Instrumentelle Analytik und Bioanalytik: Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanalytik, Applikationen

497 Pages·2008·9.18 MB·German

by  Manfred H. Gey (auth.)

Springer-Lehrbuch
Manfred H. Gey
Instrumentelle Analytik
und Bioanalytik
Biosubstanzen, Trennmethoden,
Strukturanalytik, Applikationen
2., überarbeitete und erweiterte Auflage
123
Prof.Dr.ManfredH.Gey
HochschuleZittau/Görlitz(FH)
02763Zittau
Deutschland
[email protected]
www.papa-gey.de
ISBN978-3-540-73803-9 e-ISBN978-3-540-73804-6
DOI10.1007/978-3-540-73804-6
Springer-LehrbuchISSN0937-7433
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In Erinnerung an meine Eltern Charlotte
und Oskar Gey und für unsere Familie

Alle Dinge werden zu einer Quelle der Lust,
wenn man sie liebt.
Thomas von Aquin
Vorwort
Unter „Instrumenteller Bioanalytik“ versteht man ein umfassendes und vielseitiges
Arsenal analytischer Methoden zur Analyse und Charakterisierung niedermole-
kularer Biosubstanzen und vor allem von Biopolymeren in komplexen biolo-
gischen Matrices innerhalb der Biochemie und Pharmazie, Chemie und Umwelt-
chemie, Biologie und Genetik, Biomedizin und Immunologie, Biotechnologie und
Toxikologie.
Das Buch soll Studenten, Diplomanden und Doktoranden dieser Fachrichtun-
gen sowie spezialisierten Laboranten und Technikern zur erfolgreichen Lösung
bioanalytischer Fragestellungen dienen.
Im Mittelpunkt des Buches stehen theoretische und methodische Grundlagen
über leistungsfähige Trennmethoden, Strukturanalytik und Kombinationen zwi-
schen beiden. Das instrumentelle Methodenspektrum reicht von der Hochleis-
tungsflüssigchromatographie (HPLC) und Biochromatographie (BioLC), der klas-
sischen Elektrophorese und Kapillarelektrophorese (CE) bis zur UV/VIS- und
Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie (MS, MALDI-MS, MALDI-PSD),
Kernresonanzspektroskopie (NMR) und verschiedenen Kopplungsvarianten der
Chromatographie mit der Strukturanalytik (LC-MS).
Über jede einzelne dieser Methoden existieren ausführliche Monographien. Zu-
sammenfassende Darstellungen zur Funktionsweise und integrierten Anwendung
mehrerer bioanalytischer Methoden sind zz. wenig bekannt. Das Buch soll zur
Schließung dieser Lücke beitragen.
In den vergangenen Jahrzehnten entwickelten sich hochqualifizierte Methoden-
spezialisten, die oft nur eine Technik (z. B. HPLC, Elektrophorese, GC, MS oder
NMR) perfekt beherrschten und ausübten. Heutzutage sind der integrierte Einsatz
und die Beherrschung mehrerer analytischer Methoden gefragt und unbedingt
notwendig.
HPLC und CE sind ein gutes Beispiel für den kombinierten und sich ergänzen-
den Methodeneinsatz. Mit Hilfe der HPLC können ca. 80% aller Substanzen ana-
lysiert werden. Dies betrifft kleine Ionen oder Moleküle, polare und unpolare
Substanzen sowie hochmolekulare Biomoleküle wie Proteine oder Glycoproteine.
Die Kapillarelektrophorese wird als komplementäre Analysenmethode zur HPLC
angesehen. Was mit der HPLC nicht zu trennen ist, gelingt oft mit der CE oder
umgekehrt. Als Trennmethoden sind sie jedoch bei der Identifizierung unbekann-
ter biologischer Substanzen nur dann erfolgreich, wenn entsprechende Referenz-
substanzen zur Verfügung stehen.
VIII Vorwort
Da dies nicht immer der Fall ist, sind neben präparativen Trenntechniken zu-
nehmend moderne Kopplungstechniken in Kombination mit strukturanalytischen
Methoden (LC-MS) erforderlich.
Ein besonders Innovationspotential geht zz. von der Massenspektrometrie mit
schonenden Ionisierungstechniken aus. Insbesondere die neuen Electrospray- und
MALDI-Techniken sind in der Lage, sowohl niedere als auch hochmolekulare
Biosubstanzen in ihren Strukturen bis fast in alle Einzelbausteine zu identifizieren.
Das Buch beinhaltet weiterhin ausgewählte Applikationen u. a. aus den Berei-
chen Metallothioneine (Phytochelatine), Nucleobasen und Nucleoside, Kohlen-
hydrate, organische Säuren und Fettsäuren, die zu den kleineren Biosubstanzen
gehören.
Phospholipide und Neutrallipide, Nucleotide (DNA-Fragmente), Oligosaccha-
ride (Glycanketten von Glycoproteinen) und thermostabile Enzyme vertreten die
Biopolymere.
Es werden auch Methoden der Probenvorbereitung und -konzentrierung wie
Dialyse, Zentrifugation, Lyophilisation, Extraktion, Filtration, Fällung oder Batch-
Adsorption einbezogen.
Natürlich verfügen viele Universitäten, Hoch- und Fachschulen sowie kleinere
Institutionen und Firmen (noch) nicht über ein komplettes instrumentalanalyti-
sches Methodenspektrum (HPLC, CE, GC, MS, MALDI-MS, NMR, GC-MS,
LC-MS). Die Frage nach „ungeliebten“ zentralen analytischen Laboratorien könnte
deshalb im Vergleich zur etablierten dezentralen Analytik in den Forschungsinsti-
tutionen in Zukunft wieder verstärkt in den Vordergrund der Diskussion rücken.
Ziel dieses Buches ist es demzufolge auch, die Forscher und Anwender zu ver-
stärkten interdisziplinären Kooperationen auf analytischen Gebieten (Bioanalytik,
Umweltanalytik) zu motivieren. Die anschaulich und verständlich hier dargestellte
Methodenvielfalt soll einen Ansatzpunkte dafür bieten.
Für ein vertieftes Studium von einzelnen (bio)analytischen Methoden ist es rat-
sam, die angegebene weiterführende Spezialliteratur hinzuzuziehen. Dies betrifft
insbesondere die Kenntnisse auf dem Gebiet der NMR und MS sowie über Struk-
tur und Funktion von Biomolekülen, die in den einführenden Abschnitten nur kurz
behandelt werden.
Das Buch resultiert aus meiner Forschungs- und Lehrtätigkeit auf dem Gebiet
der Bioanalytik, die ich in den vergangenen Jahren im Institut für Biotechnologie
Leipzig der Akademie der Wissenschaften der ehemaligen DDR (1986–1991),
dem Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Johannes-Gutenberg-
Universität Mainz (1991–1995) und dem Institut für Biochemie der Martin-Luther-
Universität Halle-Wittenberg (1996–1997) durchgeführt habe.
Meine Überzeugung ist, daß in Zukunft die Bioanalytik in Forschung und Leh-
re einen höheren Stellenwert erhält und ein neues innovatives „Wissenschafts-
gebiet“ darstellen wird.
Fast alle Graphiken und Abbildungen sowie der gesamte Text wurden von mir
selbst erstellt und in den Computer „hinein getippt“. Für die Chromatogramme und
Spektren erfolgte zur anschaulicheren Präsentation eine zusätzliche Bearbeitung.
Vorwort IX
Nach anfänglicher Frustration habe ich die Bearbeitung des Buches mit dem
Computer und entsprechenden Programmen schätzen gelernt und kann mir heute
die analytische Forschungs- und Lehrtätigkeit ohne diese „Werkzeuge“ nicht mehr
vorstellen. Es sind 26 MB Datenmaterial zusammengekommen, die jederzeit er-
gänzt und erweitert werden können. Auf Grund der Vielfalt der Methoden und
Spezialgebiete werden Verbesserungen ständig notwendig sein. Für entsprechende
Anregungen und Hinweise wäre ich sehr dankbar.
Weiterhin möchte ich vielen Fachkollegen/-innen, die meinen Weg als „Bio-
Analytiker“ begleitet und gefördert haben, einen herzlichen Dank für die zahlrei-
chen positiven Diskussionen, Hilfen und Ratschläge aussprechen.
Mein besonderer Dank gilt der Lektorin Frau Dr. Angelika Schulz vom Vieweg-
Verlag für Ihr Engagement und Ihre Geduld während der Erstellung des Buches.
Leipzig am 3. Juni 1998 Manfred H. Gey
Vorwort zur 2. Auflage
Der aktualisierte Titel „Instrumentelle Analytik und Bioanalytik“ reflektiert die
deutlich erweiterten Inhalte des neuen Buches und ein noch umfangreicheres Me-
thodenspektrum. Das betrifft die analytischen Trenntechniken HPLC, TLC und
GC sowie spektroskopische Methoden wie die Infrarotspektroskopie (IR) und
Atomspektroskopie (AAS, OES, ICP-MS). Auch das Arsenal der Präanalytik
(SPME, SPE u. a.) ist aktualisiert und ausführlicher dargestellt.
Innerhalb der Kopplungen von instrumentellen Methoden untereinander
(LC-NMR, GC-FTIR) oder von bioanalytischen Techniken (2-D-Elektrophorese)
sind rasante Entwicklungen und neue Innovationen zu verzeichnen. Die Kopp-
lungstechniken („hyphenated techniques“) beinhalten auch Kombinationen zwi-
schen Methoden der Probenvorbereitung und der Chromatographie (SPE-LC,
SPME-GC) sowie von Säulenschalttechiken wie LC-LC oder GC-GC. Die unter-
schiedlichsten Kopplung und die Kombinationen innerhalb der LC-MS
(LC-ESI-MS, LC-APCI-MS, LC-APPI-MS) werden ausführlich und anhand von
Applikationsbeispielen vorgestellt.
Neu innerhalb der Bioanalytik ist auch das hoch innovative Forschungsgebiet
der Proteomanalytik (Proteomics), für das eine erste Einführung präsentiert wird.
Die Grundlagen und Applikationen bereits bekannter Immunoassays und von
Biosensoren tragen außerdem zur Erweiterung der Bioanalytik bei.
Für eine möglichst schnelle und verständliche Erklärung (bio)analytischer Me-
thoden sowie für die Darstellung repräsentativer Applikationen wurden zahlreiche
neue Zeichnungen bzw. Abbildungen erstellt. Sie sollen den Einstieg von Studen-
ten und Mitarbeitern in die Instrumentelle Analytik und Bioanalytik fördern.
Zielgruppen sind neben den Studenten auch wissenschaftliche und technische
Mitarbeiter sowie Doktoranden vor allem innerhalb neuer innovativer Gebiete der
Biowissenschaften (Bioanalytik/Biochemie, Biotechnologie, Biomedizin, Pharma-
zie, Lebensmittelchemie, Toxikologie, Alternativ-Energien) aber auch klassischer
Gebiete wie Umeltchemie/Technische Chemie oder Chemie und Energie.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Peter Enders, Dr. Steffen Pauly und Frau
Pamela Frank vom Springer-Verlag für die stetige Motivation, Geduld und das
Engagement innerhalb der Realisierung dieser 2. Auflage.
Zittau am 29. Februar 2008 Manfred H. Gey
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................................... 1
2 Biomoleküle............................................................................................... 9
2.1 Proteine.............................................................................................. 9
2.1.1 Aminosäurestrukturen........................................................... 10
2.1.1.1 Zwitterionenform und pH-Abhängigkeit............... 12
2.1.1.2 pK-Werte und isoelektrischer Punkt...................... 13
2.1.1.3 D- und L-Konfiguration......................................... 14
2.1.2 Proteinstrukturen................................................................... 14
2.1.2.1 Peptidbindung........................................................ 14
2.1.2.2 Sulfidbindung........................................................ 15
2.1.2.3 Aminosäuresequenz............................................... 15
2.1.2.4 Primär-, Sekundär-, Tertiär- und
Quarternärstruktur.................................................. 18
2.1.2.5 α-Helix und ß-Faltblatt.......................................... 18
2.1.3 Denaturierung und Redenaturierung..................................... 20
2.1.4 Glutathion- und Metallothioneinstrukturen........................... 21
2.2 Nucleinsäuren.................................................................................... 24
2.2.1 Strukturen.............................................................................. 24
2.2.2 Doppelhelix, Basenpaarung und Replikation........................ 27
2.2.3 Translation und Transkription............................................... 30
2.2.4 Die Polymerasekettenreaktion............................................... 30
2.3 Glycoproteine..................................................................................... 33
2.3.1 Strukturen.............................................................................. 33
2.3.1.1 N-glycosidische Bindung....................................... 35
2.3.1.2 O-glycosidische Bindung....................................... 37
2.3.2 Isolierung von Glycoproteinen aus Membranen.................... 37
2.3.3 Enzymatische Sequenzierung der Glycane............................ 42
2.3.4 Freisetzung der Glycane aus Proteinen.................................. 45
2.3.4.1 Enzymatische Isolierung........................................ 45
2.3.4.2 Hydrazinolyse........................................................ 46
2.3.5 Markieren der Glycane.......................................................... 46
2.3.5.1 Fluoreszenzmarkierung mit 2-AB und BAP.......... 47
2.3.5.2 Radioaktive Markierung........................................ 48
XIV Inhaltsverzeichnis
2.4 Lipide................................................................................................. 49
2.4.1 Strukturen.............................................................................. 49
2.4.2 Biosyntheseprozesse.............................................................. 53
2.4.2.1 Cholesterin und Squalen........................................ 53
2.4.2.2 Ceramid und Cerebrosid........................................ 54
2.5 Literatur............................................................................................. 55
3 Präanalytische Methoden......................................................................... 57
3.1 Einführung......................................................................................... 57
3.2 Extraktionstechniken.......................................................................... 57
3.2.1 Soxhlet-Extraktion................................................................. 59
3.2.2 Flüssig-Flüssig-Extraktion..................................................... 60
3.2.3 Mikrowellenunterstützte Extraktion...................................... 61
3.2.4 Ultraschallunterstützte Extraktion......................................... 62
3.2.5 Überkritische Fluidextraktion................................................ 62
3.2.6 Headspace- und Purge-and-Trap-Technik............................. 63
3.2.7 Beschleunigte Lösungsmittelextraktion................................. 65
3.2.8 Festphasenextraktion............................................................. 66
3.2.8.1 Eigenschaften und Struktur von Silicagelen.......... 66
3.2.8.2 Polymermaterialien................................................ 67
3.2.8.3 Prinzip der Festphasenextraktion........................... 68
3.2.8.4 Sorbentien und Trennsysteme in der SPE.............. 72
3.2.8.4.1 SPE mit Normalphasen
(Adsorptions-SPE)............................... 72
3.2.8.4.2 SPE mit chemisch gebundenen
Phasen.................................................. 73
3.2.8.4.3 SPE mit Reversed-Phase-
Materialien........................................... 74
3.2.8.4.4 SPE mit Anionenaustauschern............. 74
3.2.8.4.5 SPE mit Kationenaustauschern............ 75
3.2.9 Matrix solid phase dispersion................................................ 75
3.2.10 Festphasenmikroextraktion.................................................... 76
3.3 Reinigung, Anreicherung von Biomolekülen.................................... 79
3.3.1 Lysozymbehandlung.............................................................. 79
3.3.2 Aussalzen............................................................................... 80
3.3.3 Lyophilisation........................................................................ 81
3.3.4 Dialyse................................................................................... 82
3.3.5 Ultrazentrifugation................................................................ 83
3.3.6 Batch-Adsorption.................................................................. 85
3.3.7 Flüssig-Flüssig-Extraktion – Erhalt der
biologischen Aktivität............................................................ 86
3.3.8 Filtration................................................................................ 87
3.3.8.1 Mikrofiltration....................................................... 88
3.3.8.2 Ultrafiltration......................................................... 88
3.4 Literatur............................................................................................. 89