keratinolitik enzimlerin deri sanayinde kullanım imkanlarının geliştirilmesi üzerine araştırmalar

200 Pages·2010·3.95 MB·Turkish

EGE ÜNİVERSİTESİ FENBİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
(DOKTORA TEZİ)
KERATİNOLİTİK ENZİMLERİN DERİ
SANAYİNDE KULLANIM İMKANLARININ
GELİŞTİRİLMESİ ÜZERİNE ARAŞTIRMALAR

Arife Candaş ADIGÜZEL ZENGİN
Tez Danışmanı: Doç. Dr. Behzat Oral BİTLİSLİ
Deri Mühendisliği Anabilim Dalı
Bilim Dalı Kodu: 501.11.00
Sunuş Tarihi: 04.06.2010

Bornova /İZMİR
2010
ii
iii

Arife Candaş Adıgüzel Zengin tarafından doktora tezi olarak sunulan
“Keratinolitik Enzimlerin Deri Sanayinde Kullanım İmkanlarının Geliştirilmesi
Üzerine Araştırmalar” başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim
Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi’nin
ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer
bulunmuş ve 04.06.2010 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday
oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur.
Jüri Üyeleri: İmza
Jüri Başkanı : ........................................... .................................
Raportör Üye : ........................................... .................................
Üye :........................................... .................................
Üye :........................................... .................................
Üye : ........................................... .................................
iv
v

ÖZET
KERATİNOLİTİK ENZİMLERİN DERİ SANAYİNDE
KULLANIM İMKANLARININ GELİŞTİRİLMESİ ÜZERİNE
ARAŞTIRMALAR
ADIGÜZEL ZENGİN, Arife Candaş
Doktora Tezi, Deri Mühendisliği Bölümü
Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Behzat Oral BİTLİSLİ
Haziran 2010, 200 sayfa
Doktora tez çalışmasının ilk aşamasında, enzim üretimini gerçekleştirmek
amacıyla koyun yününden proteolitik aktivite gösteren bakteri, fungus ve
aktinomiset organizmaları izole edildi. İzole edilen mikroorganizmalarda genel
proteaz aktivitesi tayinleri yanında kollagenaz, elastaz ve keratinaz enzimi aktivite
tayinleri gerçekleştirildi. Bu tayin sonuçlarına göre en yüksek keratinaz
aktivitesini bakteri izolatlarının gösterdiği tespit edildi. Bakteri izolatları;
keratinaz, kollagenaz ve elastaz aktivite testlerine göre değerlendirilerek en iyi iki
izolat seçildi. Ardından, bu iki izolata ilişkin üretim ortamı denemeleri yapıldı.
Üretim ortamı denemeleri sonucunda, karbon ve azot kaynağı olarak yün ve
peptonun, karbon kaynağı olarak maltoz ve glikozun kullanılmasına karar verildi.
Bu denemeler sonucunda her iki izolatın, karbon ve azot kaynağı olarak sadece
yün veya sadece peptonda büyüyebildiği, karbon kaynağı olarak ise glikoz, maltoz
ve diğer basit şekerleri kullanabildiği tespit edildi. Ayrıca, karbon ve azot kaynağı
olarak yün veya peptonun kullanılmasının aktivite sonuçlarını etkilemediği, her
iki azot kaynağında da benzer kollagenolitik, elastinolitik ve keratinolitik
aktivitelerin görüldüğü belirlendi. Bu üç proteolitik aktivitenin azot kısıtlaması
nedeniyle indüklendiği ve aktivitelerin büyüme ortamındaki protein içerikli
substratların varlığına bağlı olmadığı saptandı. Karbon kaynağı olarak maltoz
kullanıldığında proteolitik aktivitelerin baskılanmadığı, glikoz kullanıldığında ise
aktivitelerin baskılandığı belirlendi. Elde edilen bulgulara göre fermentör
üretiminde kullanılmak üzere maltoz ve pepton substratları seçildi ve fermentör
denemelerine geçildi.
Fermentör ortamındaki enzim üretim çalışmaları sonucunda,
kollagenolitik, elastinolitik ve keratinolitik aktivitelerin büyüme ortamına ardaşık
vi

olarak salgılandığı belirlendi. Fermentör üretimlerinin erken safhalarında azotun
yeterli miktarda bulunmasına bağlı olarak proteaz aktivitesinin görülmediği fakat
hali hazırda bulunan peptitler tüketildiğinde ve spesifik büyüme hızı düşmeye
başladığında kollagenaz ve elastaz aktivitelerinin üretildiği tespit edildi. Bu 2
aktivitenin daha sonra yerini keratinaz üretimine bıraktığı saptandı. Dolayısıyla,
bu iki izolatın giderek daha da zor bulunan protein substratlarını hedef alan ardışık
proteaz salınımları gerçekleştirdiği belirlendi.
Araştırma kapsamında izole edilen ve incelenen iki mikroorganizmanın tür
tanımlama çalışmaları Almanya’daki DSMZ’de (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) yapıldı. Tür tanımlama çalışmaları
sonucunda her iki mikroorganizmanın Bacillus cereus türünden geldikleri
saptandı ve Bacillus cereus IZ-06b ve IZ-06r olarak adlandırıldı.
Ardından, B. cereus IZ-06b ve IZ-06r’den ham proteaz çözeltileri üretildi
ve koyun derilerinin kıl gidermesindeki etkileri incelendi. Bu amaçla ham proteaz
çözeltilerinin kıl giderme etkileri bilgisayar bağlantılı bir kuvvet sensörü
kullanılarak ticari enzim preparatları ile karşılaştırmalı olarak incelendi ve koyun
derisindeki kılları önemli ölçüde gevşettiği belirlendi.

Anahtar sözcükler: Bacillus cereus, kollagenaz, elastaz, keratinaz, kıl
giderme, kuvvet sensörü
vii

ABSTRACT
INVESTIGATIONS ON THE USAGE IMPROVEMENT
POSSIBILITIES OF KERATINOLYTIC ENZYMES IN LEATHER
INDUSTRY
ADIGÜZEL ZENGİN, Arife Candaş
PhD in Leather Eng.
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Behzat Oral BİTLİSLİ
June 2010, 200 pages
Firstly for production of the enzymes, bacteria, fungi and actinomycetes
showing proteolytic activity were isolated from sheep wool. Beside the general
protease activity tests, collagenolytic, elastinolytic and keratinolytic activity tests
were also carried out on the isolated microorganisms. According to these findings,
the highest keratinolytic activity was determined from bacteria isolates. For
further experiments, the bacteria isolates were also evaluated by collagenolytic,
elastinolytic and keratinolytic tests and the best two isolates were selected.
Growth medium trials were also performed on the two isolates and it was
concluded that both strains were able to grow on wool and peptone as sole carbon
and nitrogen sources and utilize simple sugars like glucose and maltose. In
addition, it was observed that the use of wool or peptone as carbon and nitrogen
source did not affect the activity results and approximately the same
collagenolytic, elsatinolytic and keratinolytic activities were obtained with wool
or peptone as carbon and nitrogen sources. It was understood that all the three
proteolytic activities were induced by nitrogen limitation but were not dependent
on the presence of proteinaceous substrates in the growth medium. It was also
observed that the usage of maltose as carbon source did not suppress the
proteolytic activities; however, when glucose was used, the activities were found
to be suppressed. According to these results, maltose and peptone substrates were
chosen for the fermentation step.
The results obtained from fermentor during enzyme production showed a
viii

sequential enzyme secretion of collagenolytic, elastinolytic and keratinolytic
activities into the growth medium. In the early stages of fermentation which was
rich in nitrogen source did not show any protease activity, whereas collagenolytic,
elastinolytic activities were found to be produced when the present peptides were
depleted and the specific growth rate started to decrease. Only after these
activities keratinolytic production was started. Consequently, it was identified that
a sequential protease secretion was occurred by these 2 isolates according to the
scarcity of proteinaceous substrates in the medium.
The strain identification studies of the 2 isolated microorganisms were
performed in DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH) in Germany. The results showed that both two
microorganisms were Bacillus cereus and were named as Bacillus cereus IZ-06b
and IZ-06r.
Lastly, the crude protease solutions were obtained from these 2 bacteria
and their affect on unhairing of sheep skins were investigated. For this purpose, a
computerized force sensor was used for the evaluation of unhairing affect of
protease solutions in comparison to the commercial enzyme solutions. The
produced protease solutions were found to be effective at loosening the hair of
sheep skins.

Keywords: Bacillus cereus, collagenase, elastase, keratinase, dehairing,
force sensor
ix

TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim süresince benden değerli görüşlerini, katkı, yardım ve
desteğini esirgemeyen başta doktora danışmanım Sayın Doç. Dr. Behzat Oral
BİTLİSLİ olmak üzere, çalışmalarımda bana sağladığı imkanlar, desteği ve
güveni için Sayın Prof. Dr. Özcan SARI ve Bölüm Başkanımız Sayın Prof. Dr.
Altan AFŞAR’a,
Mikroorganizmaların izolasyonunda ve organizma seçimlerinde bana
yardımcı olan ve her zaman başarıya inanarak beni yüreklendiren Sayın Doç. Dr.
İhsan YAŞA ve Yrd. Doç. Dr. Bilge Hilal ÇADIRCI ile tüm güler yüzlü
Mikrobiyoloji Bölümü’ne,
Doktora eğitimim için fermentör üretimlerini gerçekleştirmek amacıyla
bulunduğum Aalborg Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümündeki desteğinden,
inancından ve sağladığı maddi ve manevi tüm katkılarından dolayı başta çok
değerli hocam Doç. Dr. Niels Thomas ERİKSEN’e, ve değerli tekniker Margaret
PAULSEN’e, can yoldaşı ve iş arkadaşı olarak hayatımı anlamlandıran çok
değerli ve özel dostlarım Sayın Dr. Barbara MARKTL ve Dr. Trakarn
PRAPASPONGSA’ya
Yardımı, anlayışı, sonsuz sabrı, sevgisi ve en önemlisi inancından dolayı
her zaman yanımda olan çok sevgili eşim Dr. Gökhan ZENGİN ve Zengin
ailesine,
Anlayış, destek, sevgi ve yardımlarını hayatımın her döneminde olduğu
gibi çalışmalarım süresince de benden esirgemeyen fedakar anneme, babama,
kardeşim ve manevi kardeşime,
İstatistiksel analizlerde değerli yardım ve katkılarından dolayı Yrd. Doç.
Dr. Hüseyin Ata KARAVANA ve ayrıca Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi
Deri Mühendisliği Bölümü öğretim üyelerine, asistan arkadaşlarıma ve bölüm
personeline,
Son olarak doktora tezimi hazırlamamda bana maddi destek sağlayan Ege
Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı’na teşekkür etmeyi bir borç bilirim.
x