Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal

245 Pages·2011·3.92 MB·Spanish

Tesis de Posgrado
MMeeccaanniissmmoo ddee aacccciióónn mmoolleeccuullaarr ddee
llooss ccoorrttiiccooiiddeess eenn llaa mméédduullaa eessppiinnaall
Orti, Eduardo
1985
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
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Orti, Eduardo. (1985). Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
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Orti, Eduardo. "Mecanismo de acción molecular de los corticoides en la médula espinal". Tesis
de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1985.
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UNIVERSIDAD DE BUENOSAIRES
FACULTAD DECIENCIAS EXACTAS YNATURALES
MECANISMO DE ACCION MOLECULAR
DE LOS CORTICOIDES EN LA MEDULA ESPINAL
Autor: EDUARDOORTI
Director: Dr. ALEJANDRO F. DE NICOLA
INSTITUTO DE BIOLOGIA YMEDICINA EXPERIMENTAL
Obligado 2490, BuenosAires
Tesispresentada paraoptar al
Titqu deDoctorenCienciasQuimicas
Tesis “32
1935 332,
A Siïvia,
a mis padres.
Agradezco especialmente a:
Dr. Aiejandro De Nicoïa, mi Director de Tesis, por su
dedicación, estimuio y guia permanentes;
mis compañeros de 1aboratorio: Lic. Si1via Tornelio,
Dres. Héctor Coirini, Ciaudia Helier, Li1iana Neisen­
berg y Osvaido Fridman, cha. Ana Maria Magariños y Lic.
Danie] Moses, por su cáiido apoyo y colaboración;
Sra. Eisa di Matteo y Srta. Sandra Luchetta, por 1a efi­
ciente ayuda técnica;
mis docentes de Quimica Bioiógica: Dres. Eduardo Charreau,
Carios Lantos, Juan Carios Ca1vo, Marta Tessone, Omar Pe­
dro Pignataro y Lic. Lucrecia Piñeiro, por sus vaïiosas
enseñanzas;
Lic. Juan Pabio Radiceila, por su amistad, sus enrique­
cedoras discusiones y su contribución en ios programas
de computación;
ios Sres. Saú] Corbaïán, Daniel Nieva y Juan José Cieslak,
dei bioterio de] IBYME,por su cordia] y esmerada atención;
Lic. Marcelo de las Heras, por sus consejos para 1a de­
terminación de 1a ornitina descarboxilasa;
Sr. Aiejandro Esteras, de Pape1sa, por su voiuntariosa
colaboración en 1a impresión de 1a tesis;
Dr. Virgilio G. Fogiia, Director de] IBYME,y a todo e]
persona] cientifico, técnico, de mantenimiento, de bibiio­
teca y administrativo de] mismo, por su invaiorable asis­
tencia;
A mi padre, mi madre y a toda mi famiiia porque me apo­
yaron y estimuiaron siempre;
A Siivia, mi esposa, por haber sido mucho más que eso.
E.0.
iv
INDICE
I.
INTRODUCCION GENERAL Y OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..1
MECANISMOS MOLECULARES DE ACCION
DE LOS CORTICOIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2
- Estructura quimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2
- Efectos 'fiSiOIógicos: Acciónde TosGCen distintos
tejidos, Efectos fisioIógicos de Tos GCen e] estrés,
Efectos de Tos MC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..4
- Mecanisnuas de acción: Biosintesis, Transporte, Estructu­
ra de Ios receptores intraceIuIares, Factores estabiIizan­
tes de Tos receptores, Transformación de] complejo hormo­
na-receptor, Modeiode] cicIado intraceIuIar de receptores,
Regulación de Ia expresión genómica, Mecanismosde acción
no genómicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
ESTRUCTURA Y FUNCION DE LA MEDULA ESPINAL . . . . . . . . . ..23
- CéIIJTas deT SN: Neurona, Neuroina . . . . . . . . . . . . . . . . ..23
- Bioquinrica deI SN:MetaboTismoenergético, Transporte
axónico, Neurotransmisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2
- Anatcnnïa de 'la ME:Anatomiamacroscópica, Estructura in­
terna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..30
- Funcióri de 'Ia ME: Reflejos meduiares, Funciones de Ia ME
Iuego de extraer eI cerebro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..33
CORTICOIDES Y SISTEMA NERVIOSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..38
- Acción de Ios corticoides sobre eI tejido nervioso:
Efectos especificos sobre 1a quimica y función de] cerebro,
Efectos sobre actividades enzimáticas, Efectos sobre 1a
e1ectrofisioIogia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..3
- Receptores de corticoides en e] SN: PobIacünmsde
receptores, Incorporación de corticoides "in vivo", Onto­
genia de Tos receptores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..42
- Corticoides y ME. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..49
OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..51
PROPIEDADES, DISTRIBUCION Y ONTOGENIA DE LOS SITIOS
DE UNION CITOSOLICOS PARA GLUCOCORTICOIDES DE LA
MEDULA ESPINAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..54
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..55
v
MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57
- AnimaIes de experimentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57
- Disección de] SN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..57
- Determinación de Tos sitios de unión para GC.....58
- Estudios cinéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60
- Efecto de protectores y bioqueantes de grupos
sulfhidriios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60
- Estudios de saturación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60
- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..61
- Sedimentación en gradientes de gTiceroT . . . . . . . . ..62
- Distribución zona] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..63
- Ontogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..63
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65
- Estudios cinéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65
- Efecto de protectores y bToqueantes de grupos
squhidriios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..68
- Estudios de saturación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..68
- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..71
- Sedimentación en gradientes de giicero] . . . . . . . . ..74
- Distribución zona] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..74
- Ontogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..78
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..82
III.
ESTUDIO DE LA TRANSFORMACION DE LOS SITIOS DE UNION
PARA GLUCOCORTICOIDES DE LA MEDULA ESPINAL . . . . . . . . ..87
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..88
MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..91
AnimaTesde experimentación y disección de] SN...91
Marcación de Tos sitios de unión citosóiicos con
(3H)-DEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..91
Cromatografía en coTumna de DEAE-celulosa . . . . . . ..92
Determinación de fosfato inorgánico . . . . . . . . . . . . ..93
Ensayo de unión a ADN-ceiuiosa . . . . . . . . . . . . . . . . . ..94
Obtención de una fracción nuciear purificada.....94
Unión de compIejos citosóiicos a Ta fracción
nucIear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..95
Método rápido de cromatografias combinadas en
minicoTumnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..96
AnáIisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..98
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..99
Unión de complejos citosóIicos a 1a fracción
nucTear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..99
vi
- Cromatografía en coiumna de DEAE-ceiuiosa . . . . . . ..99
- Unión a ADN-ceIuiosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..101
- Anáiisis cromatográfico en minicoiumnas
combinadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..110
ESTUDIOS "IN VIVO" DE LOS NIVELES DE GLUCOCORTI­
COIDES EN LA MEDULA ESPINAL: CAPTACION NUCLEAR DE
CORTICDSTERONA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..113
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..114
MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..117
- Animaies de experimentación y disección de] SN..117
- Obtención de fraccionea subceiuiares . . . . . . . . . . ..117
- Captación nucIear de ( H)-CORT en ME e HC. . . . . ..117
- Determinación de CORTen tejidos y fracciones
nucIeares por RIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..118
- Determinación de CORTsérica por radiocompetición
proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..123
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..124
- Distribución de 1a CORTendógena . . . . . . . . . . . . . . ..124
- Incorporación nucIear de CORT. . . . . . . . . . . . . . . . . ..127
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..133
ESTUDIO DE LA UNION DE (3H)-ALDOSTERONA EN LA MEDULA
ESPINAL: PRESENCIA DE SITIOS DE ALTA AFINIDAD Y
SELECTIVIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..142
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..143
MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..148
- Animales de experimentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..148
- Determinaciónde sitios de unión citosó]icos....148
- Transformación de Ios sitios de aita afinidad por
(3H)-ALDO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..149
- AnáTisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..149
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..151
- Estudios cinéticos y de saturación . . . . . . . . . . . . ..151
vii
- Estudios de competencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..154
- Distribución regionaI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..160
-Transformación de Ios sitios de tipo I. . . . . . . . . ..160
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..164
VI. EFECTOS BIOLOGICOS DE LOS GLUCOCORTICOIDES EN LA
MEDULA ESPINAL: REGULACION DE GLICEROL-FOSFATO
DESHIDROGENASA Y ORNITINA DESCARBOXILASA . . . . . . . . . ..169
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..170
MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..173
- AnimaIes de experimentación y tratamiento con
esteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..173
- Determinación de Ia actividad de GPDH. . . . . . . . . ..173
- Determinación de Ia actividad de ODC. . . . . . . . . . ..176
- Determinación de 1a unión citosóIica de (3H)-DEX177
- AnáIisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..178
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..179
- Efectos crónicos sobre Ia actividad de GPDH.....179
- Efectos crónicos sobre Ia actividad de ODC. . . . ..182
- Cinética de] efecto de una única dosis de GC
sobre GPDH,ODCy Ia unión citosóIica de
(3H)-DEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..184
- Respuesta a diferentes dosis de GC. . . . . . . . . . . ..187
- Especificidad de] efecto sobre ODC. . . . . . . . . . . . ..189
- Distribución de Ics niveIes basaIes y estimuIados
de GPDH y ODC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..189
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..193
VII. CONSIDERACIONES FINALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..201
RESUMEN Y DISCUSION GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..202
PERSPECTIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..212
REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..215
Viii
ABREVIATURAS
adrenocorticotrofina
ACTH
ácido desoxirribonucieico
ADN
adrenalectomïa / adrenaiectomizado(s)
ADX
aidosterona
ALDO
adenosina-5'-monofosfato
AMP
anáiisis de 1a varianza
ANOVA
ácido ribonucieico
ARN
adenosina-5'-trifosfato
ATP
cervica]
corticosterona
CORT
factor iiberador de adrenocorticotrofina
CRF
dietiiaminoetano
DEAE
dexametasona
DEX
11-desoxicorticosterona
DOC
ditiotreito]
DTT
sa] disódica de] ácido eti]éndiaminotetraacético
EDTA
ácido y-aminobutirico
GABA
cc g]ucocorticoide(s)
giiceroifosfato deshidrogenasa
GPDH
hidroxiiapatita
HAP
hipocampo
HC
concentración inhibitoria a1 50 %
ID50
intra peritonea]
constante de disociación
Kd
Iumbar
minera]ocorticoide(s)
MC
méduïa espina]
ME
nícotinamida-adenina dinucïeótido reducido
NADH
ornitína descarboxiïasa
ODC
ornitína
ORN
afinidad reïativa de unión
RBA
radioinmunoaná1isis
RIA
3-(3'-oxo-7'a-prop11-17‘p-hídroxi-androstan-4'-en­
RU 26752
17'aí1)-propíonolactona
119,17p-díhidroxí-l70-(1'-propíoni])-androstan­
RU 26988
1,4,6-trien-3-ona
RU 28362 11p,17p-dihidroxí-6-metí1-17a-(1'-propioni1)-an­
drostan-l,4,6-trien-3-ona
sub-cutáneo
sistema nervioso
SN
sistema nervioso centra]
SNC
torácico
acetónído de triamcino1ona
TA