Initiation and Regulation of Integrin-Mediated Adhesion to Fibronectin in Fibroblasts

184 Pages·2017·23 MB·English

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Initiation and Regulation of
Integrin-Mediated Adhesion to
Fibronectin in Fibroblasts
Doctoral Thesis
Author(s):
Strohmeyer, Nico
Publication date:
2018
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-b-000252046
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DISS. ETH NO. 24850(cid:2)

Initiation and Regulation of Integrin-Mediated
Adhesion to Fibronectin in Fibroblasts

A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)

presented by
Nico Strohmeyer
Dipl. Nat., Technische Universität Bergakademie Freiberg
born on 02.05.1986
citizen of
Federal Republic of Germany

accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Daniel J. Müller
Prof. Dr. Reinhard Fässler
Prof. Dr. Michael Nash

2018

To my wife and family

Research is what I’m doing when I don’t know what I’m doing.
Wernher von Braun

1-I

Zusammenfassung
Für die korrekte physiologische Funktion von Geweben sind spezifische adhäsive Interak-
tionen zwischen Zellen und der extrazellulären Umgebung essentiell. Die primären Zelladhäsi-
onsrezeptoren für viele extrazelluläre Strukturproteine, wie Kollagene, Fibronektin und Lami-
nine sind Integrine. Diese binden an die extrazellulären Strukturproteine und koppeln sie über
Adapterproteine an das Zytoskelett. Dadurch werden Zellen an der extrazellulären Matrix ver-
ankert. Wenn Integrine an Strukturproteine binden, bilden sie kleine Adhäsionscluster, welche
im Verlauf der Adhäsionsformation zu großen fokalen Adhäsionen reifen. Während dieser Rei-
fung wird die Verbindung zwischen Adhäsionsclustern und extrazellulären Strukturproteinen
durch eine Vielzahl von intrazellulären Proteinen stabilisiert. Der Prozess der Adhäsionsreifung
wird durch viele intra- und extrazelluläre Faktoren reguliert, unter anderem durch physikali-
schen Parameter der extrazellulären Umgebung und verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden.
Allerdings ist nicht bekannt welchen Einfluss physikalische Parameter der Umgebung oder der
Zelle auf die Adhäsionsinitiierung durch Integrine haben. Weiterhin ist nicht bekannt, ob und
wie sich verschiedene Integrine gegenseitig im Prozess der Adhäsionsinitiierung in ihrer Funk-
tion beeinflussen. Mittels Rasterkraftmikroskopie-basierte Einzelzell-Kraftspektroskopie
(SCFS) kann die Adhäsionsstärke während der Adhäsionsinitiierung quantitativ bestimmt wer-
den. Dafür wird eine Zelle an einen Kraftsensor, den Cantilever, angebracht und an ein Substrat,
welches eine proteinbeschichtete Oberfläche, eine andere Zelle oder ein Gewebe sein kann, an-
genähert, bis die Zelle mit diesem in Kontakt ist. Nach einer bestimmten Adhäsionszeit wird die
Zelle zurückgezogen und vom Substrat abgelöst. Während des Ablösens der Zelle wird die ma-
ximale Kraft, welcher die Zelle widerstehen kann, bevor sie sich vom Substrat ablöst und die
Bindungsstärke einzelner Adhäsionsrezeptoren bestimmt.
Eine Einschränkung der Rasterkraftmikroskopie-basierten SCFS, ist ein geringer experi-
menteller Durchsatz und damit verbunden ein hoher Zeitaufwand um statistisch aussagekräftige
Ergebnisse zu erlangen. Ein Grund dafür ist, dass es bislang keine einfache experimentelle Mög-
lichkeit gibt, Adhäsionsparameter einzelner Zellen für verschiedene Substrate zu bestimmen.
Daher haben wir eine Maske entwickelt, welche erlaubt einen Untergrund mit vier verschiede-
nen Substraten zu beschichten. Diese Maske ist einfach zu produzieren, ermöglicht den direkten
Vergleich von Adhäsionsbildung einer Zelle auf verschiedenen Substraten und minimiert so ex-
perimentelle Zeit und Kosten.
Um eine Zelle an den Kraftsensor des Rasterkraftmikroskops anzuheften, müssen adhärente
Zellen zuerst von einer Zellkulturschale abgelöst werden. Das wird in der Regel durch den Ein-
satz der Protease Trypsin, welche Proteine an der Zelloberfläche verdaut, in Verbindung mit
dem Entfernen von Adhäsions-essentiellen Ionen erreicht. Welchen Einfluss das Ablösen der
Zellen von der Kulturschale auf die nachfolgenden, sehr sensitiven Adhäsionsexperimente hat,
war bisher nicht bekannt. Unsere Experimente zeigen, dass das Ablösen der Zellen durch das
II Zusammenfassung

Entfernen von Ionen keinen systematischen Einfluss auf die nachfolgenden Adhäsionsmessun-
gen hat. Jedoch führt das Ablösen mit Trypsin von Fibroblasten zu einer deutlichen Erhöhung
der Adhäsionskraft zu Fibronektin in den nachfolgenden Adhäsionsexperimenten. Allerdings ist
die Adhäsionskraft, nach einer Erholungsphase der Fibroblasten von etwa 45 Minuten nach dem
Ablösen, auf dem Niveau der Zellen die durch das Entfernen von Ionen Abgelöst wurden. Somit
hat auch die Ablösung der Zellen mit Trypsin nach etwa 45 Minuten keinen Einfluss mehr auf
die Adhäsionsexperimente. Allerdings deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass mittelfristig die
Adhäsion zu bestimmten Substraten, wie in diesem Fall Fibronektin, von bestimmten Zelltypen
durch das Ablösen mit Trypsin beeinflusst werden.
Adhäsion von Fibroblasten zu Fibronektin wird hauptsächlich durch zwei verschiedene In-
tegrine, a5b1 und aVb3 Integrine, initiiert. Allerdings ist weitgehend unbekannt, wie beide In-
tegrine die Adhäsionsinitiierung regulieren. Unsere Experimente zeigen, dass beide Integrine
um das Binden an Fibronektin konkurrieren. Auf Grund höherer Bindungskinetik und/oder bes-
serer Stabilisierung der aVb3 Integrine durch Adapterproteine binden aVb3 Integrine an Fib-
ronektin schneller als a5b1 Integrine. Nachdem sie an ihren Liganden gebunden haben, bilden
aVb3 Integrine kleine Adhäsionscluster, welche weiter reifen. Durch das Rekrutieren diverser
intrazelluläre Proteine zu den Adhäsionsclustern initiieren aVb3 Integrine Signale, welche über
eine große Reichweite das Binden von a5b1 Integrine an Fibronektin fördern. Weiterhin wird
die Clusterbildung von Fibronektin-gebundenen a5b1 Integrine beschleunigt, was zu einer
schnelleren Verstärkung der Verbindung zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix führt. Der
Signalweg zwischen aVb3 und a5b1 Integrine setzt sich aus verschiedenen Proteinen, ein-
schließlich Proteinen die das Zytoskelett regulieren.
Während Fibroblasten Adhäsion zu Fibronektin aufbauen, müssen neu gebildete Adhäsi-
onspunkte extra- und intrazellulär generierten Kräften widerstehen können. Um Erkenntnisse
zu bekommen, wie Fibroblasten die initiale Adhäsion in Reaktion auf unterschiedliche mechani-
sche Belastungen regulieren, haben wir Fibroblasten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten
von Fibronektin separiert und die maximale Kraft, der sie widerstehen können, quantifiziert.
Unsere Resultate zeigen, dass Fibroblasten, welche für etwa zwei Sekunden in Kontakt mit Fib-
ronektin sind, ihre Adhäsion in Reaktion auf mechanische Belastung regulieren. Bei niedriger bis
mittlerer mechanischer Belastung an neu formierten Adhäsionen, bilden a5b1 Integrine und Fib-
ronektin „catch bonds“, welche durch eine längere Bindungsdauer bei mechanischer Belastung
gekennzeichnet sind. Abhängig von diesen catch bonds initiieren a5b1 Integrine ein sehr
schnelle Signalkaskade (unter 0.5 Sekunden), welche über zwei Kinasen (focal adhesion kinase
und src kinase) die Bindung anderer Integrine an Fibronektin bedingt. Weiterhin ist für die Re-
aktion auf mechanische Belastung die Verbindung zwischen Integrinen und dem Zytoskelett,
sowie Proteine die Aktin polymerisieren wichtig. Wenn die mechanische Belastung an den neu
gebildeten Adhäsionen zu hoch wird, können keine zusätzlichen Integrine an Fibronektin ge-
bunden werden und die Adhäsionsverstärkung schlägt fehl.
1-III

Summary
For the proper physiological function of tissues, specific adhesive interactions between
cells and the extracellular environment are essential. The main cell adhesion receptors for many
extracellular structural proteins, such as collagens, fibronectin and laminins are integrins. These
bind to the extracellular structural proteins and couple them via adapter proteins to the cyto-
skeleton. This anchors cells to the extracellular matrix. When integrins bind to structural pro-
teins, they form small adhesion clusters that mature into large focal adhesions in the course of
the adhesion formation. During this maturation, the connection between adhesion clusters and
extracellular structural proteins is stabilized by a variety of intracellular proteins. The process of
adhesion maturation is regulated by many intracellular and extracellular factors, including phys-
ical parameters of the extracellular environment and various intracellular signaling cascades.
However, the influence of physical parameters of the environment or the cell have on adhesion
initiation by integrins is largely unknown. Furthermore, it is not known whether and how dif-
ferent integrins influence each other's function in the process of adhesion initiation. Atomic
force microscopy (AFM)-based single-cell force spectroscopy (SCFS) can be used to quantify
the adhesion strength during adhesion initiation. For this purpose, a cell is attached to a force
sensor, the AFM-cantilever. The cantilever-bound cell is approached onto a substrate, which can
be a protein-coated surface, another cell or a tissue, until the cell is in contact with it. After a
certain adhesion time, the cell is withdrawn and detached from the substrate. As the cell is with-
drawn from the substrate, the maximum force that the cell can withstand before it detached from
the substrate and the binding strength of individual adhesion receptors are quantified.
A limitation of the atomic force microscopy-based SCFS, is a low experimental throughput
and an extended experimental time to obtain statistically reliable results. One reason for this is
that no simple experimental method exists that allows to characterize adhesion parameters of a
single cell to multiple substrates. Therefore, we have developed a mask that allows to coat a
surface with four different substrates. This mask is easy to produce, allows direct comparison of
cell adhesion formation on different substrates, thereby minimizing experimental time and cost.
To attach a cell to the force sensor of the AFM, adherent cells must first be detached from
a cell culture dish. This is typically achieved by the use of the protease trypsin, which digests
proteins on the cell surface, in combination with the removal of adhesion-essential ions. The
influence cell detachment from the culture dish on the subsequent, very sensitive adhesion ex-
periments, was not previously known. Our experiments show that detachment of cells by the
removal of ions has no systematic influence on the adhesion measurements. However, detach-
ment of fibroblasts with trypsin results in a marked increase in the adhesion force to fibronectin
in subsequent adhesion experiments. However, after a recovery time of about 45 minutes after
detachment from the cell culture dish, the adhesion force of fibroblasts is at the level of the cells
which have been detached by the removal of ions. Thus, the detachment of the cells with trypsin
IV Summary

after about 45 minutes has no influence on the adhesion experiments. However, these results
indicate that adhesion of certain cell types to certain substrates, such as fibronectin in this case,
will be affected by detachment with trypsin.
Adhesion of fibroblasts to fibronectin is primarily initiated by two different integrins,
a5b1 and aVb3 integrins. However, it is largely unknown how these integrins regulate adhesion
initiation. Our experiments show that both integrins compete for binding to fibronectin. Due to
higher binding kinetics and/or better stabilization of the aVb3 integrins by adapter proteins,
aVb3 integrins bind to fibronectin faster than a5b1 integrins. After binding to their ligands,
aVb3 integrins form small adhesion clusters that mature in larger adhesion clusters. By recruit-
ing diverse intracellular proteins into the adhesion clusters, aVb3 integrins initiate signals that
promote the binding of a5b1 integrins to fibronectin over long distances. Furthermore, the clus-
tering of fibronectin-bound a5b1 integrins is accelerated, resulting in a faster enhancement of
the cell-extracellular matrix linkage. The signaling pathway between aVb3 and a5b1 integrins
consists of several proteins, including proteins that regulate the cytoskeleton.
While fibroblasts build adhesion to fibronectin, newly formed adhesions must withstand
extra- and intracellularly generated forces. To gain insight into how fibroblasts regulate initial
adhesion in response to different mechanical loads, we have separated fibroblasts at different
speeds from fibronectin and quantified the maximum force they can withstand. Our results show
that fibroblasts, which were in contact with fibronectin for about two seconds, regulate their
adhesion in response to mechanical load. At low to moderate mechanical load on newly formed
adhesions, a5b1 integrins and fibronectin form catch bonds, which are characterized by an in-
creased bond lifetime under mechanical stress. Depending on these catch bonds, a5b1 integrins
initiate a very fast signaling cascade (less than 0.5 seconds), which causes the binding of other
integrins to fibronectin via two kinases (focal adhesion kinase and src kinase). Furthermore, for
the reaction to mechanical stress, the connection between integrins and the cytoskeleton, as well
as proteins that polymerize actin important. If the mechanical load on the newly formed adhe-
sions overcomes a threshold, no additional integrins can be bound to fibronectin and the adhe-
sion enhancement fails.
1-V

Table of Content
1. Introduction ........................................................................................................ 1
1.1. Cell Adhesion ..................................................................................................... 1
1.2. The Extracellular Matrix and Fibronectin ........................................................ 1
1.3. Integrins .............................................................................................................. 4
1.3.1. Evolution and Complexity of Integrins ................................................................ 5
1.3.2. Integrin Structure and Conformations ................................................................ 6
1.3.3. Integrin Ligand Binding ....................................................................................... 9
1.4. Adaptor Proteins Regulate Integrin Function ................................................ 10
1.4.1. Talin ................................................................................................................... 10
1.4.2. Kindlin ............................................................................................................... 12
1.4.3. Integrin Inactivation .......................................................................................... 13
1.5. The Life of Integrins......................................................................................... 14
1.5.1. Integrin Clustering and Nascent Adhesion Formation ...................................... 14
1.5.2. Adhesion Maturation and Adhesome Formation .............................................. 15
1.5.3. Adhesion Disassembly and Integrin Recycling .................................................. 17
1.6. Integrin-Mediated Mechanotransduction ....................................................... 18
1.6.1. Forces Regulate Integrin Binding ...................................................................... 18
1.6.2. Actin Regulation by Force ................................................................................. 19
1.6.3. Mechanosensitive Adhesome Proteins ............................................................... 20
1.6.4. The Molecular Clutch Model ............................................................................. 21
1.7. Characterizing Cell Adhesion and Tensional States ...................................... 23
1.7.1. Bulk Adhesion Characterization Methods ......................................................... 23
1.7.2. Single-Cell Adhesion Measurements ................................................................. 24
1.7.3. Traction Force Measurements ........................................................................... 26
1.7.4. Molecular Tension Sensors ................................................................................ 27
1.8. References ........................................................................................................ 27
2. Increasing throughput of AFM-based single cell adhesion measurements
through multi-substrate surfaces ................................................................... 41
2.1. Abstract ............................................................................................................. 43
2.2. Introduction ...................................................................................................... 45
2.3. Results ............................................................................................................... 47
2.3.1. PDMS masks for single-cell force spectroscopy ................................................. 47
2.3.2. Characterization of protein coating on PDMS masks ....................................... 48
2.3.3. Accessibility of the coated area with cantilever bound cells. ............................. 49
2.3.4. Evaluation of the PDMS masks for light microscopy......................................... 50
2.3.5. Comparison of non-specific adhesion force on glass and PDMS surfaces......... 50