início e manutenção da inativação do cromossomo x em células humanas

194 Pages·2012·17.24 MB·Portuguese

Ana Maria Fraga

I
NÍCIO E MANUTENÇÃO DA INATIVAÇÃO DO
X
CROMOSSOMO EM CÉLULAS HUMANAS

São Paulo
2012
Ana Maria Fraga

Início e manutenção da inativação do
cromossomo X em células humanas

Establishment and maintenance of X-chromosome
inactivation in human cells

Tese apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências, na Área de
Biologia (Genética).

Orientadora: Profa. Dra. Lygia da
Veiga Pereira Carramaschi

São Paulo
2012
Fraga, Ana Maria
Início e manutenção da inativação do cromossomo X em
células humanas.
194p.
Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências da Universidade
de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.
Descritores: 1. Inativação do cromossomo X. 2. Célula-tronco

embrionária humana. 3. Epigenética.
Universidade de São Pa ulo. Instituto de Biociências.
Departamento de Genética e Bio logia Evolutiva.

Comissão Julgadora

________________________ _______________________

________________________ _______________________

_____________________________________
Profa. Dra Lygia da Veiga Pereira Carramaschi
(orientadora)
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro da FAPESP (Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo), concedido à aluna Ana Maria Fraga (2008/00058-0).
AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer à Profa. Lygia Pereira, pela orientação, colaboração e estímulo
durante todos esses anos de pesquisa.

Aos meus amigos de laboratório Ana Cláudia, Bruno, Cláudia, Cynthia, Fabiano, Fernanda,
Fernando, Giovana, Gustavo, Tiago. Particularmente à Simone e à Naja, pela amizade,
imensa ajuda nos experimentos e pelas discussões sobre ICX.

Aos meus amigos do Departamento de Genética, aos quais recorro sempre que necessário –
quase todos os dias... Em especial: Rafa, Lilian, Ana Carla, Teresa, Fátima, Mara, Lígia,
Débora, Fernando, Juliana, Natale, Marianne e Marcos, pela ajuda, pelos cafés e almoços.
Deisy e Helenice, não esqueço de vocês!

Agradeço aos professores Ângela Morgante, Regina Mingroni, Luciana Haddad, Sabine
Eggers, Eduardo Gorab, Luís Netto e Luciana Vasques. À profa. Carla Rosemberg e sua
equipe, pelo array-CGH; ao Fertility, em especial à Rita, Camila e Luciana, e à equipe do
Centro de Reprodução Humana Prof. Franco Jr, pela colaboração. À Dra. Izabela Salomão,
pela análise dos dados do REDOME, e à Dra. Virgínia Picanço, pela ajuda na produção dos
lentivírus.

Sou muito grata especialmente à Érica, Joana e Raquel, minhas amigas de coração, que me
ajudaram tantas vezes e fizeram minha rotina no laboratório mais feliz. Agradeço pelas
discussões e sugestões, vocês também fazem parte disso tudo.

Aos meus familiares, tios e avós, que sempre torceram por mim.

E finalmente agradeço muito aos meus pais e irmãs, pelo carinho e incentivo. Obrigada por
entenderem minha escolha e me apoiarem, pelo colo e pelo ombro, por me ajudarem a não

perder o norte nos momentos difíceis. Sem vocês, eu não conseguiria.
ÍNDICE

Lista de Figuras........................................................................................................................I
Lista de Tabelas.....................................................................................................................III
Lista de Abreviaturas............................................................................................................IV
Capítulo I. Introdução ao estudo da inativação do X..............................................................1
Objetivos gerais...................................................................................................25
Capítulo II. Células-tronco embrionárias humanas como modelos de estudo do início da
ICX........................................................................................................................................26
II. 1. Introdução..................................................................................................27
II. 2. Material e Métodos....................................................................................31
II. 3. Resultados..................................................................................................49
II. 4. Discussão...................................................................................................64
Capítulo III. Manutenção da ICX em células humanas: função de DNMT1, XIST e
SMCHD1...............................................................................................................................75
III. 1. Introdução................................................................................................76
III. 2. Material e Métodos..................................................................................84
III. 3. Resultados................................................................................................98
III. 4. Discussão................................................................................................112
Capítulo IV. Conclusões Gerais..........................................................................................124
Resumo................................................................................................................................127
Abstract...............................................................................................................................129
Referências Bibliográficas..................................................................................................131
ANEXOS.............................................................................................................................145
Anexo 1...............................................................................................................................146
Anexo 2...............................................................................................................................147
Anexo 3...............................................................................................................................148
Anexo 4...............................................................................................................................159
Anexo 5...............................................................................................................................175
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Hipótese de um possível mecanismo evolutivo para compensação de dose em
mamíferos................................................................................................................................5
Figura 2. O RNA de Xist recobre o Xi..................................................................................13
Figura 3. Esquema representativo do centro de inativação do cromossomo X (Xic)
murino...................................................................................................................................16
Figura 4. Modelo de evolução da ICX em mamíferos..........................................................23
Figura 5. Diagrama esquemático do gene Xist e de regiões vizinhas...................................30
Figura 6. Células HUES não expressam XIST após diferenciação.......................................50
Figura 7. Estabelecimento de linhagens de hESC, utilizando feeder humano......................51
Figura 8. Estabelecimento da linhagem de hESC BR-1.......................................................53
Figura 9. Aspectos morfológicos das células BR-1..............................................................53
Figura 10. Células BR-1 expressam marcadores de pluripotência.......................................54
Figura 11. Estabilidade genômica da linhagem de hESC BR-1 após seis meses em
cultura....................................................................................................................................55
Figura 12. Diferenciação espontânea in vitro de células BR-1 produz células diferenciadas,
derivadas dos três folhetos embrionários..............................................................................56
Figura 13. Células BR-1 formam teratomas quando injetadas em camundongos................57
Figura 14. Expressão de XIST em linhagens de hESCs por RT-PCR em tempo real ..........60
Figura 15. Células BR-5 expressam marcador característico do Xi.....................................61
Figura 16. Expressão alelo-específica de genes “imprintados” em células BR-5.................63
Figura 17. Quadro comparativo mostrando as principais características de células-tronco
pluripotentes..........................................................................................................................73
I
Figura 18. Expressão de DNMT1 em fibroblastos GM135-Tel transduzidos com vetores
para silenciamento deste gene.............................................................................................100
Figura 19. Taxa de crescimento de fibroblastos transduzidos com vetores para
silenciamento de DNMT1....................................................................................................102
Figura 20. Nível de metilação global em fibroblastos GM135-Tel transduzidos com vetores
para produção de shRNAs contra DNMT1 e tratados com VPA........................................103
Figura 21. Expressão de MAOA e MAOB em fibroblastos GM135-Tel após silenciamento
de DNMT1, avaliada por RT-PCR......................................................................................104
Figura 22. Reativação do alelo submetido à ICX do gene MAOA após silenciamento de
DNMT1 e/ou tratamento com VPA.....................................................................................105
Figura 23. Expressão de shRNAs contra o gene XIST em células GM135-Tel, monitoradas
pela expressão de GFP (pGIPZ-XIST) e RFP (pTRIPZ-XIST).........................................107
Figura 24. Comparação dos valores de CTs médios para quatro genes normalizadores entre
as amostras de fibroblastos transduzidos com vetores para produção de shRNAs contra
XIST.....................................................................................................................................108
Figura 25. Expressão de XIST em fibroblastos GM135-Tel transduzidos com vetores para
silenciamento deste gene.....................................................................................................109
Figura 26. Taxa de crescimento de fibroblastos transduzidos com vetores para
silenciamento de XIST.........................................................................................................110
Figura 27. Expressão de SMCHD1 em fibroblastos GM135-Tel transduzidos com vetores
para silenciamento deste gene.............................................................................................111

II
LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição dos meios de cultura utilizados........................................................33
Tabela 2. Compatibilidade entre o perfil HLA de diferentes linhagens de hESCs com os
dados do REDOME...............................................................................................................58
Tabela 3. Ancestralidade genômica das células BR-1 e H1..................................................59
Tabela 4. Genotipagem de genes “imprintados” nas linhagens BR-1 e BR-5......................62
Tabela 5. Expressão de genes “imprintados” em hESCs......................................................63
Tabela 6. Genes avaliados e plasmídeos utilizados neste estudo..........................................87
Tabela 7. Expressão alelo-específica de genes ligados ao X em fibroblastos GM135-Tel
após silenciamento de DNMT1 e tratamento com VPA......................................................105
Tabela 8. Padrão de expressão de genes “imprintados” em células GM135-Tel após
silenciamento de DNMT1 e/ou tratamento com VPA.........................................................106
Tabela 9. Expressão alelo-específica de genes ligados ao X em fibroblastos GM135-Tel
após silenciamento de XIST................................................................................................110

III