manuscrit Amin SWED

155 Pages·2015·26.22 MB·French

Amin Swed
Mémoire présenté en vue de l’obtention du
grade de Docteur de l’Université d’Angers
sous le label de L’Université Nantes Angers Le Mans

École doctorale : Biologie-Santé

Discipline : Sciences pharmaceutiques
Spécialité : Pharmacologie clinique et expérimentale
Unité de recherche : INSERM U1066

Soutenue le 10 juillet 2015
Thèse N°: 1464
Encapsulation de protéines dans des systèmes
polymériques particulaires par des procédés sans
solvant toxique pour l’ingénierie tissulaire du cartilage
JURY

Rapporteurs : Professeur Christine Jérôme, Université de Liège
Docteur Hamid Elaissari, Université de Lyon 1

Examinateurs : Docteur Catherine Le Visage, Université de Nantes

Directeur de Thèse : Professeur Frank Boury, Université d’Angers
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Jean-Pierre Benoit, directeur de l’unité de
recherche INSERM MINT-U1066, pour m’avoir donné l’opportunité d’effectuer ma thèse au
sein de son laboratoire.
Je remercie profondément le Professeur Frank Boury, mon directeur de thèse, pour m’avoir
accueilli au sein de son équipe. Je le remercie aussi pour ses conseils, sa patience, ses
encouragements et pour la confiance qu’il m’a accordée au cours de ma thèse.
J’adresse toute ma reconnaissance aux membres du jury, Madame Christine Jérôme,
Professeur à l’université de Liège et Monsieur Hamid Elaissari, Directeur de recherches
CNRS au sein de l’unité UMR 5007 à Lyon de me faire l’honneur de participer à ce jury et
pour avoir accepté de consacré du temps à l’évaluation de ce travail de thèse en qualité de
rapporteur.
Mes remerciements s’adressent également à Madame Catherine Le visage, Docteur à l’unité
INSERM-U791 au sein de l’équipe LIOAD à Nantes, de me faire l’honneur de participer à ce
jury en tant qu’examinateur.
Je remercie vivement le ministère syrien de l’éducation et l’université d’AL-Baath pour le
financement qui m’a été accordé.
Je voudrais remercier Dr. Thomas Cordonnier de m’avoir aidé concernant les expériences in
vitro, la rédaction et la correction des articles.
Je tiens à remercier également Dr. Brice Calvignac de m’avoir transmis ses expériences et
pour son soutien et sa gentillesse.
Je souhaite remercier infiniment mon amie et ma collègue au laboratoire Leila N. Hassani
pour sa bonne humeur, sa sympathie, ses conseils, son soutien et ses encouragements.

i
Je remercie du fond du cœur mon ami Tarek Al kalanee pour son aide et son soutien tout au
long de ma thèse.
Un grand merci aussi à mon collègue My-Kien Tran de m’avoir transmis ses expériences et
pour ses conseils et sa gentillesse.
Je remercie chaleureusement mes collègues au bureau, Giovanna Lollo, Gaël le Roux,
Delphine Séhédic et Fabien Violet pour tous les bons moments et les souvenirs qu’on a passé
ensemble.
J’adresse mes sincères remerciements à l’équipe du MINT, pour son accueil et les bons
moments qu’on a partagé ensemble.
Finalement, je remercie de tout mon cœur mes parents et mes sœurs pour leur soutien infini et
leur amour inconditionnel. Grâce à eux, j’ai pu vivre plusieurs années en France pleines
d’émotions et de bonheur.

ii
TABLE DES MATIERES

ii i
REMERCIEMENTS .......................................................................................................................... i
TABLE DES MATIERES ...................................................................................................... iii
TABLE DES FIGURES ......................................................................................................... vii
TABLE DES TABLEAUX ..................................................................................................... ix
ABREVIATIONS .................................................................................................................... xi
I. INTRODUCTION GENERALE ......................................................................................... 1
II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................... 4
II-1. Encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ........................ 5
II-2. Méthodes d’encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires .... 6
II-2.1. Emulsification-extraction du solvant ............................................................................................ 6
II-2.1.1. Emulsion simple ........................................................................................................................... 6
II-2.1.2. Emulsion double (multiple) .......................................................................................................... 7
II-2.1.2.1. Emulsion eau/huile/eau (E/H/E) ........................................................................................... 7
II-2.1.2.2. Emulsion solide/huile/eau (S/H/E) ....................................................................................... 8
II-2.2. Séparation de phase (coacervation) .............................................................................................. 9
II-2.3. Nébulisation-séchage et nébulisation-séchage à froid. ................................................................. 9
II-2.4. Atomisation ultrasonique ........................................................................................................... 10
II-2.5. Nébulisation électrique ............................................................................................................... 11
II-2.6. Système microfluidique .............................................................................................................. 11
II-2.7. Méthodes basées sur la fermeture des pores de particules et sur de gels thermosensibles ......... 12
II-2.8. Méthodes basées sur la technologie des fluides supercritiques .................................................. 13
II-2.8.1. Les procédés solvants : Procédé RESS ...................................................................................... 14
II-2.8.2. Les procédés anti-solvants ......................................................................................................... 14
II-2.8.2.1. Procédé GAS ...................................................................................................................... 15
II-2.8.2.2. Procédé SAS ....................................................................................................................... 15
II-2.8.2.3. Procédé PCA ....................................................................................................................... 16
II-2.8.2.4. Procédé ASES ..................................................................................................................... 16
II-2.8.2.5. Procédé SFEE ..................................................................................................................... 16
II-2.8.3. Les Procédé où le CO est utilisé comme soluté : Procédé PGSS .............................................. 17
2
II-3. Solvants organiques utilisés pour préparer des systèmes polymériques particulaires......18
II-3.1. Solvants organiques toxiques ..................................................................................................... 18
II-3.2. Solvants organiques non toxiques .............................................................................................. 19
II-3.2.1. Glycofurol .................................................................................................................................. 20
II-3.2.2. Dimethyl isosorbide (isosorbide dimethyl ether) ....................................................................... 20
II-4. Instabilité des protéines dans des systèmes polymériques particulaires ............................ 21
iv
II-4.1. Instabilité des protéines durant la formulation ........................................................................... 22
II-4.2. Instabilité des protéines durant le stockage ................................................................................ 23
II-4.3. Instabilité des protéines durant la libération ............................................................................... 23
II-5. Stratégies d’amélioration de la stabilité des protéines dans des systèmes polymériques . 25
II-5.1. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant la formulation ................................................ 25
II-5.1.1. Pegylation des protéines ............................................................................................................. 25
II-5.1.2. Complexation des protéines avec des polyélyctrolytes (ion-pairing) ......................................... 25
II-5.1.3. Encapsulation de la protéine à l’état solide ................................................................................ 26
II-5.1.4. Ajout d’additifs pendant la formulation ..................................................................................... 26
II-5.1.4.1. Les sucres ........................................................................................................................... 26
II-5.1.4.2. Les tensioactifs ................................................................................................................... 27
II-5.1.4.3. Les protéines ....................................................................................................................... 27
II-5.1.4.4. Les polymères ..................................................................................................................... 28
II-5.1.4.5. Les acides aminés et les alcools .......................................................................................... 28
II-5.2. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant le stockage ..................................................... 28
II-5.3. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant la libération .................................................... 29
II-5.3.1. Pegylation des protéines ............................................................................................................. 29
II-5.3.2. Complexation des protéines avec des polyélectrolytes (ion-pairing) ......................................... 30
II-5.3.3. Neutralisation de l’acidité locale dans les particules de PLGA .................................................. 30
II-5.3.4. Formation de microenvironnement visqueux ............................................................................. 31
II-5.3.5. Types de polymères et leurs propriétés physico-chimiques ....................................................... 31
II-5.3.6. Additifs ...................................................................................................................................... 33
II-6. Application des systèmes particulaires polymériques chargés en facteurs de croissance
pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. ........................................................................................ 33
II-6.1. Principe de l’ingénierie tissulaire ............................................................................................... 33
II-6.2. Les axes principaux de l’ingénierie tissulaire............................................................................. 34
II-6.2.1. Les cellules ................................................................................................................................. 34
II-6.2.2. Les biomatériaux ........................................................................................................................ 35
II-6.2.3. Les facteurs de croissance .......................................................................................................... 35
II-6.3. Ingénierie tissulaire du cartilage ................................................................................................. 36
III. TRAVAIL EXPERIMENTAL ....................................................................................... 48
CHAPITRE I : Encapsulation de protéines dans des nanoparticules de PLGA par la méthode
de séparation de phase .................................................................................................................... 49
PUBLICATION 1 : Protein encapsulation into PLGA nanoparticles by a novel phase separation method
using non-toxic solvents........................................................................................................................... 50
CHAPITRE II : Encapsulation de protéines dans des microparticules de PLGA par la
méthode d’émulsification/extraction du solvant en milieu CO .................................................. 59
2
v
PUBLICATION 2 : Preparation of polymeric particles in CO medium using non-toxic solvents:
2
Discussions on the mechanism of particle formation ............................................................................... 61
PUBLICATION 3 : Sustained release of TGF-β1 from biodegradable microparticles prepared by a new
green process in CO medium .................................................................................................................. 77
2
CHAPITRE III : Développement d’un biomatériau hybride en vue de la régénération
tissulaire du cartilage ...................................................................................................................... 96
PUBLICATION 4 : Development of injectable hybrid biomaterial for cartilage tissue engineering ...... 97
IV. DISCUSSION GENERALE .......................................................................................... 114
IV-1. Préformulation de la protéine sous forme de nanoprécipités ................................................. 115
IV-2. Procédé de formulation par la séparation de phase (coacervation) ........................................ 116
IV-3. Procédé de formulation par l’émulsification/extraction de solvant en milieu CO pressurisé
2
"modified-PGSS". ........................................................................................................................... 118
IV-4. Caractérisation des systèmes polymériques particulaires ...................................................... 120
IV-5. Libération de protéines à partir de systèmes polymériques particulaires .............................. 120
IV-6. Cytocompatibilité des systèmes polymériques particulaires ................................................. 121
IV-7. Comparaison des propriétés des systèmes particulaires préparées par les deux procédés
d’encapsulation ................................................................................................................................ 121
IV-8. Développement d’un biomatériau hybride en vue de l’ingénierie tissulaire du cartilage. ..... 122
V. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ................................................... 126
ANNEXES ............................................................................................................................. 129
Annexe 1 ......................................................................................................................................... 130
Annexe 2 ......................................................................................................................................... 131

v i
TABLE DES FIGURES

v ii
Figure 1. Procédé d’encapsulation par évaporation du solvant d’une émulsion simple .......................... 7
Figure 2. Procédé d’encapsulation par évaporation du solvant d’une émulsion double ......................... 8
Figure 3. Procédé d’encapsulation par nébulisation-séchage. ............................................................... 10
Figure 4. Procédé d’encapsulation par atomisation ultrasonique. ......................................................... 10
Figure 5. Procédé d’encapsulation par microfluidique. ......................................................................... 12
Figure 6. Diagramme de phase d’un corps pur. ..................................................................................... 13
Figure 7. Schéma du procédé RESS ...................................................................................................... 14
Figure 8. Schéma du procédé GAS. ...................................................................................................... 15
Figure 9. Schéma du procédé SAS/PCA/ASES. ................................................................................... 16
Figure 10. Schéma du procédé PGSS. ................................................................................................... 17
Figure 11. Dénaturation physique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ........... 21
Figure 12. Dégradation chimique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ........... 22
Figure 13. Profil de libération de protéine à partir de microparticules de PLGA (50:50) et mécanismes
de libération incomplète ................................................................................................................ 24
Figure 14. Hydrolyse de PLGA ............................................................................................................. 31
Figure 15. Principe de l’ingénierie tissulaire. ........................................................................................ 34
Figure 16. Etape de gélification du Si-HPMC ....................................................................................... 38
Figure 17. Interactions entre les composants lors de la séparation de phase. ...................................... 117
Figure 18. Les phases existantes lors de la séparation de phase (coacervation). ................................. 118

vi ii
TABLE DES TABLEAUX

ix