Intracellular mechanisms of apoptosis induced by aminoglycoside antibiotics

127 Pages·2013·6.73 MB·English

Université Catholique de Louvain
Louvain Drug Research Institute
Unité de Pharmacologie Cellulaire
et Moléculaire

Intracellular mechanisms of apoptosis
induced by aminoglycoside antibiotics

Sophie Denamur

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Professeur Marie-Paule Mingeot-Leclercq
Co-promoteur : Professeur Paul M. Tulkens

2013
“Ne demande pas ton chemin à quelqu’un qui le connaît
car tu ne pourrais pas t’égarer »

Rabbi Nahman de Braslav

1
ACKNOWLEDGMENT

2
Au terme de ces six années de recherche, je tiens à remercier vivement toutes les
personnes qui, par leur aide, leurs conseils, leur soutien et leur présence, m’ont permis de
mener ce travail à son terme.
A ma promotrice, le Professeur Marie-Paule Mingeot-Leclercq, j’adresse mes chaleureux
remerciements pour son encadrement et son optimisme. Je lui suis également
reconnaissante pour la confiance qu’elle m’a accordée, me permettant de combiner au
mieux vie professionnelle et vie privée.
Au Professeur Paul Tulkens, dont les arguments m’ont convaincue il y a six ans de continuer
dans cette voie, je tiens à exprimer ma gratitude pour ses conseils, et pour l’expérience dont
il m’a fait bénéficier. La passion qui l’anime m’a toujours impressionnée, et je le remercie
pour ce qu’il m’a appris.
Je remercie le Professeur Bernard Gallez, qui me fait l’honneur de présider ce jury de thèse,
pour l’intérêt et la considération qu’il a porté à ces travaux. Je remercie également les
membres du comité de proximité et du jury, les Professeurs Pierre Courtoy, Pedro Buc
Calderon (UCL, Bruxelles) et Marc Debroe (Universiteit of Antwerpen) pour leur
disponibilitité, leurs conseils et leurs critiques constructives. Merci aux membres du jury
externe, le Professeur Katarina Kagedal (Linköping University, Sweden), le Professeur José
Lopez-Novoa (University of Salamanca, Spain), ainsi que le Docteur Hanna Appelqvist
(Linköping University, Sweden) de m’avoir fait l’honneur de participer à l’évaluation de ma
thèse. Tack ! Gracias !
Merci à Donatienne Tyteca et au Professeur Pierre Courtoy pour leur précieuse collaboration
à l’étude de la perméabilisation lysosomiale, pour leurs conseils judicieux et leur implication.
Marie-Claire… ou la reine incontestée de la culture des LLC-PK1 ! Merci pour les centaines
(ou milliers ??) de boîtes que tu m’as préparées. J’ai apprécié de toujours pouvoir compter
sur ton expérience, merci pour ton amitié et ta présence réconfortante.
A mes principales acolytes de bureau, Sandrine et Nathalie, merci pour votre amitié. Thèse,
mariage, naissance, déménagements, ou périodes plus difficiles, nous avons partagé des
moments forts de nos vies respectives et j’en garde un souvenir ému. Merci à Charlotte pour
les nombreuses heures de train et métro « voyagées » ensemble, nos conversations et ton
amitié me manquent.
Le travail ne serait pas le même sans les personnes que l’on a la chance de côtoyer au
quotidien. Je remercie les membres de l’unité FACM, anciens et actuels, pour leur
collaboration, leur amitié, leurs conseils, leur soutien. J’ai beaucoup appris au cours de ces
3
années, tant d’un point de vue scientifique que d’un point de vue humain. Merci à Françoise
Van Bambeke, Stéphane Carryn, Laëtitia Avrain, Hoang Anh Nguyen, Anne Spinewine,
Béatrice Marquez-Garrido, Oscar Domenech, Karine Berthoin, Mickaël Riou, Farid El Garch,
Myriam Ouberaï, Sylviane Carbonnelle, Qiang Tan, Thi Thu Hoai Nguyen, Julia Bauer,
Debaditya Das, Hamdy Aly, Hamdy Aly, Sébastien Van de Velde, Aurélie Olivier, Isabelle
Tytgat, Pierre Baudoux, Coralie Vallet, Laetitia Garcia, Virginie Mohymont, Martial
Vergauwen, Eugénie Basseres, Julien Buyck, Guillaume Sautrey, Wafi Siala, Els Ampe,
Ahalieyah Anantharajah, Ana Bastos, Katia Santos Saial, Hussein Chaloub, Ann Lismond,
Joseph Lorent, Tamara Milosevic, Hariri Mustafa, Frédéric Peyrusson, Nathalie Vandevelde,
Pierre Muller, Julie Maron…en espérant n’oublier personne !
Je remercie les étudiants qui, le temps d’un stage ou d’un mémoire ont partagé ce projet :
Vincent Rucchin, Quentin Willot, Kévin-Alexandre Delongie et Lidvine Boland. Un merci
particulier à Lidvine dont l’intérêt, la motivation et le sourire ont rendu notre collaboration de
ces deux dernières années très agréable et enrichissante.
J’ai également pu compter sur le soutien, l’amitié et les encouragements de mes collègues
assistants. Merci à Marie, Maximin, Antonia, Laurent, Flora, Sylvie, Stéphanie, Ann, Julie J.,
Julie C., Antoine, Pauline, Lucie, Caroline, Sandrine, Marc et Vincent.
Je remercie M. Alain Maenhout pour son aide en anglais, ainsi que ma Maman pour sa
relecture du manuscrit et ses conseils.
Toujours là pour me soutenir et m’encourager, je remercie mes parents pour l’intérêt qu’ils
ont toujours porté à mes projets, pour leur précieuse aide au quotidien, leur amour et leur
soutien inconditionnel.
Un grand merci à Gaëtan, qui a partagé les joies, les doutes, les peines et les larmes au fil
de ce travail, qui n’aurait peut-être pas atteint son terme sans toi. Merci de m’avoir écoutée,
soutenue et encouragée dans les périodes difficiles, je sais que ça n’a pas toujours été
facile.
Enfin, merci à Camille, mon petit Chou, que j’adore plus que tout, et qui m’aide à passer au
travers de toutes les difficultés…

4
INDEX

5
ACKNOWLEDGMENT .......................................................................................................... 2
ABBREVIATION LIST .......................................................................................................... 9
CHAPTER I. Introduction ...................................................................................................11
I.1. Concept of apoptosis ..................................................................................................12
I.2. Why to be interested in aminoglycoside antibiotics in 2013? .......................................13
I.3. The nephrotoxicity of aminoglycosides, a major drawback. .........................................17
I.4. Cellular mechanisms involved in apoptosis induced by aminoglycoside antibiotics and
pending questions .............................................................................................................18
I.4.1. Cellular uptake .....................................................................................................20
I.4.2. Lysosomal accumulation ......................................................................................21
I.4.3. Inhibition of lysosomal phospholipases and formation of myeloid bodies ..............22
I.4.4. Permeabilization of lysosomal membrane ............................................................23
I.4.5. Release of lysosomal content ...............................................................................28
1.4.6. Possible consequences of lysosomal membrane permeabilization ......................32
I.5. Aims of the study ........................................................................................................46
CHAPTER II. Gentamicin-induced lysosomal membrane permeabilization and
mechanism involved ..........................................................................................................47
Manuscript 1 : Role of oxidative stress in lysosomal membrane permeabilization and
apoptosis induced by gentamicin, an aminoglycoside antibiotic. .......................................48
Supplementary material ....................................................................................................59
Additional data ..................................................................................................................62
CHAPTER III. Could we generalize the effect of cytosolic gentamicin to other
aminoglycosides ? .............................................................................................................64
Manuscript 2 : Apoptosis induced by aminoglycosides in LLC-PK1 cells : comparative
study of neomycin, gentamicin, amikacin and isepamicin using electroporation. ...............65
CHAPTER IV. What could link gentamicin-induced lysosomal membrane
permeabilization and mitochondrial pathway of apoptosis ? .........................................74
IV.1. Material and methods ...............................................................................................75
6
IV.1.1. Materials ............................................................................................................75
IV.1.2. Cells and treatments ..........................................................................................76
IV.1.3. Counting apoptotic cells .....................................................................................76
IV.1.4. Western blot analysis .........................................................................................76
IV.1.5. Proteasome activities assay ...............................................................................77
IV.1.6. Statistical analysis ..............................................................................................78
IV.2. Results .....................................................................................................................78
IV.2.1. Implication of p53 signaling pathway ..................................................................78
IV.2.2. Slight accumulation of cyclin-dependent kinases inhibitors.................................79
IV.2.3. Absence of accumulation of ER chaperones and slight accumulation of
phosphorylated eIF2α ....................................................................................................80
IV.2.4. Inhibition of trypsin- and caspase-like activitites of proteasome at high doses in
cellular lysates ...............................................................................................................81
IV.2.5. Slight accumulation of ubiquitinated proteins ......................................................84
IV.3. Discussion ................................................................................................................85
CHAPTER V. Main findings of this work ...........................................................................91
V.1.1. Gentamicin induced lysosomal membrane permeabilization ...............................92
V.1.2. ROS and iron played a critical role in lysosomal membrane permeabilization
induced by gentamicin ...................................................................................................92
V.1.3. Cytosolic aminoglycosides are responsible for apoptosis ....................................93
V.1.4. p53 signaling pathways is implicated in gentamicin-induced apoptosis ...............93
CHAPTER VI. General discussion .....................................................................................95
VI.1. Interest and limits of LLC-PK1 cellular model ...........................................................96
VI.2. Pending questions and perspectives ........................................................................98
VI.2.1. Could we generalize the concept of ROS production through iron implication to
other aminoglycosides? .................................................................................................98
VI.2.2. Is cathepsin release implicated in gentamicin-induced apoptosis? .....................99
VI.2.3. What is the role of p53? .....................................................................................99
VI.2.4. How could NFB be activated by gentamicin?.................................................. 101
7
VI.2.5. Does p21 and p27 accumulation have consequences on cell-cycle progress? . 102
VI.2.6. Does gentamicin induce autophagy? ................................................................ 103
VI.2.7. Integration of our results within existing knowledge .......................................... 105
REFERENCES ................................................................................................................... 107
SUMMARY ......................................................................................................................... 124

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ABBREVIATION LIST

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