Marcin Samiec, Maria Skrzyszowska: Zastosowanie metod przyżyciowej analizy ...

109 Pages·2016·3.75 MB·Polish

ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI
Monografie i Rozprawy

MARCIN SAMIEC
MARIA SKRZYSZOWSKA

Zastosowanie metod przyżyciowej analizy
fluorycytochemicznej do wykrywania
symptomów śmierci apoptotycznej
w komórkach-dawcach jąder oraz
w zarodkach świni uzyskiwanych technikami
klonowania somatycznego

The use of the methods of intra vitam
fluorocytochemical analysis for detection of apoptotic
cell death in porcine nuclear donor cells and embryos
generated by somatic cell cloning techniques

INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY
KRAKÓW 2015
2 M. Samiec i M. Skrzyszowska

Recenzenci monografii:
dr hab. Daniel Lipiński, prof. nadzw. UP; Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,
Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Biochemii i Biotechnologii,
Zakład Diagnostyki Molekularnej
dr hab. Wiesława Młodawska; Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,
Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Instytut Nauk Weterynaryjnych,
Zakład Weterynarii, Rozrodu i Dobrostanu Zwierząt

Prezentowana praca uzyskała wsparcie finansowe z Narodowego Centrum Badań
i Rozwoju (umowa nr INNOMED/I/17/NCBR/2014) ze środków Programu
Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka w ramach Europejskiego Funduszu
Rozwoju Regionalnego.

Opracowanie redakcyjne
mgr Magdalena Bielska
mgr Bogusława Krawiec
Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 3

ROCZNIKI NAUKOWE
ZOOTECHNIKI

Monografie i Rozprawy

INSTYTUT ZOOTECHNIKI

PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY
2015 KRAKÓW Nr 53
4 M. Samiec i M. Skrzyszowska

REDAKCJA

Redaktor naczelny – dr hab. Dorota Kowalska, prof. IZ PIB
Sekretarz redakcji – mgr Magdalena Bielska
Projekt okładki – Beata Barszczewska-Wojda

Adres redakcji ― Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy,
ul. Sarego 2, 31-047 Kraków

© Copyright by Instytut Zootechniki PIB

Druk: Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Zespół Wydawnictw
i Poligrafii, 32-083 Balice k. Krakowa. Nakład 100 egz.

PL ISNN 0137-1655
ISBN 978-83-7607-226-5
Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 5

1. WSTĘP

1.1. Dwa „oblicza” śmierci komórek: aktywna śmierć fizjologiczna
(apoptoza) i pasywna śmierć patologiczna (nekroza)

1.1.1. Scenariusz śmierci apoptotycznej i nekrotycznej a różnice
w komórkowym obrazie morfologicznym i ultrastrukturalnym, podłożu bio-
chemicznym i biofizycznym oraz mechanizmach molekularnych i genetycznych

Uruchomienie molekularnego scenariusza apoptozy w komórkach ho-
dowanych in vitro zarodków klonalnych ssaków jest kluczowym elementem
mechanizmu regulującego przedimplantacyjną fazę embriogenezy oraz śmiertel-
ność zarodków w stadium blastocysty.
W komórkach, które wkroczyły na drogę apoptozy, dochodzi do akty-
wacji szeregu procesów indukujących charakterystyczne zmiany ultrastruktural-
ne, morfologiczne i biofizyczne wykrywane metodami z zakresu mikroskopii
fluorescencyjnej, cytobiochemii bądź cytometrii przepływowej. Jedną z pierw-
szych tego typu zmian jest osmotyczne kurczenie się komórek na skutek postę-
pującego odwodnienia (dehydratacji) cytozolu. Proces ten prowadzi do konden-
sacji cytoplazmy, a także zmiany wielkości i kształtu komórek wskutek zmniej-
szenia ich objętości oraz stopniowego uwypuklania się/pofałdowania po-
wierzchni plazmolemmy. Podczas apoptozy większość organelli (z wyjątkiem
jądra komórkowego) i błona plazmatyczna komórek zachowują strukturalną
integralność przez dłuższy okres. W obrębie jądra komórkowego zachodzi
kondensacja i brzeżne ułożenie chromatyny, tj. jej marginalizacja pod otoczką
jądrową. Transformacje te poprzedzają postępującą fragmentację jądra.
W późniejszym etapie śmierci apoptotycznej, w wyniku dalszego zagęszczenia
chromatyny i nukleoplazmy oraz całkowitej biodegradacji jądra komórkowego
i cytoplazmy, tworzą się tzw. ciałka apoptotyczne, czyli obłonione fragmenty
komórek zawierające morfologicznie niezmienione organelle komórkowe,
szczątkowe struktury jądra i resztkowe składniki cytoplazmy. W warunkach in
vivo, ciałka apoptotyczne są najczęściej wchłaniane przez sąsiadujące komórki
bądź są eliminowane przez makrofagi. Z kolei, w warunkach pozaustrojowych,
w przypadku zaawansowanych zmian późnoapoptotycznych w znacznej części
populacji komórkowej i braku komórek fagocytujących w mikrośrodowisku
hodowlanym, zmiany degradacyjne związane z utratą integralności błony ko-
mórkowej mogą być przejawem zachodzenia „wtórnej nekrozy”. Oprócz wi-
6 M. Samiec i M. Skrzyszowska
docznych zmian morfologicznych, w komórkach apoptotycznych zachodzi
szereg zmian biochemicznych: fragmentacja DNA z udziałem endonukleaz do
odcinków oligonukleosomalnych, wzrasta wewnątrzkomórkowe stężenie jonów
wapnia, następują procesy degradacji specyficznych białek jądrowych, obniżenie
wewnątrzkomórkowego pH i spadek potencjału błon mitochondrialnych, a także
pojawiają się zmiany biofizyczne, spowodowane translokacją cząsteczek fosfa-
tydyloseryny w błonie plazmatycznej (Denecker i in., 2001; McCarthy i Evan,
1998; Gross i in., 1999; Kroemer 1997).
W przeciwieństwie do apoptozy, w procesie nekrozy (martwicy) docho-
dzi do zwiększania się rozmiarów komórek, obrzęku organelli komórkowych,
głównie mitochondriów i siateczki śródplazmatycznej. Obserwuje się późną
degradację DNA i pyknotyczne jądra. Organelle komórkowe ulegają degenera-
cji, tworzą się wakuole, polisomy odłączają się od siateczki śródplazmatycznej.
W dalszym etapie procesu martwicy obserwuje się destrukcję chromatyny, zanik
jąder komórkowych, a ostatecznie całkowitą strukturalną dezintegrację komórek
(Denecker i in., 2001; Kitanaka i Kuchino, 1999).
Kryteria śmierci apoptotycznej i nekrotycznej (martwiczej), obejmujące
zmiany biochemiczne i molekularne, wskazują, iż oba rodzaje śmierci pozostają
we wzajemnej zależności. Jednym z czynników odgrywających istotną rolę
w procesie śmierci jest wewnątrzkomórkowy poziom ATP. W wyniku uszko-
dzenia DNA, aktywowana jest polimeraza poli(ADP-rybozy) [PARP], a poli-
ADP-rybozylacja białek jądrowych prowadzi do zmniejszenia wewnątrzkomór-
kowej puli NAD/NADH i obniżenia poziomu ATP w komórce (Kim i in., 1999;
Scovassi i Poirier, 1999). W utrzymaniu właściwego poziomu energetycznego
komórek ważną rolę odgrywają mitochondria. W czasie śmierci komórkowej
błonowy potencjał mitochondrialny, odpowiedzialny za syntezę ATP, ulega
obniżeniu. Pozbawienie komórek energii może być bezpośrednią przyczyną ich
śmierci, zatem poziom wewnątrzkomórkowych zasobów energetycznych decy-
duje o zachodzeniu apoptozy lub nekrozy. Podjęcie decyzji o destrukcji
i eliminacji komórek wymaga aktywacji wielu komórkowych procesów, m.in.
związanych z ekspresją genów, syntezą pro- i antyapoptotycznych białek, czy
aktywacją wielu procesów enzymatycznych. Apoptoza i nekroza mogą być
inicjowane przez te same receptory komórkowe. Apoptoza, w zależności od
rodzaju czynnika indukującego, może przebiegać z udziałem różnych ewolucyj-
nie konserwatywnych mechanizmów molekularnych, odpowiedzialnych za
przenoszenie sygnału zapoczątkowującego ten proces. Większość procesów
proteolitycznych podczas apoptozy przebiega w obecności rodziny cysteinoza-
leżnych proteaz katalizujących hydrolizę białek za resztą kwasu asparaginowego
zwanych kaspazami (ang. caspases; cysteine-dependent aspartate specific pro-
teases). Poza kaspazami, w kolejnych etapach procesu apoptozy uczestniczą
białka Bcl-2, które są produktami ekspresji protoonkogenów bcl-2, wykrytych
w białaczkach i chłoniakach wywodzących się z limfocytów B (ang. B-cell
leukemia/lymphoma) oraz białka p53, które są produktami ekspresji genów
z grupy supresorów transformacji nowotworowej (Fadeel i in., 1999a; Gross
Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 7
i in., 1999; Kroemer, 1997). Na decyzję o rodzaju zachodzącej śmierci komór-
kowej – apoptozie lub nekrozie – może wpływać poziom ekspresji białek Bcl-2,
aktywacja kaspaz czy proteaz serynowych.

1.2. Charakterystyka trzech etapów w scenariuszu śmierci apopto-
tycznej komórek

1.2.1. Etap pierwszy – faza inicjacji apoptozy

W przebiegu procesu genetycznie zaprogramowanej śmierci apopto-
tycznej komórek dochodzi do kaskady zdarzeń, które obejmują trzy fazy: 1.
inicjacji, czyli wzbudzenia, 2. wykonawczą (efektorową) oraz 3. destrukcyjną,
czyli zniszczenia (Kroemer, 1997). Najlepiej poznanym mechanizmem wzbu-
dzenia apoptozy pozostaje indukcja spowodowana wiązaniem ligandów przez
odpowiednie receptory śmierci. Uważa się, że aktywację kaspaz inicjujących
poprzedzają zmiany morfologiczne w obrębie komórek somatycznych (Blan-
kenberg i in., 2000). Dotyczą one m.in. formowania charakterystycznych pęche-
rzykopodobnych uwypukleń błony komórkowej (ang. blebbing). Niektórzy
badacze uważają, że zjawisko pęcherzykowatości błon występuje w niektórych
typach komórek równolegle z kondensacją chromatyny (Katsen i in., 1998).
W czasie aktywacji kaspaz, komórki realizujące program śmierci sygnalizują
o tym sąsiadującym komórkom przez eksponowanie fosfatydyloseryny (PS) na
swojej powierzchni (Verhoven i in., 1995). Ten glicerofosfolipid wraz z innymi
lipidami − fosfatydyloetanoloaminą, fosfatydylocholiną i sfingomieliną są
naturalnymi składnikami błony komórkowej. Skład lipidowy obu monowarstw
błony cytoplazmatycznej żywych komórek jest bardzo różny. Zjawisko to nosi
nazwę asymetrii składu lipidowego błony lub anizotropii w rozmieszczeniu
fosfoglicerydów w obrębie obu monomolekularnych warstw lipidowych plazmo-
lemmy. W błonie komórkowej obojętne glicerofosfolipidy zawierające w swojej
strukturze chemicznej cholinę, do których należą fosfatydylocholina (PC) oraz
sfingomielina (SM) znajdują się w zewnętrznej warstwie monomolekularnej,
podczas gdy prawie wszystkie cząsteczki anionowych fosfolipidów glicerolo-
wych zawierające terminalną grupę aminową, takie jak fosfatydyloetanoloamina
(PE) i fosfatydyloseryna (PS) znajdują się w monowarstwie wewnętrznej. Po-
nieważ kwasy tłuszczowe fosfatydylocholiny i sfingomieliny są w ogólności
bardziej nasycone niż kwasy tłuszczowe wchodzące w skład fosfatydyloetanolo-
aminy i fosfatydyloseryny, więc asymetrii rozmieszczania głów polarnych
fosfolipidów towarzyszy asymetria dystrybucji kwasów tłuszczowych, która
powoduje, że wewnętrzna monowarstwa lipidowa błony plazmatycznej jest
nieco bardziej płynna. Z uwagi na fakt, iż ujemnie naładowana fosfatydylosery-
na jest zlokalizowana po wewnętrznej stronie plazmolemmy, powoduje to wy-
stępowanie dodatkowej różnicy ładunku pomiędzy obiema monowarstwami
fosfolipidowymi. Utrzymująca się przez cały czas życia komórek asymetria
8 M. Samiec i M. Skrzyszowska
składu błony cytoplazmatycznej, pomimo występowania ruchliwości translacyj-
nej cząsteczek lipidów typu dyfuzji transwersalnej z jednej monowarstwy do
drugiej (ruchy flip-flop), świadczy o występowaniu w błonach wysoce specy-
ficznych układów enzymatycznych, które są odpowiedzialne za istnienie zjawi-
ska anizotropii rozmieszczenia fosfolipidów (Bratton i in., 1997, 1999). Ruchli-
wości transwersalnej amfipatycznych składników lipidowych między monomo-
lekularnymi warstwami błony plazmatycznej musi towarzyszyć zmiana konfor-
macji poszczególnych cząsteczek fosfoglicerydów, która dotyczy wzajemnej
orientacji przestrzennej ich części polarnych („głów”) i niepolarnych („ogo-
nów”). Uważa się, że duży transbłonowy gradient stężenia różnych składników
lipidowych powinien powodować dyfuzję transwersalną i eliminację asymetrii.
Udowodniono występowanie trzech klas transporterów fosfolipidów glicerolo-
wych: 1. flipaz, w tym translokazy aminofosfolipidowej, transportujących ak-
tywnie lipidy z monowarstwy zewnętrznej do wewnętrznej; 2. flopaz aktywnie
transportujących lipidy w kierunku odwrotnym, do których należą białka opor-
ności wielolekowej, oraz 3. transportujących biernie w obie strony błony cyto-
plazmatycznej skramblaz, do których należy m. in. skramblaza aktywowana
przez kationy wapnia (Frasch i in., 2004; Fadeel i in., 1999b). W komórkach
żywych rozmieszczenie aminofosfolipidów (PS i fosfatydyloetanoloaminy)
ogranicza się zatem do warstwy wewnętrznej błony. Asymetryczna lokalizacja
aminofosfolipidów jest utrzymywana dzięki aktywności ATP-zależnej translo-
kazy zwanej flipazą, która „wpompowuje” je do wewnętrznej warstwy błony,
a inne lipidy − do zewnętrznej. Aktywacja kaspaz doprowadza do zakłócenia
tego stanu, przyczyniając się do zablokowania funkcji translokazy i do aktywacji
enzymu skramblazy/flopazy, którego aktywność „wyrównuje” rozmieszczenie
lipidów wewnętrznej i zewnętrznej warstwy błony, powodując szybkie pojawie-
nie się PS na powierzchni błony komórek apoptotycznych (Blankenberg i in.,
2000; Martin i in., 1995a; Zwaal i Schroit, 1997).
Rola asymetrii plazmolemmy nie jest do końca jasna. Przeważa pogląd,
że różnorodność lipidów i ich anizotropia, tj. niejednakowy sposób ułożenia
w warstwie dimolekularnej błony plazmatycznej mają zasadniczy wpływ na
prawidłowe funkcjonowanie komórek. Wskazuje się tu na specyficzne oddzia-
ływanie niektórych enzymów z subklasą lipidów, szczególnie fosfatydyloseryną,
ulokowaną w konkretnym miejscu błony. Na przykład aktywność białkowej
kinazy C zależy w dużym stopniu od stężenia PS. Również białka wiążące
nukleotydy guaninowe (tj. białka G), a także amfitropowe i antykoagulacyjne
białka błonowe wiążące jony Ca2+ i fosfolipidy, czyli aneksyny, stanowiące całą
rodzinę enzymów pełniących wiele funkcji w komórce, są enzymami zależnymi
od PS. W przypadku autodestrukcyjnej śmierci fizjologicznej komórek następuje
zwiększona ekspozycja fosfatydyloseryny do monowarstwy zewnętrznej, co jest
sygnałem do wolnej od procesu zapalnego eliminacji komórki apoptotycznej
przez makrofagi (Ferraro-Peyret i in., 2002; Martin i in., 1995a, b). Uważa się,
że postępująca oksydacja translokazy aminofosfolipidowej, spowodowana przez
wewnątrzkomórkową akumulację reaktywnych form tlenu, jest odpowiedzialna
Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 9
za utratę asymetrii lipidów w plazmolemmie komórek będących w fazie inicjato-
rowej i wykonawczej apoptozy (Arroyo i in., 2002; Tyurina i in., 2004a, b).
Wyniki badań przeprowadzonych przez Deneckera i in. (2001) wskazują, że
przemieszczanie PS stanowi jedno z wcześniejszych wydarzeń w szlaku apopto-
tycznym, zachodzącym przed spadkiem potencjału transbłonowego mitochon-
driów oraz uwalnianiem cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej tych
struktur. Przemieszczenie PS na powierzchnię komórek można łatwo monitoro-
wać poprzez wiązanie tego fosfolipidu za pomocą aneksyny V związanej
z fluoresceiną (Martin i in., 1995a; Fadok i in., 1992a, b). Aktywacja kaspaz
inicjujących doprowadza do pierwszych proteolitycznych cięć niektórych skład-
ników cytoszkieletu (m.in. aktyna, fodryna) (Martin i in., 1995b; Vanags i in.,
1996).

1.2.2. Etap drugi – faza wykonawcza apoptozy i jej kontrolny punkt
nieodwracalności

Stymulacja aktywności kaspaz wykonawczych i przemieszczanie PS
w błonie komórek jest sygnałem rozpoczęcia fazy efektorowej, która wydaje się
być wspólnym etapem wiodącym do śmierci komórek wzbudzanych przez
poszczególne ścieżki apoptotyczne (Medema i in., 1997a; Huppertz i in., 1999).
W tej fazie dochodzi do ostatecznego włączenia programu śmierci, precyzyjnie
kontrolowanego przez produkty genów, które mogą aktywować czy blokować
bądź opóźniać apoptozę przez hamowanie kaspaz wykonawczych. Centralnym
punktem skupiającym różne sygnały apoptotyczne, charakterystyczne dla fazy
inicjatorowej są zatem proteazy cysteinowe z podrodziny kaspaz wykonawczych
(Bedner i in., 2000). Aktywacja kaspaz wykonawczych przez kaspazy inicjujące,
czy inne białka (np. proteaza serynowa GrB) stanowi etap, „punkt kontrol-
ny/restrykcyjny”, od którego nie ma już odwrotu w apoptozie (ang. point of no
return) i podlega precyzyjnej regulacji przez białka rodziny Bcl-2 (ang. B-cell
leukemia/lymphoma-2) oraz IAP (ang. inhibitory apoptosis proteins) (Renvoize
i in., 1997). Czas ich aktywacji wynosi od kilku minut do kilku godzin i zależy
od typu oraz stanu funkcjonalnego komórek. Zaktywowane kaspazy wykonaw-
cze (np. kaspaza-3) bezpośrednio albo w kaskadzie kaspaz dokonują proteolizy
wielu białek krytycznych dla życia komórek, wśród których znajdują się m.in.
białka cytoszkieletu, otoczki jądrowej, białka odpowiedzialne za organizację
przestrzenną DNA i jego naprawę, enzymy zaangażowane w relaksację α-
heliksu DNA oraz w anafazowy rozdział chromosomów podczas mitozy. Obok
najlepiej poznanych proteaz – kaspaz, zaangażowanych w realizację programu
fazy efektorowej samobójczej śmierci komórek, wymienia się inne proteazy,
zarówno cysteinowe (izoformy kalpain, katepsyny B i L), asparaginianowe
(katepsyna D), jak i serynowe (granzym B, proteaza AP24) (Fadeel i in., 2000;
Squier i in., 1994; Wright i in., 1997; Yamashima, 2000). Kalpainy, które pod
względem biochemicznym stanowią zależne od jonów wapnia, obojętne endo-
peptydazy wewnątrzkomórkowe, zawierające w swoim centrum katalitycznym
10 M. Samiec i M. Skrzyszowska
cysteinę i histydynę, występują w dwóch izoformach, tj. m i μ, oznakowanych
również odpowiednio jako II i I. Wspomniane izoformy różnią odmienne wy-
magania w stosunku do ich aktywatora – jonów Ca2+ – milimolowe, w przypad-
ku m-kalpainy, i mikromolowe – dla μ-kalpainy, które opisuje się również,
odpowiednio, jako m- i μ-CANPs/CLs (ang. calcium-activated neutral prote-
ases/calpains) (Tagliarino i in., 2003). Kalpainy występują w cytozolu oraz
różnych organellach komórkowych i aktywowane są m.in. przez fosfolipidy oraz
białka jądrowe – histony. Znanym inhibitorem komórkowym kalpain jest kalpa-
statyna (Sanges i in., 2006). Kalpainy rozszczepiają wiązania peptydowe we-
wnątrz łańcucha białkowego i nie wykazują specyficzności substratowej wobec
aminokwasów. Ponadto, cząsteczki kalpain dokonują proteolitycznego cięcia
wielu białek w komórkach ulegających apoptozie zwykle w innych miejscach
łańcucha aniżeli kaspazy. W wyniku działania kalpain powstają duże fragmenty
polipeptydowe, które ulegają dalszej proteolizie katalizowanej przez inne enzy-
my komórkowe np. kaspazy (Friedrich i in., 2001; Wang, 2000; Squier i Cohen,
1997).
Stwierdzono, że wzrost aktywności kalpain wyprzedza zmiany morfolo-
giczne typowe dla komórek apoptotycznych oraz fragmentację DNA. Wyniki
badań przeprowadzonych przez Squiera i in. (1994) oraz Squiera i Cohena
(1997) udokumentowały, że w wielu typach komórek włączających program
śmierci samobójczej wywołany różnymi czynnikami dochodzi do rozchwiania
homeostazy jonów Ca2+ (izokalcemii), co prowadzi do aktywacji izoform kalpa-
iny. Substratami kalpain w komórkach apoptotycznych są białka cytoszkieleto-
we, m.in białka wiążące aktynę (fodryna/spektryna, talina, filamina, α-aktynina),
białka związane z mikrotubulami (MAP-2), oraz białka wiążące się z kalmoduli-
ną, kinazy białkowe takie jak np. kinaza białkowa C (PKC), zależna od jonów
Ca2+ i kalmoduliny kinaza białkowa typu II i IV (CaM-PK-II/IV), kinaza łańcu-
cha lekkiego miozyny, a także enzym PARP, proapoptotyczne białko Bax
z rodziny Bcl-2, fosfolipaza C, czynniki transkrypcyjne (c-Fos, c-Jun), białka
receptorowe (np. receptory epidermalnego czynnika wzrostu), błonowe transpor-
tery jonowe (Ca2+-ATPaza), kanały wapniowe, cytokiny (interleukina 1α) i kilka
enzymów istotnych w sygnalizacji komórkowej (Mandic i in., 2002; McGinnis
i in., 1998). Na podkreślenie zasługuje obserwacja, że katalityczne rozszczepie-
nie wielu białek następuje w innych miejscach niż w przypadku kaspazy-3.
Pojawiły się przypuszczenia, że być może aktywność proteolityczna kalpainy
i kaspazy-3 jest uporządkowana hierarchicznie. Zaobserwowano, że kalpaina
aktywuje (poprzez rozszczepienie proteolityczne) kaspazę-3, -7 i -9 (Fadeel i in.,
2000; Neumar i in., 2003). Odnotowano także aktywację kalpainy przez kaspa-
zę-3 (Wood i Newcomb, 1999; Sharma i Rohrer, 2004). Niewykluczone rów-
nież, że kaspaza-3 (ale również -1 i -7) może być odpowiedzialna za proteolizę
kalpastatyny, powodując tym samym aktywację kalpainy (Graves i in., 2001;
Kato i in., 2000a; Pörn-Ares i in., 1998; Wang i in., 1998). Ponadto, w czasie
apoptozy translokacja kalpain do jąder komórkowych prowadzi do interakcji
z białkiem p53, aktywującym proapoptotyczny gen kodujący białko Bax