dell’aria esalata ............... 10
1.5.2 Sistemi per la raccolta del condensato dell’aria espirata ............................... 12
1.5.3 Applicazioni del condensato dell’aria espirata in campo clinico .................. 13

2. SCOPI DELLA TESI ........................................................................ 15
2.1 La qualità del dato e la validità analitica .............................................................. 16
2.2 Indicatori di esposizione e di effetto in soggetti esposti a basse dosi di inquinanti
ambientali ed occupazionali. ....................................................................................... 17
2.3 Il condensato dell’aria espirata ............................................................................. 19

3. QUALITA’ DEL DATO E VALIDITA’ ANALITICA ............ 20
3.1 Affidabilità delle misure e confronto interlaboratorio .......................................... 21
3.1.1 Materiali e Metodi ......................................................................................... 22
3.1.1.1 Soggetti ................................................................................................... 22
3.1.1.2 Reagenti .................................................................................................. 22
3.1.1.3 Disegno dello studio ............................................................................... 22
3.1.1.4 Monitoraggio biologico .......................................................................... 23
3.1.2 Risultati e Discussione ................................................................................... 24
3.2 Analisi quantitativa ............................................................................................... 26
3.2.1 Materiali e Metodi ......................................................................................... 27
3.2.1.1 Soggetti ................................................................................................... 27
3.2.1.2 Reagenti .................................................................................................. 27
3.2.1.3 Modalità di raccolta del condensato dell’aria espirata e preparazione del
campione ............................................................................................................. 27
i
3.2.1.4 Determinazione delle aldeidi in campioni di condensato dell’aria espirata
............................................................................................................................ 28
3.2.2 Risultati e Discussione ................................................................................... 29

4. INDICATORI DI ESPOSIZIONE E DI EFFETTO IN
ESPOSTI A BASSE DOSI DI INQUINANTI AMBIENTALI ED
OCCUPAZIONALI ................................................................................ 31
4.1 Monitoraggio ambientale e biologico dell’esposizione a basse dosi di benzene in
un gruppo di tassisti: ruolo del polimorfismo genetico .............................................. 32
4.1.1 Materiali e Metodi ......................................................................................... 32
4.1.1.1 Soggetti ................................................................................................... 32
4.1.1.2 Reagenti .................................................................................................. 33
4.1.1.3 Monitoraggio Ambientale ....................................................................... 33
4.1.1.4 Monitoraggio Biologico .......................................................................... 34
4.1.1.5 Caratterizzazione dei genotipi metabolici ............................................... 35
4.1.1.6 Statistica .................................................................................................. 35
4.1.2 Risultati e Discussione ................................................................................... 36
4.2 Indicatori di esposizione e di effetto in soggetti esposti a stirene ........................ 39
4.2.1. Materiali e Metodi ........................................................................................ 41
4.2.1.1 Soggetti ................................................................................................... 41
4.2.1.2 Reagenti .................................................................................................. 42
4.2.1.3 Monitoraggio ambientale ........................................................................ 42
4.2.1.4 Monitoraggio biologico .......................................................................... 42
4.2.1.5 Caratterizzazione genotipica ................................................................... 44
4.2.1.6 Statistica .................................................................................................. 45
4.2.2 Risultati e Discussione ................................................................................... 45
4.2.2.1 Monitoraggio biologico dell’esposizione a stirene ................................. 45
4.2.2.2 Indicatori di danno ossidativo al DNA e associazione con l’esposizione a
stirene .................................................................................................................. 47
4.2.2.3 Polimorfismo genetico dell’hOgg1 ......................................................... 53

ii
5. IL CONDENSATO DELL’ARIA ESPIRATA ........................... 57
5.1 Materiali e Metodi ................................................................................................ 59
5.1.1 Soggetti .......................................................................................................... 59
5.1.2 Modalità di raccolta del condensato dell’aria espirata ................................... 60
5.1.3 Monitoraggio Ambientale .............................................................................. 60
5.1.4 Monitoraggio Biologico ................................................................................. 61
5.1.5 Statistica ......................................................................................................... 62
5.2.1 Studio 1: Valutazione dell’influenza della temperatura di raccolta del
condensato dell’aria espirata sugli indicatori di effetto .......................................... 63
5.2.2 Studio 2: Indicatori di effetto nel condensato dell’aria espirata di soggetti
professionalmente esposti a Cromo ........................................................................ 65
5.2.3 Studio 3: Indicatori di effetto nel condensato dell’aria espirata di soggetti
professionalmente esposti a sostanze irritanti ......................................................... 66

6. CONCLUSIONI ................................................................................. 68

7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 70

8. ELENCO ALLEGATI ...................................................................... 83

9. APPENDICE .......................................................................................... I
iii
1. INTRODUZIONE
INTRODUZIONE

1.1 La spettrometria di massa

Tecniche analitiche che si basano sulla spettrometria di massa, anche se relativamente
costose, sono considerate tecniche di riferimento in quanto hanno caratteristiche
superiori e uniche di specificità, selettività e sensibilità necessarie per l’identificazione e
la determinazione di agenti tossici e dei loro metaboliti presenti a livello di tracce o di
ultra-tracce in matrici biologiche complesse. La spettrometria di massa viene oggi
ampiamente utilizzata come tecnica di riferimento per l’analisi di elementi metallici in
tracce utilizzando una sorgente di plasma ad accoppiamento induttivo (ICP-MS).
L’accoppiamento della spettrometria di massa con tecniche cromatografiche ha portato
dapprima allo sviluppo ed alla diffusione della gascromatografia-spettrometria di massa
(GC-MS) e, in tempi più recenti, a quello della cromatografia liquida-spettrometria di
massa (LC-MS). Queste tecniche rendono possibile, rispettivamente, l’analisi di
sostanze organiche volatili e dei loro metaboliti in matrici biologiche. Entrambe queste
tecniche sono oggi disponibili in una versione cosiddetta tandem (MS/MS) che utilizza
due analizzatori quadrupolari in serie separati da una cella di collisione. Questo tipo di
configurazione consente di ottenere una ulteriore dimensione nella separazione degli
analiti e di aumentare ulteriormente le caratteristiche di selettività delle tecniche in
oggetto.
In particolare, l’elevata potenzialità della tecnica combinata LC-MS/MS si basa
sulla possibilità di sfruttare e unire i vantaggi delle due tecniche individualmente
considerate: la cromatografia liquida, tecnica separativa efficiente e selettiva, è di per sé
compatibile con le matrici biologiche acquose; la spettrometria di massa è
intrinsecamente specifica e sensibile ed è caratterizzata da intervallo di linearità molto
ampio (4-5 ordini di grandezza) nel caso in cui si utilizzino analizzatori quadrupolari.
Se confrontata con altre tecniche analitiche, la LC-MS/MS permette la riduzione o, in
alcuni casi, l’eliminazione del trattamento del campione, limitando la possibilità di
generare artefatti, riduce i tempi di analisi aumentando la produttività, è robusta e
automatizzabile, e permette la determinazione di composti presenti nel campione a
intervalli di concentrazione differenti.
In tossicologia industriale, la tecnica LC-MS(/MS) è stata utilizzata solo di
recente e il numero di applicazioni è ancora limitato rispetto ad altri campi scientifici
come la farmacocinetica (Lim et al., 2002), la chimica clinica e la tossicologia forense
2
INTRODUZIONE
(Marquet et al., 2002). Alcuni recenti studi basati sull’utilizzo della LC-MS(/MS) hanno
evidenziato chiaramente il potenziale di questa tecnica sia nella determinazione di
indicatori di esposizione tradizionali che negli studi di metabolismo volti ad investigare
vie metaboliche minori e ad identificare nuovi e più specifici indicatori biologici
(Manini et al., 2004).
Benché la possibilità di identificare nuovi metaboliti sia un aspetto ritenuto assai
interessante, l’analisi quantitativa rappresenta uno dei principali obiettivi della
spettrometria di massa. Questa esigenza rende ragione del fatto che gli analizzatori
quadrupolari a bassa risoluzione (inclusi i sistemi MS/MS a triplo quadrupolo) abbiano
avuto il sopravvento rispetto ai sistemi ad alta risoluzione, più adatti all’identificazione
di nuovi composti attraverso la determinazione della massa esatta. A dispetto
dell’apparente semplicità nell’ottenere risultati quantitativi, rispetto ad altre tecniche
analitiche, la qualità delle determinazioni dipende da diversi fattori: (i) la
concentrazione degli analiti di interesse; (ii) la disponibilità di standard
commercialmente disponibili e adeguati standard interni, in particolare quelli marcati
isotopicamente; (iii) la disponibilità di campioni di controllo e materiali certificati di
riferimento; (iv) e la disponibilità di programmi di controllo qualità esterni. Inoltre,
recenti studi hanno evidenziato chiaramente che la LC-MS/MS risente dell’effetto
matrice (Choi et al., 2001; Ito et al., 2002). E’ stato ipotizzato che esista una
competizione tra i componenti della matrice e gli analiti di interesse per la ionizzazione
e che l’efficienza di formazione dello ione-analita possa essere favorita o sfavorita a
seconda dell’intorno nel quale la ionizzazione avviene. La soppressione del segnale può
essere causata da composti non volatili e non trattenuti dalla cromatografia, sovra-
caricamento della colonna, o da soluti non volatili. Sfortunatamente sia l’incremento
che la depressione del segnale non sono fenomeni prevedibili e sono sia analita che
concentrazione dipendente, quindi le problematiche legate all’effetto matrice vanno
affrontate ogni volta che si vuole determinare un nuovo composto. Se non
adeguatamente considerato nel corso della validazione del metodo, l’effetto matrice può
portare a una diminuzione di precisione e accuratezza, specialmente a basse
concentrazioni, rendendo inaffidabili i risultati dell’analisi quantitativa.
3
INTRODUZIONE

1.2 Applicazioni della spettrometria di massa in campo occupazionale

E’ da circa un decennio che le tecniche GC/MS ed LC-MS/MS sono disponibili presso
il Laboratorio di Tossicologia Industriale dell’Università di Parma, che è stato uno dei
primi centri di ricerca in Italia ad applicare la spettrometria di massa a problematiche di
Medicina Occupazionale ed Ambientale. Grazie all’impiego di queste due tecniche è
stato possibile rivisitare il metabolismo dell’esano (Andreoli et al., 1998; Manini et al.,
1998), solvente di interesse tossicologico per le proprietà neurotossiche del 2,5-
esandione (2,5-HD), metabolita di fase I attualmente utilizzato come indicatore per il
monitoraggio biologico.
La caratterizzazione dei metaboliti di fase I dell’esano è stata possibile
combinando i risultati ottenuti mediante GC/MS ed LC-MS/MS con sistema di
ionizzazione Atmospheric Pression Chemical Ionization (APCI) (Andreoli et al., 1998)
su campioni di urina di ratto dopo idrolisi enzimatica e acida, mentre i metaboliti di fase
II, in particolare i composti glicuro-coniugati, sono stati identificati mediante LC-
MS/MS utilizzando la tecnica di ionizzazione Electrospray (ESI) (Manini et al., 1998).
I risultati ottenuti confrontando le differenti tecniche analitiche e di ionizzazione hanno
permesso di individuare nelle forme glicuro-coniugate del 2-esanolo e del 5-idrossi-2-
esanone i principali metaboliti urinari dell’esano e di verificare che l’idrolisi del
campione seguita da analisi gascromatografica genera artefatti, tra cui metilfurani, γ-
valerolattone ed una quantità circa dieci volte superiore di 2,5-HD, il cosiddetto 2,5-HD
“totale”, rispetto al contenuto di 2,5-HD nelle urine analizzate senza trattamento del
campione, chiamato invece 2,5-HD “libero”. Questo approfondimento del metabolismo
dell’esano ha avuto importanti risvolti in campo occupazionale: il 2,5-HD “libero” è un
indicatore appropriato sia da un punto di vista analitico che da un punto di vista
tossicologico per obiettivi di monitoraggio biologico, dal momento che il rischio di
neurotossicità dei composti coniugati è trascurabile (Manini et al., 1999). E’ per questo
motivo che nell’anno 2001, l’American Conference of Governmental Industrial
Hygienists (ACGIH) ha cambiato il BEI® dell’esano, raccomandando la determinazione
della forma di 2,5-HD “libera” piuttosto che quella “totale” (ACGIH, 2004).
Un altro composto di cui è stato possibile studiare il metabolismo è
rappresentato dal naftalene. Grazie all’impiego della LC-MS/(MS) è possibile effettuare
il monitoraggio biologico dell’esposizione a questo idrocarburo policiclico aromatico
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