Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik: Grundlegende Methoden und Anwendungen

335 Pages·2010·3.01 MB·German

by  Ulrich Busch (auth.)

Molekularbiologische Methoden in der
Lebensmittelanalytik

Ulrich Busch
Herausgeber
Molekularbiologische
Methoden in der
Lebensmittelanalytik
Grundlegende Methoden und Anwendungen
1  3
Herausgeber
Dr. Ulrich Busch
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und
Lebensmittelsicherheit
Veterinärstraße 2
85764 Oberschleißheim
Deutschland
[email protected]
ISBN 978-3-642-10715-3 e-ISBN 978-3-642-10716-0
DOI 10.1007/978-3-642-10716-0
Springer Heidelberg Dordrecht London New York
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Inhalt
1   Molekulare Lebensmittelanalytik .............................................................. 1
Ulrich Busch
1.1 Einleitung ............................................................................................. 1
2   Kultivierungsverfahren für Bakterien ...................................................... 5
Ute Messelhäußer
2.1 Einleitung ............................................................................................. 5
2.2 Anreicherungsverfahren ....................................................................... 7
2.2.1 Nichtselektive flüssige Nährmedien ........................................ 7
2.2.2 Selektive Flüssignährmedien ................................................... 9
2.2.3 Nichtselektive Festnährböden .................................................. 11
2.2.4 Selektive Festnährmedien ........................................................ 12
2.3 Kultivierungsbedingungen ................................................................... 15
2.3.1 Temperatur ............................................................................... 15
2.3.2 Sauerstoffgehalt ....................................................................... 16
2.3.3 Weitere Wachstumsfaktoren .................................................... 17
2.4 Qualitätssicherung bei der Kultivierung .............................................. 17
Literatur ......................................................................................................... 17
3   Extraktion von DNA ................................................................................... 19
Bert Pöpping und Claudia Unterberger
3.1 Einleitung ............................................................................................. 20
3.2 Grundlagen der DNA-Extraktion ......................................................... 21
3.2.1 Lyse .......................................................................................... 21
3.2.2 Entfernung von inhibitorischen Substanzen
und Gewinnung reiner DNA .................................................... 22
3.2.3 Nukleinsäurequantität und Qualität ......................................... 25
3.3 DNA-Extraktion aus tierischen und pflanzlichen Geweben ................ 27
3.3.1 DNA-Extraktion aus tierischen Geweben ............................... 27
3.3.2 DNA-Extraktion aus pflanzlichen Geweben ........................... 33
3.3.3 Zusammenfassende Bewertung ............................................... 33
Literatur ......................................................................................................... 34
v
vvii Inhalt
4   PCR und Real-Time PCR ......................................................................... 35
Regina Konrad und Ulrich Busch
4.1 Einführung ......................................................................................... 35
4.2 PCR-Reaktion und Komponenten ...................................................... 36
4.2.1 PCR ........................................................................................ 36
4.2.2 Real-Time PCR ...................................................................... 37
4.2.3 Fluoreszenzfarbstoffe in der Real-Time PCR ......................... 39
4.2.4 Modifikationen von Sonden ................................................... 40
4.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis ............................................ 40
4.4 Optimierung und Validierung ............................................................ 43
4.5 Bestätigungsreaktionen ...................................................................... 43
4.6 Qualitätssicherung im PCR-Labor und Kontrollen ............................ 44
4.7 PCR-basierte Typisierungstechniken ................................................. 46
4.8 Schlussfolgerung ................................................................................ 46
Literatur ....................................................................................................... 46
5   Biochips und ihr Einsatz in der Lebensmittelanalytik .......................... 49
Ingrid Huber und Patric Zeltz
5.1 Einleitung ........................................................................................... 49
5.1.1 Definitionen: Biochip – Microarray ...................................... 50
5.1.2 Vorteile und Limitierungen .................................................... 50
5.1.3 Trägermaterialien ................................................................... 51
5.1.4 Herstellung von Biochips ...................................................... 51
5.1.5 Trägerformate ........................................................................ 52
5.1.6 Nachweisverfahren ................................................................ 52
5.1.7 Marker ................................................................................... 55
5.1.8 Messprinzipien/Lesegräte ...................................................... 56
5.1.9 Alternative Technologien ....................................................... 57
5.1.10 Auswertung/Bioinformatik .................................................... 57
5.2 Einsatz der Biochips in der Lebensmittelanalytik ............................. 58
5.2.1 Nachweis von pathogenen Mikroorganismen
mittels NUTRI®-Chip ............................................................ 58
5.2.2 Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen
(GVOs) mittels DualChip® GMO (V2.0) .............................. 60
5.2.3 Nachweis von Tierarten ......................................................... 61
5.3 Ausblick ............................................................................................. 64
Literatur ....................................................................................................... 64
6   Alternative Nachweisverfahren – nicht PCR-basierende 
Schnellmethoden ....................................................................................... 67
Barbara Schalch und Martin Wagner
6.1 Einleitung ........................................................................................... 67
6.2 Zytometrieverfahren .......................................................................... 69
6.3 Varianten der kulturellen Anzucht ...................................................... 69
6.4 Nucleinsäurebasierende Verfahren ..................................................... 71
Inhalt vviiii
6.5 Immunologische Verfahren ................................................................ 73
6.6 Nachweis bestimmter Stoffwechselleistung von Mikroorganismen .... 74
6.7 Biosensoren und Nanotechnologie .................................................... 79
Literatur ....................................................................................................... 80
7   Pathogene Mikroorganismen ................................................................... 89
Martin Wagner
7.1 Die Bedeutung von pathogenen Mikroorganismen ........................... 89
7.1.1 Pathogene Mikroorganismen und das öffentliche
Gesundheitswesen ................................................................. 90
7.1.2 Pathogene Mikroorganismen in der Lebensmittelkette ......... 91
7.2 Molekularbiologische Analytik von
pathogenen Mikroorganismen ............................................................ 92
7.3 Kleine Entwicklungsgeschichte in der Analytik pathogener
Mikroorganismen ................................................................................ 93
7.4 Probenvorbereitung ............................................................................ 96
7.4.1 Probleme des Samplings ........................................................ 96
7.4.2 Probengröße und molekularbiologische Analytik ................. 96
7.5 Molekularbiologische Nachweis-
und Quantifizierungssysteme für pathogene Mikroorganismen ........ 97
7.5.1 Polymerase-Kettenreaktion: Eine neue Ära in der
mikrobiellen Lebensmittelanalytik? ...................................... 97
7.5.2 Nachweis pathogener Mikroorganismen mittel RT-PCR ...... 97
7.5.3 Die Lebend/Tot-Problematik beim molekularbio-
logischen Nachweis von pathogenen Mikroorganismen ....... 100
7.5.4 Kontrollen in der molekularbiologischen Analytik ............... 101
7.5.5 Qualitätssicherung in der molekularbiologischen
Analytik von pathogenen Mikroorganismen ......................... 102
Literatur ..................................................................................................... 104
8   Molekularbiologische Methoden zum Nachweis 
lebensmittelübertragbarer Viren ............................................................. 107
Barbara Becker
8.1 Humanpathogene Viren, die durch Lebensmittel
übertragen werden .............................................................................. 107
8.1.1 Charakterisierung der durch Lebensmittel- und
Trinkwasser übertragbaren Viren ........................................... 108
8.1.2 Lebensmittel als Virusüberträger ........................................... 109
8.2 Medizinische Virusdiagnostik ............................................................ 110
8.3 Nachweis von Viren, die durch Lebensmittel
übertragen werden .............................................................................. 111
8.3.1 RT-PCR (Reverse Transkriptase
Polymerase-Kettenreaktion) .................................................. 111
8.3.2 mRT-PCR (multiplex RT-PCR) ............................................. 112
8.3.3 Nested RT-PCR ...................................................................... 112
vviiiiii Inhalt
8.3.4 ICC-PCR (Integrated Cell Culture-PCR) ......................... 113
8.3.5 AC/IM RT-PCR (Antigen-Capture/
Immunomagnetic beads RT-PCR) .................................... 114
8.3.6 Real-time PCR/real-time RT-PCR .................................... 114
8.3.7 NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) ... 116
Literatur ..................................................................................................... 117
 9   Molekularbiologische Speziesdifferenzierung ...................................... 121
Dietrich Mäde
9.1 Einleitung ........................................................................................ 121
9.2 Molekularbiologische Speziesdifferenzierung ................................ 124
9.2.1 DNA-Extraktion ............................................................... 125
9.2.2 Tierartnachweis durch direkte
DNA-Hybridisierung mit spezifischen Sonden ................ 126
9.2.3 Speziesnachweis durch Polymerase-Kettenreaktion ......... 127
Literatur ..................................................................................................... 139
10   Die Untersuchung auf gentechnische Veränderungen 
(„GVO-Analytik“) ................................................................................... 143
Hans-Ulrich Waiblinger
10.1 Einführung ...................................................................................... 143
10.1.1 Gentechnisch veränderte Organismen .............................. 143
10.1.2 Einsatz der Gentechnik, aktuelle Situation ....................... 144
10.1.3 Rechtliche Grundlagen und Anforderungen an
die Analytik ....................................................................... 144
10.2 Mögliche Nachweisstrategien ........................................................ 145
10.2.1 Nachweis des Phänotyps ................................................... 145
10.2.2 Nachweis des Genotyps .................................................... 147
10.3 Probenahme .................................................................................... 149
10.4 Molekularbiologische Nachweisverfahren ..................................... 150
10.4.1 DNA-Extraktion ............................................................... 151
10.4.2 Nachweis mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ....... 152
Literatur ..................................................................................................... 164
11     Analytik von Lebensmittelallergenen .................................................... 169
Anja Demmel und Alexandra Hahn
11.1 L ebensmittelallergien ..................................................................... 170
11.2 R echtlicher Hintergrund ................................................................. 171
11.3 N achweismethoden für Allergene in Lebensmitteln ...................... 172
11.3.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ............................ 173
11.3.2 Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain
reaction, PCR) ................................................................... 174
11.3.3 Vergleich der Nachweismethoden PCR und ELISA ......... 175
11.3.4 Nachweis von Gluten und glutenhaltigem
Getreide in Lebensmitteln ................................................. 175
Inhalt iixx
11.3.5 Nachweis von Krebstieren in Lebensmitteln .................... 177
11.3.6 Nachweis von Ei in Lebensmitteln ................................... 177
11.3.7 Nachweis von Fisch in Lebensmitteln .............................. 178
11.3.8 Nachweis von Soja in Lebensmitteln ................................ 179
11.3.9 Nachweis von Milch in Lebensmitteln ............................. 179
11.3.10 Nachweis von Schalenfrüchten in Lebensmitteln ............. 180
11.3.11 Nachweis von Erdnüssen in Lebensmitteln ...................... 184
11.3.12 Nachweis von Sellerie in Lebensmitteln ........................... 185
11.3.13 Nachweis von Senf in Lebensmitteln ............................... 185
11.3.14 Nachweis von Sesam in Lebensmitteln ............................ 186
11.3.15 Nachweis von Lupinen in Lebensmitteln ......................... 186
11.3.16 Nachweis von Weichtieren in Lebensmitteln .................... 187
11.3.17 Multiplex-PCR .................................................................. 187
11.4 A usblick .......................................................................................... 187
Literatur ..................................................................................................... 188
12   Molekulare Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung 
und zum Monitoring der Mykotoxinbildung 
lebensmittelrelevanter Pilze ................................................................... 193
Rolf Geisen
12.1 Einleitung ....................................................................................... 193
12.2 Grundlagen der molekularen Methode ........................................... 195
12.3 Zielsequenzen ................................................................................. 196
12.4 Sensitivität der PCR-Reaktionen .................................................... 199
12.5 Molekularer Nachweis mykotoxinbildender Pilze ......................... 200
12.5.1 Nachweis von aflatoxinbildenden Pilzen ......................... 200
12.5.2 Nachweis von myotoxinbildenden Fusarien .................... 202
12.5.3 Nachweis von ochratoxinbildenden Pilzen ...................... 205
12.6 Microarrays zum Nachweis und zur taxonomischen
Charakterisierung von Pilzen ......................................................... 208
12.7 Monitoring der Expression mykotoxinbiosynthetischer Gene ....... 210
12.8 Zusammenfassung .......................................................................... 213
Literatur ..................................................................................................... 214
13   Einsatz molekularer Methoden für Starterkulturen ........................... 221
Matthias A. Ehrmann und Melanie Pavlovic
13.1 Starterkulturen ................................................................................ 221
13.2 Notwendigkeit molekularer Methoden ........................................... 222
13.3 Methoden für Identifizierung und Nachweis ................................. 224
13.3.1 Vergleichende Sequenzierung von Markergenen ............. 224
13.3.2 Anwendung von Gensonden ............................................. 228
13.3.3 Direkter Nachweis durch PCR-gestützte Techniken ........ 230
13.3.4 Verfahren zur Genotypisierung durch
DNS-Polymorphismen ..................................................... 230
13.3.5 PCR-gestützte Verfahren zur Genotypisierung ................ 235