Isolation and Identification of an Arabidopsis thaliana Mutant with Serration Leaf Margin

2011·6.3 MB·

by  Li Wan-Sha

植 物 分 类 与 资 源 学 报 ,34 ( ):
摇 2012 1 28~32
Plant Diversity and Resources :
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI 10.3724/SP.J.1143.2012.11103
拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定
*
李婉莎, 王春涛, 胡向阳**
中国科学院昆明植物研究所 云南昆明
( , 摇 650201)
摘要: 叶的极性建立直接决定叶的平展性发育 极性改变导致叶形态异常 影响植物体的各种正常生理活
, ,
动 利用反向遗传学方法 从拟南芥基因激活标签突变体库中分离到一个叶片边缘锯齿状表型的突变体
。 ,
命名为 该突变体同时表现出叶表皮腺毛形态发育异常 通过 方法成功定位突变基
( pCB1294), 。 Tail鄄PCR
因为At5g41663 该基因编码miR319b基因 显示 突变体植株中miR319b基因的
, 。 Real time PCR , pCB1294
表达量是野生型 植株的 倍多 所得结果为进一步研究 调控叶极性的分子机制和进一步
(col) 11 。 miRNA
分析miR319b与叶形态发生的关系奠定了基础
。
关键词: 拟南芥 突变体 叶锯齿
; ; ; Tail鄄PCR; miRNA
中图分类号: 文献标识码: 文章编号:
Q75摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2095-0845(2012)01-028-05
Isolation and Identification of an Arabidopsis thaliana
Mutant with Serration Leaf Margin
**
LI Wan鄄Sha, WANG Chun鄄Tao, HU Xiang鄄Yang
KunmingInstituteofBotany ChineseAcademyofSciences
( , ,Kunming650201,China)
Abstract
:Leafpolaritydeterminesleafflatnessdevelopmentdirectly,andabnormalpolarityusuallyresultsinmany
abnormal leaves,which subsequently affects many physiological functions of plants. So the normal leaf development
is important to plants. Here, an abnormal serration leaf margin mutant with abnormal leaf trichome development,
Arabidopsis
named pCB1294, was isolated from an activation tagging mutant pool through reverse genetics. By Tail鄄
At5g41663 miR319b
PCR, the mutantgeneloci encoding wassuccessfullyidentified. RealtimePCRshowstherela鄄
miR319b
tive expression level of gene in the pCB1294 mutant is eleven times of higher than that of the wild (col).
Our studylaythefoundationforfurtherstudyingthegeneticmechanismofleafpolarityandinvestigatingtheinterac鄄
miR319b
tion between and leaf morphology.
Key words Arabidopsis thaliana
: ; Mutant; Leaf margin serration; Tail鄄PCR; miRNA
叶是植物体的基本营养器官之一 在植物 叶极性的建立是叶发育的核心环节
摇 , 1999)。 。
的生命活动中起着重要作用 研究植物叶的发 的新细胞决定理论认为 叶
, Tsukaya (2005) ,
生 发育的分子机理 是发育生物学的一个重要 边缘锯齿 叶卷曲是某些直接或间接影响细胞分裂
、 , 、
课题 叶片发育的阶段大致可分为 叶原基的起 或生长分化的基因突变造成的 从叶形成的分子机
。 : 。
始和叶极性的建立 和 叶 制上看 细胞及周边细胞的发育形成叶原基
(Smith Hake, 1992)。 , SAM ,
原基是在茎的顶端分生组织 叶原基产生极性分化并从细胞分裂状态转入细胞生
(Shoot apical meri鄄
中形成的 长阶段 平展 正常的叶片逐渐形成 控制这一发
stem, SAM) (Scanlon, 2000; Hudson, , 、 。
基金项目 中国科学院百人计划项目与国家自然科学基金项目
* : (30871704,30971452,31170256)
通讯作者
** : Authorforcorrespondence; E鄄mail:[email protected]
收稿日期 接受发表
: 2011-07-05, 2011-10-15
作者简介 李婉莎 女 硕士 主要从事植物分子生物学和功能基因组学研究
: (1979-) , , 。
期 李婉莎等 拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定
1 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇29
育进程的一系列基因的突变及影响细胞分裂 生长 1摇 材料与方法
、
分化的因素都有可能使叶发育异常 产生卷曲 锯 1 1摇 材料
, 、 .
齿状等异型叶片 拟南芥叶边缘锯齿状突变体 是从实验室前
(Huang, 2003; Tsukaya, 2005)。 pCB1294
近年来研究表明 在植物叶极性的分 期构建的拟南芥基因激活标签突变体库中筛选得到的
, miRNA ,
化方面具有重要的调节作用 等 该突变体库遗传背景为colombia生态型
(col)。
。 Palatnik (2003)
1 2摇 突变体表型观察
通过对jaw鄄D 基因进行突变研究 发现 miR319a .
, 突变体和野生型种子同时播种于土壤中 温室
能通过靶向作用于TCP 转录因子基因家族来调控 ,
正常生长 观察表型 拍照 取突变体叶片
植物叶形态建成 miR319a 基因在芽顶端组织 (25益) , 、 。 、
。 、 茎杆 果荚固定于 固定液中 扫描电镜观察表型
花器官和果实中表达 miR319a 基因过表达突变 、 FAA , 。
, 1 3摇 突变体基因定位
体产生叶片卷曲 花发育异常 叶片偏上生长 .
、 、 、 运用 方法分离突变体 侧翼序列
Tail鄄PCR T鄄DNA (Liu
果实畸形等异常表型 西红柿中 LA 基因编码一
等 程序
。 , ,1995)。 : Tail鄄1: 94益 2 min; 95益 1 min; 94益
个包含miR319 位点的 TCP 转录因子 miR319 通 个循环
, 30s, 62益 1 min, 72益 2.5 min, 5 ; 94益 30 s,
过介导LA 基因调控叶边缘细胞发育 LA 表达水 个循
。 25益 3min(50% ramp), 72益 3min(32% ramp),2
平升高 导致叶边缘发育异常化 降低LA表达水 环
, ; ;94益 10s, 68益 1min, 72益 2.5min,94益 10s, 68益
平 则使叶边缘细胞持续生长 等
, (Ori ,2007)。 1min, 72益 2.5min,94益 10s, 44益 1min, 72益 2.5min
金鱼草 cin cincinnata 突变体由于细胞在 将第一轮产物稀释 倍取
15cycles; 72益 7min。 Tail鄄2 ( 50
( )
作为第二轮反应的模板
叶边缘的分裂延长 导致突变体叶片皱褶 CIN 1滋L ): 94益 3 min; 94益 10 s,
, ,
编码一个 TCP 转录因子 金鱼草 cin 和拟南芥 64益 1min, 72益 2.5min,5cycles; 94益 10s,64益 1min,
,
jaw鄄D突变体具有相似的叶片边缘卷曲表型 在 72益 2.5min,94益 10s,64益 1min, 72益 2.5min, 94益
。
这两个突变体中 TCP 基因的表达调控受到 10s, 44益 1min, 72益 2.5min,15cycles; 94益 10s, 44益
, 将第二
的介导 影响细胞分裂的时空特性 进 1min,72益 2.5min,5cycles; 72益 7min。 Tail鄄3 (
miRNA , , 轮产物稀释 倍取 做第三轮模板
12.5 1 滋L ): 94益 10 s,
而在叶的发育中起到调控作用 等
所用引
(Nath , 2003; 44益 1min, 72益 2.5min,30cycles; 72益 7min。
等 物为特异引物 简并引物 见表
Palatnik , 2007)。 、 , 1。
叶的近轴面决定基因家族 成 1 4摇 T鄄DNA插入位点鉴定
ClassIII HD鄄ZIP .
员是 miR165/166 的靶基因 HYL1 是 形 分别提取 基因组 采用三引物法
。 miRNA col、 pCB1294 DNA,
成过程中一个重要的基因 HYL1 基因通过介导 鉴定 在 突变体 插入位点两侧的基因组
, , pCB1294 T鄄DNA
来调节 基因的表达 在 序列上设计两个引物 与 左边界引物
(LP、 RP), T鄄DNA
miRNA ClassIII HD鄄ZIP ;
扩增
叶上卷突变体中 miR165 水平降低 近轴面决 (LB3) (http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)。
, , 以 野生型植株基因组 作为对照 分别以
定基因REV 被上调 同时叶的远轴区域也受到 col DNA , pCB1294鄄
,
影响 导致远轴面决定基因FIL被下调 叶背腹 LP\LB3、 pCB1294鄄RP \LB3、 pCB1294鄄LP \pCB1294鄄RP
, , 三组引物进行 扩增 鉴定引物见表
极性丧失 产生叶片翻卷现象 等 PCR 。 1。
, (Yu , 2005)。 1 5摇 RNA的提取及Real鄄time PCR
.
突变体分析是研究叶形态发生机制的最好方
取生长约 的 突变体及 野生型幼苗
10d pCB1294 col ,
法之一 拟南芥和其它一些植物突变体己被广泛
采用异硫氰酸胍法提取总 分析
, RNA,Real鄄time PCR pCB鄄
应用于植物发育及代谢途径的研究中 本研究利 突变体植株中 miR319b 基因表达量 以看家基因
。 1294 ,
用基因激活标签法构建突变体库 并从中筛选了 ACTIN2作为内参 等 引物见表
, (Varkonyi鄄Gasic ,2007)。 1。
一个叶发育异常突变体进行研究 突变体表型
。
为 叶片边缘锯齿状 叶片卷曲 叶表皮细胞窄 2摇 结果与分析
: 、 、
小 果荚皱缩 叶片表皮腺毛结构异常等 通 2 1摇 叶边缘锯齿状突变体 pCB1294 的筛选与表
、 、 。 .
过 方法成功定位该突变体突变基因为 型分析
Tail鄄PCR
At5g41663 本研究为下一步探究该突变基因与 突变体是利用基因激活标签法构建
。 pCB1294
叶形态发育的关系 进一步阐明叶发育的分子调 的突变体库中 获得的一个叶片发育异常的突变
, ,
控网络奠定了基础 体 从表型分析可知 图 突变体从幼苗期
。 。 ( 1),
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇30摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 34
开始 第一片真叶表现为叶片锯齿状 莲座叶形 齿 边缘皱缩 突变体花发育和野生型无太大区
, 。 , 。
成时期 突变体叶片基部和顶部都表现为较多锯 别 扫描电镜观察结果表明 图 突变体叶
, 。 ( 2):
片表皮细胞窄小 果荚表面皱缩 果荚表皮细胞
表1摇 引物及其序列 、 、
异型 叶片表皮腺毛表现为两叉结构 而野生型
Table1摇 Primerandtheirsequences 、 ,
引物 序列 叶片表皮腺毛为三叉结构 突变体叶表皮腺毛形
Primer Sequence ,
特异引物 态发育异常
Specialprimer 。
pCB260LB1 GATTATTGCTCGGGTAGATCGTCTTG
pCB260LB2 CATATGTGGGTTAGCATTCTTTCTG
pCB260LB3 GGTACCAAAACCACCCCAGT
pCB260RB1 ACCTTTTCGAGTATCAATGGAAACTTAACCG
pCB260RB2 CAACGGAGAGTGGCTTGAGATCGGCA
pCB260RB3 CAATGGCCCTTATGGTTTCTGCATCTAG
鉴定引物
Diagnosisprimer
pCB1294鄄LP CCGAACAACTAAACTTTCATTC
pCB1294鄄RP ACGTACACAGAGCAATATACC
LB3 GGTACCAAAACCACCCCAGT
兼并引物
Degenerateprimer
AD1 NGTCGASWGANAWGAA
AD2 TGWGNAGSANCASAGA
AD3 AGWGNAGWANCAWAGG
AD4 STTGNTASTNCTNTGC
AD5 NTCGASTWTSGWGTT
AD6 WGTGNAGWANCANAGA
引物
Real鄄timePCR Real鄄timePCRprimer
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
miR319b鄄RT
TCGCACTGGATACGACAGGGAG
miR319b鄄F CGGCGGCTTGGACTGAAGGGA
Universalprimer鄄R GTGCAGGGTCCGAGGT
ACTIN2鄄F TATCGCTGACCGTATGAG
ACTIN2鄄R CTGAGGGAAGCAAGAATG
图 突变体扫描电镜观察结果
2摇 pCB1294
叶表皮 果荚 叶表皮毛
A.B: ; C.D.E.F: ; G.H.I.J:
Fig.2摇 Thescanningelectronmicroscopyobservation
ofpCB1294 mutant
A.B:leafepidermidis;C.D.E.F:pod;G.H.I.J:leaftrichome
2 2摇 Tail鄄PCR定位突变基因
.
运用 方法 我们成功分离到
Tail鄄PCR , pCB1294
突变体 侧翼序列 通过序列比对发现
T鄄DNA , T鄄
图 突变体叶表型 插入在 基因的启动子区域 该
1摇 pCB1294 DNA At5g41663 ,
基因编码miR319b 为正向插入 图 所
Fig.1摇 pCB1294 mutantphenotypeofleaf , T鄄DNA ( 3
期 李婉莎等 拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定
1 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇31
示 中的 个串联的 启动子增强
), T鄄DNA 4 35S
miR319b基因的表达
。
图 拟南芥At5g41663基因结构及 突变体
3摇 pCB1294
插入位点 三角形表示 插入位点
T鄄DNA ( T-DNA )
At5g41663
Fig.3摇 Thestructureof geneandthelocation 图 与 植株miR319b基因表达量的 检测
5摇 pCB1294 col Real鄄timePCR
oftheT鄄DNAinsert(markedwithtriangles)
miR319b
Fig.5摇 Real鄄timePCRanalysesof expression
2 3摇 T鄄DNA插入位点鉴定 levelfrompCB1294 mutantandcolplant
.
野生型植株用 和 3摇 讨论
col pCB1294鄄LP pCB1294鄄
引物可扩增出 左右的特异条带 而另 突变体是利用基因激活标签系统突
RP 750bp , pCB1294
外两组引物不能扩增出条带 突变体用 变体库筛选得到的一株叶型锯齿状的突变体 该
; pCB1294 。
左边界引物 与 引物 激活标签突变体库较之先前的 插入突变体
(pCB1294鄄LP) T鄄DNA (LB3) T鄄DNA
能够扩增出 左右的条带 另外两组引物 库 转座子插入突变体库等具有明显的优势 它运
500 bp , 、 。
扩增无条带 图 结果表明 通过 方 用一个含有 超强启动子的 质粒进行
( 4)。 , tail鄄PCR 4伊35S pCB260
法扩增的 突变株 插入位点正确 转化 构建得到的突变体为显性突变 代即可
pCB1294 T鄄DNA , , , T1
且该突变株是纯合体 观察表型 质粒上带有一个Basta抗性标记
。 。 pCB260
基因 抗除草剂基因 和一个 绿色荧光蛋白
( ) GFP ( )
报告基因 通过 Basta 抗性标记基因可以方便地
,
筛选转基因后代植株 报告基因的利用则可
, GFP
进一步鉴定转基因的可靠性 使得转基因植株的
,
筛选鉴定工作简单 直观 关艳龙等
、 ( , 2009)。
突变体中 插入在 At5g41663
pCB1294 T鄄DNA
基因的启动子区域 该基因编码 miR319b
, 。 Real鄄
结果显示 突变体中 miR319b
time PCR , pCB1294
基因显著增强表达 说明 中 个 启动
, T鄄DNA 4 35S
子极大增强了miR319b基因的表达 该突变体为
,
增强型表达的突变体 突变体在形态上表现为整
。
图 突变体 插入位点鉴定 个叶发育时期叶片边缘锯齿状 边缘皱缩 叶表
4摇 pCB1294 T鄄DNA , ,
引物 引物 皮毛表现为两个分叉 结构异常 另外果荚表面
I. pCB1294鄄LP\LB3 ; II. pCB1294鄄RP\LB3 ; 、 ,
引物 皱缩 扭曲 突变体这些异常的表型性状有可能
III. pCB1294鄄LP\pCB1294鄄RP
、 ,
Fig.4摇 IdentificationofT鄄DNAinsertionsitesinpCB1294 mutant 是miR319b基因增强表达的结果 miR319b 基因
,
I. pCB1294鄄LP\LB3 primer;II. pCB1294鄄RP\LB3 primer; 与植物的叶形态发育密切相关
。
III. pCB1294鄄LP\pCB1294鄄RPprimer
研究表明 在植物叶极性建立 叶发
, miRNA 、
2 4摇 Real鄄time PCR实验分析突变基因 育方面起重要作用 例如 从拟南芥的激活标签
. 。 ,
结果表明 图 miR319b 突变体库中分离到的两个突变体 meristem en鄄
Real鄄time PCR ( 5):
基因在 突变体中的表达量比野生型植 larged1 men1 和 jabba鄄1D jab鄄1D 突变体表
pCB1294 ( ) ( ),
株高 倍多 说明 突变体植株中 型均为叶片卷曲 突变体表现为 miR166a 和
11 。 pCB1294 。
miR319b基因的表达得到了极大增强 miR166g 水平升高 等 等
。 (Kim , 2005; Williams ,
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇32摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 34
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