Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo- Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung ...

335 Pages·2013·9.81 MB·German

Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Institut für Mikrobiologie und Weinforschung

„Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-
Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung
des Abbaus von Propionsäure“

Dissertation
Zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften

Am Fachbereich Biologie
Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz

vorgelegt von
Kerstin Seyfarth
geb. am 26.06.1981 in Offenbach am Main

Mainz, November 2012
Die vorliegende Arbeit wurde von Februar 2008 bis Oktober 2012 am Institut für Mikrobiologie
und Weinforschung der Johannes Gutenberg-Universität Mainz unter der Leitung von Herrn
Univ.-Prof. Dr. Helmut König verfasst.

Tag der mündlichen Prüfung: 18.01.2013
Teile der vorliegenden Arbeit wurden in folgenden Posterpräsentationen, Publikationen und
Vorträgen veröffentlicht, eingereicht oder sind in Vorbereitung:

Robbin Stantscheff, Kerstin SEYFARTH, Stefan Dröge, Michael Klocke, Helmut König.
Culturable methanogenic microbiota from mesophilic corn-fed on-farm biogas plants and
labscale biogas fermenters. In Vorbereitung.
Pressemitteilung der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. am 29.03.2012.
Propionsäure im Griff behalten – neue Forschungsergebnisse zur Vermeidung von
Übersäuerungen in Biogasanlagen. URL:
http://www.nachwachsenderohstoffe.de/presseservice/pressemitteilungen/aktuelle-
mitteilungen/aktuelle-nachricht/archive/2012/march/article/propionsaeure-im-griff-behalten-neue-
forschungsergebnisse-zur-vermeidung-von-uebersaeuerungen-
in/?tx_ttnews[day]=29&cHash=197957e3cff3e7a54f561d0ff7a0a026

Kerstin SEYFARTH, Stefan Dröge, Helmut König. 2011. Abschlussbericht zum
Verbundprojekt „Früherkennung und Behebung von Fehlgärungen zur Erhöhung der
Prozesssicherheit und Schadensverhütung in Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung
der Propionsäurebildung“. URL:
http://www.nachwachsenderohstoffe.de/index.php?id=948&tabelle=fnr_projekte&alles=1&status
=Inhalt&zeitraum=formular&fkz=22004007&suchefkz=&sucheadresse=&von=01.04.1992&bis=2
9.03.2012&zeitraum=formular&untertitel=Bioenergie&was=&produktlinie=90&minz=240&maxz=
250&zurueck=Stichwort. 29.03.2012.
R. Stantscheff, K. SEYFARTH, S. Dröge, M. Klocke, H. König. 2011. Isolation and
characterisation of methanogenic Archea from on-farm biogas plants. Poster. GWP013. URL:
www.vaam.uni-halle.de/pdf/VAAM_Tagungsband_2011.pdf (30.06.2012), BIOspektrum
Tagungsband der VAAM-Jahrestagung 2011. Sonderausgabe 2011, ISSN 0947-0867, S. 157.
Jahrestagung der Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie 2011, VAAM 2011,
03.-06.04.2011, Karlsruhe.
Kerstin SEYFARTH, Robbin Stantscheff, Stefan Dröge, Helmut König. 2009.
Isolierung und Charakterisierung von Methanbakterien aus Biogasanlagen. Poster.
URL: http://www.lfl.bayern.de/biogasscience2009/postersession/ (30.06.2012)
Charakterisierung der methanogenen Archaebakterien in landwirtschaftlichen NaWaRo-
Biogasanlagen. Internationale Wissenschaftskonferenz Biogas Science 2009 science meets
practice, 02. - 04. Dezember, Erding.
Kerstin SEYFARTH, Robbin Stantscheff, Stefan Dröge, Helmut König. 2009. Isolierung und
Charakterisierung von Methanbakterien aus Biogasanlagen. Poster. Tag der Technologie
BioTech in Rheinland-Pfalz. 26.10.2009, ZDF- Konferenzzentrum, Mainz.
INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................................................. 1
1.1 Das Erneuerbare-Energien-Gesetz ............................................................................................... 1
1.2 Primärenergie- und Endernergieverbrauch in Deutschland bis 2011 ...................................... 5
1.3 Primärenergieverbrauch und Energie-Mix in Deutschland bis 2020 ...................................... 13
1.4 Potenziale der Biomassenutzung in Deutschland .................................................................... 17
1.4.1 Flächenverteilung in Deutschland .............................................................................................. 17
1.4.2 Debatte um die Flächennutzungskonkurrenz zwischen Nahrungs- und Energiepflanzen ....... 18
1.5 Energie aus Biomasse .................................................................................................................. 20
1.5.1 landwirtschaftliche Biogasanlagen ............................................................................................. 21
1.5.1.1 Verfahrenstechnik landwirtschaftlicher Biogasanlagen ......................................................... 24
1.5.1.2 Inputstoffe zur Biogasherstellung ........................................................................................... 24
1.5.1.3 Mikrobielle Zusammensetzung in landwirtschaftlichen Biogasanlagen ................................ 26
1.5.2 Die Bildung von Biogas aus organischem Material in landwirtschaftlichen Biogasanlagen ..... 29
1.5.2.1 Hydrolyse ................................................................................................................................ 30
1.5.2.2 Primäre Fermentation ............................................................................................................. 32
1.5.2.3 Sekundäre Fermentation ........................................................................................................ 32
1.5.2.4 Methanogenese. ..................................................................................................................... 33
1.5.2.5 Zusammensetzung des Biogases. ......................................................................................... 34
1.6 Propionsäure und seine Verwendung ........................................................................................ 36
1.7 Propionsäure in Biogasfermentern ............................................................................................ 37
1.7.1 Mikrobielle anaerobe Bildung von Propionsäure ....................................................................... 39
1.7.1.1 Methylmalonyl-CoA-Weg ....................................................................................................... 40
1.7.1.2 Acryloyl-CoA-Weg .................................................................................................................. 42
1.7.1.3 Succinat-Decarboxylierung .................................................................................................... 44
1.7.2 Mikrobieller anaerober Abbau von Propionsäure ...................................................................... 46
1.8 Die anaerobe Bildung von Acetat aus CO und H ................................................................... 52
2 2
1.8.1 Acetyl CoA Weg (Wood-Ljungdahl Weg) .................................................................................. 53
1.9 Ursprung und Kreislauf von Methan auf der Erde .................................................................... 57
1.9.1 Die natürliche Bildung von Methan ............................................................................................ 58
1.9.1.1 Methanogenese. ..................................................................................................................... 59
1.9.1.1.1 Hydrogenotrophe Methanogenese ........................................................................... 62
1.9.1.1.2 Acetoklastische Methanogenese .............................................................................. 64
1.9.1.1.3 Methylotrophe Methanogenese ................................................................................ 65
1.10 Ziele der vorgelegten Arbeit ........................................................................................................ 68
2 Material ............................................................................................................................................... 69
2.1 Geräte und Hilfsmittel ................................................................................................................... 69
INHALTSVERZEICHNIS II
2.2 Chemikalien ................................................................................................................................... 72
2.3 Biochemikalien, Enzyme und Kits .............................................................................................. 74
2.3.1 Biochemikalien ........................................................................................................................... 74
2.3.2 Enzyme ....................................................................................................................................... 75
2.3.3 Kits .............................................................................................................................................. 75
2.4 Synthetische Oligonukleotide ..................................................................................................... 75
2.5 Puffer und Lösungen .................................................................................................................... 77
2.5.1 Klassische DNA-Isolierung ......................................................................................................... 77
2.5.2 Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................................................... 78
2.5.3 Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese ....................................................................... 79
2.5.4 Temperatur Gradienten Elektrophorese .................................................................................... 79
2.5.5 DAPI-Färbung............................................................................................................................. 80
2.5.6 HPLC-Puffer ............................................................................................................................... 80
2.5.7 DC-Puffer .................................................................................................................................... 80
2.6 Nährmedien .................................................................................................................................... 80
2.7 Organismen ................................................................................................................................... 87
3 Methoden ........................................................................................................................................... 92
3.1 Probenmaterial aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern ..................................... 92
3.2 Probennahme aus NawaRo-Biogasanlagen .............................................................................. 93
3.3 Anaerobe Kultivierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen ........................ 94
3.3.1 Isolierung von Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen .................... 96
3.3.2 Anreicherung, Kultivierung und Isolierung methanogener Archaea .......................................... 97
3.4 Physiologische Charakterisierung von Eigenisolaten aus NawaRo-Biogasanlagen und
Laborfermentern............................................................................................................................ 99
3.4.1 Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie der Eigenisolate ............................................ 100
3.4.1.1 Titerbestimmung mithilfe der DAPI-Färbung ....................................................................... 100
3.4.1.2 Bestimmung des Titers methanogener Archaea ................................................................. 100
3.4.2 Bestimmung des Titers propionsäureabbauender Mikroorganismen mithilfe des MPN-
Verfahrens ................................................................................................................................ 101
3.4.3 Wachstumsuntersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten 101
3.5 Molekularbiologische Identifizierung von Mikroorganismen aus NawaRo-
Biogasanlagen ............................................................................................................................. 102
3.5.1 Isolierung chromosomaler Gesamt-DNA aus Fermentern und Kulturen ................................ 104
3.5.2 Optimierte Amplifizierung bakterieller 16S rDNA aus chromosomaler DNA für Proben aus
NawaRo-Biogasanlagen und daraus stammenden Kulturen .................................................. 105
3.5.3 Amplifizierung der 16S rDNA aus archaealer chromosomaler DNA ....................................... 107
INHALTSVERZEICHNIS III
3.5.4 Amplifizierung verschiedener Teilsequenzen der chromosomalen DNA methanogener
Archaea .................................................................................................................................... 108
3.5.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................................... 109
3.5.6 Auftrennung von 16S rDNA-Fragmenten mit der Denaturierende Gradienten Gel
Elektrophorese und der Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese .................................... 110
3.5.7 Klonierung unterschiedlicher 16S rDNA Fragmente ............................................................... 111
3.5.8 Restriktionslängenpolymorphismus-Analyse von 16S rDNA Fragmenten zur
Unterscheidung verschiedener Genera und Arten von Mikroorganismen .............................. 112
3.5.9 Reamplifizierung und Sequenzierung reiner 16S rDNA-Fragmente ....................................... 113
3.5.10 Phylogenetische Analysen partieller 16S rDNA aus eigenisolierten Reinkulturen und Klonen113
3.6 Chemische Analysen von Substraten und Produkten in Kulturen aus NawaRo-
Biogasanlagen ............................................................................................................................. 114
3.6.1 HPLC-Analysen des mikrobiellen anaeroben Propionsäureabbaus ....................................... 114
3.6.2 Gaschromatographie der mikrobiellen Methanbildung ............................................................ 117
3.7 Chemische Analyse des Reaktorfiltrats ................................................................................... 118
3.7.1 Dünnschichtchromatographie des Reaktorfiltrats .................................................................... 118
3.7.2 HPLC-Analysen des Reaktorfiltrats ......................................................................................... 119
4 Ergebnisse ....................................................................................................................................... 121
4.1 Isolierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen, Laborfermentern und
propionsäureabbauenden Mischkulturen ................................................................................ 121
4.1.1 Isolierung von Bakterien aus propionsäureabbauenden Mischkulturen ................................. 121
4.1.2 Isolierung methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern. ....... 121
4.2 Morphologie von Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern und
anaerob propionsäureabbauender Mischkulturen ................................................................. 122
4.2.1 DAPI-Färbung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen ......................................... 123
4.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen methanogener Archaea ...................... 124
4.2.2.1 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkulturen der Art Methanobacterium
formicicum ............................................................................................................................ 125
4.2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanoculleus bourgensis 126
4.2.2.3 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanosarcina mazei ....... 127
4.2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur HWS2.1 der Art Methanosarcina
barkeri ................................................................................................................................... 128
4.2.2.5 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur LFP3.1 der Art
Methanomethylovorans sp. .................................................................................................. 129
4.3 Titerbestimmung von Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen ............................................... 130
4.3.1 Titerbestimmung propionsäureabbauender Mikroorganismen in Mischkulturen .................... 130
4.3.2 Titerbestimmung eigenisolierter methanogener Archaea ....................................................... 130
INHALTSVERZEICHNIS IV
4.4 Physiologische Untersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen
Substraten .................................................................................................................................... 131
4.5 Systematik von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen .......................................... 132
4.5.1 Analysen bakterieller 16S rDNA aus NawaRo-Biogasanlagen ............................................... 133
4.5.1.1 Identifizierungsergebnisse bakterieller 16S rDNA aus dem Fermenter der NawaRo-
Biogasanlage BEG mit Etablierungsergebnissen der PCR-Methode ................................. 133
4.5.1.2 Identifizierung von Bakterien mit chromosomaler Gesamt-DNA aus den Fermentern
weiterer NawaRo-Biogasanlagen und einem Nachgärer .................................................... 137
4.5.2 Identifizierung kultivierbarer Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Misch- und
Unterkulturen ............................................................................................................................ 140
4.5.2.1 Identifizierung von Bakterien aus den Mischkulturen Fp1, Fp1a sowie Unterkulturen
Fp1a1264, Fp1a520 und Fp1a63-L ..................................................................................... 141
4.5.2.2 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Wp1....................................................... 149
4.5.2.3 Identifizierung von Bakterien aus der Unterkultur Wp2a1264 ............................................. 151
4.5.2.4 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Gp1a und Unterkultur Gp1b1264 ......... 154
4.5.2.5 Identifizierung von Bakterien aus den Unterkulturen Ap1a1264 und Ap1a520 .................. 160
4.5.3 Zusammenfassung der identifizierten und isolierten Bakterien aus syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkulturen ................................................................................ 164
4.6 Identifizierung eigenisolierter methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen ....... 165
4.6.1 Stammspezifische Identifizierung methanogener Archaea der Art Methanobacterium
formicicum mit der SAPD-PCR ................................................................................................ 167
4.6.2 Artspezifische Identifizierung der Eigenisolate methanogener Archaea mit der DGGE. ........ 168
4.6.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea ...................... 171
4.6.3.1 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanobacterium ..... 172
4.6.3.2 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanoculleus .......... 174
4.6.3.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanosarcina .......... 176
4.6.3.4 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung Methanosaeta....... 179
4.6.3.5 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung
Methanomethylovorans ........................................................................................................ 180
4.6.4 Zusammenfassung der identifizierten eigenisolierten methanogenen Archaea aus NawaRo-
Biogasanlagen .......................................................................................................................... 181
4.6.5 Phylogenetische Stammbäume bakterieller und archaealer 16S rDNA anaerober
Mikroorganismen ...................................................................................................................... 189
4.6.5.1 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA von Bakterien aus syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkulturen ............................................................................ 189
4.6.5.1.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 stammenden Bakterien ....................... 190
INHALTSVERZEICHNIS V
4.6.5.1.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp2 stammenden Bakterien ..................... 191
4.6.5.1.3 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkultur Gp1 stammenden Bakterien ...................... 192
4.6.5.1.4 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph
propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 stammenden Bakterien ...................... 193
4.6.5.2 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA methanogener Archaea ................... 193
4.6.5.2.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA nach einer DGGE aus der
Gesamt-DNA von Eigenisolaten methanogener Archaea ....................................... 194
4.6.5.2.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA aus der Gesamt-DNA von
Eigenisolaten methanogener Archaea ................................................................... 195
4.7 Substrate und Produkte anaerober Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen ........ 196
4.7.1 Propionsäureoxidation anaerober Anreicherungskulturen ...................................................... 196
4.7.1.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Fp1 ........................................ 197
4.7.1.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Gp1 ....................................... 198
4.7.1.3 Syntrophe Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit der Reinkultur
TAF1 ..................................................................................................................................... 199
4.7.1.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap1 ....................................... 200
4.7.1.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap3 ....................................... 200
4.7.2 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ........................................................................................................... 201
4.7.2.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Fp1 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 202
4.7.2.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp1 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 203
4.7.2.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp2 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 204
4.7.2.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 205
4.7.2.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap1 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 206
4.7.2.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap3 mit Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 207
4.7.3 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen nach Zugabe von Fumarsäure und
Bromoethansulfonsäure ........................................................................................................... 208
4.7.3.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Fp1a und Fp1b ............................... 209
4.7.3.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp1a und Wp1b............................. 210
INHALTSVERZEICHNIS VI
4.7.3.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp2a und Wp2b............................. 211
4.7.3.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Gp1a und Gp1b .............................. 212
4.7.3.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap1a und Ap1b ............................... 212
4.7.3.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap3a und Ap3b ............................... 213
4.7.4 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen anaerober Mikroorganismen und
methanogener Archaea ............................................................................................................ 214
4.7.4.1 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit
Clostridium sartargoformeT DSM1292 ................................................................................. 215
4.7.4.2 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit Wolinella succinogenesT DSM1740217
4.7.4.3 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit
Aminobacterium colombienseT DSM12261 ......................................................................... 219
4.7.4.4 Substrate und Produkte methanogener Eigenisolate und
Geovibrio thiophilusT DSM11263 (Negativkontrollen) ......................................................... 220
4.7.5 Methanbildung durch methanogene Archaea ......................................................................... 222
4.7.5.1 Methanbildung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen ..................................... 223
4.7.5.2 Methanbildung definierter Mischkulturen anaerober Bakterien mit methanogenen
Archaea ................................................................................................................................ 224
4.7.5.3 Methanbildung eigenisolierter Reinkulturen und Typstämmen methanogener Archaea .... 226
4.7.5.3.1 Methanbildung des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 ........... 226
4.7.5.3.2 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 .... 228
4.7.5.3.3 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 ....... 230
4.7.5.3.4 Methanbildung des Eigenisolats Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 ........ 231
4.7.5.3.5 Methanbildung des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 ....................... 233
4.7.5.3.6 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina mazei Stamm BEG3 .................. 234
4.7.5.3.7 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 ............. 235
4.7.5.3.8 Methanbildung des Eigenisolats Methanosaeta concilii Stamm BEG4 ................... 236
4.8 Zusammensetzung des Reaktorfiltrats .................................................................................... 237
4.8.1 Pflanzenpartikel im Reaktorfiltrat.............................................................................................. 237
4.8.2 Acetat im Reaktorfiltrat ............................................................................................................. 238
4.8.3 Aminosäuren im Reaktorfiltrat .................................................................................................. 238
4.8.4 Zuckeralkohol im Reaktorfiltrat ................................................................................................. 240
5 Diskussion ....................................................................................................................................... 241
5.1 Molekularbiologisch Identifizierte Bakterien und methanogene Archaea aus NawaRo-
Biogasanlagen und Laborfermentern ...................................................................................... 241
5.2 Mikroorganismen in syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen .......................... 243
5.2.1 Bakterien und eigenisolierte Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden
Mischkultur Fp1 ........................................................................................................................ 244