Microsferas de polisacáridos y lípidos para la administración pulmonar de macromoléculas ...

256 Pages·2006·3.98 MB·Spanish

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“Microsferas de polisacáridos y lípidos para la
administración pulmonar de macromoléculas
terapéuticas”

DDaayyaammíí CCaarrrriióónn RReecciioo
SSaannttiiaaggoo ddee CCoommppoosstteellaa,, 22000066

Resumen

El objetivo global del trabajo recogido en esta memoria experimental ha
sido el desarrollar, utilizando técnicas adecuadas, microsferas de polisacáridos
(quitosano) y lípidos (Dynasan®) con características morfológicas y aerodinámicas
adecuadas para su administración pulmonar. Además, utilizando la insulina y la
albúmina de suero bovino marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC-BSA),
se ha demostrado el potencial de estas microsferas como vehículos de péptidos y
proteínas terapéuticas. Para la preparación de las microsferas de quitosano, se
pusieron a punto técnicas de atomización y emulsificación (formación de una
doble emulsión)/evaporación del disolvente y se evaluaron dos procedimientos
distintos de asociación de la proteína terapéutica a las microsferas,
comprobándose que la eficacia de asociación es mayor cuando la proteína
terapéutica se disuelve en la solución polimérica. Para la elaboración de las
microsferas lipídicas, se recurrió a la utilización de procedimientos de
emulsificación (formación de una emulsión simple o doble)/evaporación del
disolvente. Se observó que se puede controlar el tamaño y morfología de las
microsferas modificando distintas variables de formulación y del proceso. Los
estudios in vivo llevados a cabo con las microsferas de quitosano (determinación
de los niveles séricos de glucemia y evaluación de la distribución pulmonar
mediante microscopía confocal, tras la administración intratraqueal a ratas de
microsferas conteniendo insulina y FITC-BSA, respectivamente) revelaron que las
microsferas de quitosano producidas por emulsificación inducían una respuesta
hipoglucémica más prolongada que la solución de insulina y que las partículas
obtenidas por atomización, lo que se relacionó con una captura más lenta de
dichas microsferas, debido a su mayor tamaño, por los macrófagos alveolares. En
definitiva, el trabajo en su conjunto permite pronosticar el interés especialmente
de las microsferas de quitosano, como vehículos para la administración pulmonar
de péptidos y proteínas.

Abstract

The aim of the work contained in this thesis was to develop microspheres,
using polysaccharides (chitosan) and lipids (Dynasan®) with morphological and
aerodynamic characteristics suitable for pulmonary delivery. Furthermore, the
potential of these microspheres as peptides and proteins carriers was
demonstrated using insulin and fluorescein isothiocyanate labeled bovine serum
albumin (FITC-BSA). In order to prepare the chitosan (CS) microspheres, spray-
drying technique and double emulsification/evaporation method were developed
and two different protein association procedures were assessed. Higher
association efficiency was found when the protein was dissolved in the polymeric
solution. Simple and double emulsification/evaporation methods were used to
prepare lipid microspheres. Size and morphology of the microspheres were found
to be controlled by modifying formulation and process variables. In vivo studies
performed with CS microspheres (determination of serum glycemic concentrations
and evaluation of lung distribution by confocal analysis following intratraqueal
administration of insulin and FITC-BSA loaded microspheres, respectively to rats)
revealed that the insulin loaded chitosan microspheres produced by
emulsification induced a more prolonged hypoglycaemic response than insulin
solution used as control and the spray-dried particles, which was attributed to
their slower capture owing to their larger particle size, by alveolar macrophages.
In conclusion, this work evidences the potential of chitosan microspheres as
peptides and proteins lung carriers.

Agradecimientos

Cuando hace ya más de 5 años contacté con el Centro de Orientación e
Información al Estudiante (COIE), agradecí infinitamente que hicieran llegar mi
carta de solicitud de admisión en el programa de doctorado, al Profesor Ramón
Martínez Pacheco, en ese momento Director del Departamento de Farmacia y
Tecnología Farmacéutica, quien tuvo la amabilidad de ponerse en contacto
conmigo. Afortunadamente, tuve la suerte de que la profesora Carmen Remuñán
López accediera a ser la Directora de mi tesis, a quién agradezco su orientación y
apoyo durante estos años, al igual que al profesor José Luis Vila Jato, co-Director
de la misma. Gracias a la Agencia Española de Cooperación Internacional (AECI)
y al Vicerrectorado de Relaciones Internacionales de la Universidad de Santiago
de Compostela (conjuntamente con el grupo de investigación), los cuales me
concedieron becas para realizar una estancia de investigación y estudios de
doctorado, respectivamente, pude contar con el soporte económico para estar aquí.
Por otra parte, la realización del trabajo experimental de esta tesis fue posible
gracias a la financiación aportada la Xunta de Galicia y el Gobierno de España
quienes adjudicaron los proyectos PGIDT00PXI20315PR y CICYT, SAF 2002-
03314, respectivamente.
Por supuesto, también quiero agradecer a los profesores del grupo de
investigación: María José Alonso Fernández, Begoña Seijo Rey, Dolores Torres
López y Alejandro Sánchez Barreiro por la ayuda brindada ante cualquier duda o
problema.
Sin dudas, la ayuda de Miro y Merche, del Servicio de Microscopía, ha sido
imprescindible para que los estudios realizados utilizando las técnicas de
microscopía electrónica y confocal llegaran a buen término.
Agradezco a la profesora Rosa María Señarís Rodríguez del Departamento
de Fisiología de la Facultad de Medicina y especialmente a Sulay y Ana, del
mismo departamento, cuyos consejos me sirvieron de mucho en el inicio de los
estudios con animales.
De igual forma, agradezco a la profesora Celina Rodicio Rodicio de la
Facultad de Biología quien me dio sus consejos y orientó en la preparación del
tejido para microscopía confocal.
Especial mención merece la Profesora Cristina Taboada Montero del
Departamento de Fisiología de la Facultad de Farmacia, no sólo por su ayuda
sino también por su envidiable buen ánimo y la energía positiva que desprende.
Quiero agradecer también a los integrantes del mismo departamento: Isabel
Míguez, Joaquín Espinosa y Rosendo Millán (Cacho), tanto por la ayuda
brindada como por hacerme sentir que era bien recibida entre ellos.

Por otro lado, tengo que decir que desde el mismo inicio de mi estancia en el
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, recibí los consejos y la
ayuda de muchos estudiantes, doctorandos y postdoctorandos, quienes me
trasmitieron su experiencia, gracias a lo cual me fue más fácil enfrentarme a este
campo que era un nuevo mundo para mí. No obstante, a pesar de la importancia
que tuvo su ayuda desde ese punto de vista, ellos significaron mucho más en el
terreno personal pues su compañía, cariño y comprensión hizo menos dura la pena
de estar tan lejos de mi tierra. Por tanto, a ellos va dirigido mi eterno
agradecimiento: mis compañeros de la facultad, aunque la mayoría ya ha
terminado: Mirta, Edison, Javiera, Ana Gómez, Lisardo, Magdalena, Rafa,
Margo, Angela, Ana Portero, Pedrito, Ana Grenha, Cecilia, María Alonso,
Desirée, María de la Fuente, Marcos, Noemí, Felipe y Jose Carlos; otros que
estuvieron por poco tiempo: Claudia, Tatiana y Liset y los más recientes: Vicky,
Nela, Marcilio y Livia.

No puedo dejar de decir que afortunadamente, gracias a haber compartido
con muchos de ellos, he conocido y compartido con familiares y amigos, los cuales
me abrieron las puertas de su casa. Mis más sinceras gracias lleguen a Cristina,
Elisa y familia; Cándido, Margo y familia, Moncho, las inseparables María, Loly
y Marga, Cristina, Rafa y familia; Ana Grenha y familia y Ana Gómez y familia.

Mi especial agradecimiento es para Tatiana, Alejandro y Pichi y Gema,
Tino, Gemita y Dani, quienes me acogieron en sus casas en incontables ocasiones
como una más de la familia, dándome todo su cariño.

Pero, sin lugar a dudas, la llegada de Chachi, mi gran amor y compañero,
hizo que en estos últimos años el recuerdo de mi querida familia y de mi lejana
Cuba se hiciera menos doloroso, llenándome de cariño y alegrías día a día y
sirviéndome de apoyo tanto en lo personal como en lo profesional. Por todo esto,
gracias.
Dedicatoria

Evidentemente esta tesis no es sólo el fruto de estos largos años en los que he
estado trabajando incansablemente para lograr este gran objetivo final. Resulta
imprescindible mencionar a aquellas personas que pusieron todo su empeño en que
llegara a ser alguien mejor, para que un día pudiera realizar mi sueño. Tengo que
dedicar en primer lugar mi tesis a mis PADRES Gloria y Anibal, porque gracias a
sus enseñanzas y exigencias aprendí a llevar dentro ese bichito que se llama
“aprender” y a no conformarme con lo poco.
No obstante, de todas las personas en este mundo, a mi MAMÁ es a quién más le
debo porque sin su tremendamente grande y especial ayuda no hubiera podido estar
aquí hoy. Su apoyo incondicional fue decisivo para que aún estando tan lejos de mi
querida familia, sintiera que era muy importante el sacrificio. Por eso esta tesis va
especialmente dedicada a ella.
Por supuesto también se la dedico a cada una de mis HERMANAS: Natascha,
Yamilé, Mei-ling y Myosotis, a las cuales les doy una gran alegría con la
culminación de mi tesis.
No puedo dejar de dedicarla a mis ABUELOS tanto a Gloria, como a aquellos que
ya no están entre nosotros: Monchín, Edunia y Recio, que desde allá arriba estoy
segura de que, al igual que hicieron en vida, cuidan muy bien de mí y se alegran
enormemente de mis logros.
Pienso especialmente en mis SOBRINOS Rachel y Pedrito, a los cuales tristemente
sólo he podido ver en contadas ocasiones en estos últimos años pero espero que un
día siendo mayores, comprendan el porqué de mi ausencia. También pienso en mis
sobrinos Yania y Ugo y en mi HERMANO Marcos. Espero que todos y
especialmente los más pequeños, sobretodo porque cuentan con mucho más tiempo,
aprendan algo positivo de todo esto.
Por último, pero no por eso menos importante, dedico esta tesis a CHACHI que a
pesar de la distancia y el tiempo estuvo siempre ahí, dándome muchas fuerzas, y
una vez a mi lado, me sacó de muchos apuros con sus grandes conocimientos e
inteligencia. Y como gracias a él tengo una segunda familia, la cual también ha
depositado todo su cariño y confianza en mí, a ellos: Ñoña, Guille, Albertico y
Elvira, también dedico esta tesis.