Ingeniería Genética: Preparación, análisis, manipulación y clonaje de DNA

508 Pages·2002·63.007 MB·Spanish

by  Julián Perera González, Antonio Tormo Garrido, José Luis García López

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Células
Células transformadas no transformadas
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Células transformadas Células transformadas
por recombinante 1ApF, Tcs¡ por vector (Ap*, T"*)
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INGENIERíA GENÉTICA #r;m'
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Preparación, análisis, manipulación
y clonaje de DNA
Julián Perera
Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, I,
de Ia Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense
Antonio Tormo
Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, l,
de la Facultad de Ciencias Biológicas de Ia Universidad Complutense
José Luis García
Profesor de lnvestigación del Centro de lnvestigaciones Biológicas
del Consejo Superior de lnvestigaciones Científicas
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EDITORIAL
SINTTSIS
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@ Julián Perera
Antonio Tormtr
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F
lngeniería Genética:
una panorámica general
l,r !tr,tir.ttrt,t'rrr (;L't¿ética es un conjunto de métc¡dos, tecnícas yprocedimientos destinarJo al
, t! !, t u ttt,t tt(,, < t t tt tt.lariza,ción, modificación invitro, clonaje y expresión rle m,oléculas de áci-
,t,.. tu(r /r,rr os, 1¡¡'i11¡lpalmente DNA. Esta primera visión de la Ingeniería Genética como una
. , ,lr , , r,r | ( l(. r'(.( (,t1rs ptrede resultar un tanto desmitificadora, aunque se corrige inmediatamen-
r. rl rr r,,r r( )( (,t sr¡scliversaseimportantesaplicaciones, que sonlabasedelextraordinariodesa-
r ¡, ,ll, , r 'r ¡ rr.r'irr x,nlado por la ciencia básica y por sus tecnologías anejas (biotecnologías).
I L,lt¡r,tiro.f inalcle la Ingeniería Genética es el análisis, la modificación y IauttlizaciÓn
.t, I t ttrf rtt tttrtc'ión genética. El comportamiento de los diferenfes sistemzts biológicos es eI
,, rrlr,r,l,, tlt' un.rs actividades que llevan codiJ'icaclas en su material genético. La Ingenie-
, r r , ,, ¡( lr( ;r ¡rc¡lnite descifrar estas instrucciones y utilizarlas, en su estado original o modi-
Ir, r,lr'. l,trtrcconclwcirlauid,adelacélulabaciaobjetiuosprogramados,Eltérminoinge-
,,¡, r i, r r, llt'irr la capacidad de cliseño aponada a ese objetivo.
I I ,r )l x )r.t('ltiológico universal de la información genética son las moléculas de ácidos nuclei-
, ,,,. r / r,\' I y tlNA), que contienen, conservan, transportan y ofrecen esta información para su
,f lilr r, r,n t.n la célula; por ello, el rnateria,l de trabajode la Ingeniería Genética es los ácidos
r rr r, l, rr r ,:,. l,lste trabajo se desarrolla en dos escenarios: el tubo de ensayo (trabajos in uitro) y
! r , , 11¡1.¡ (t,xlterimentos in uiuo). El entorno natural de estas moléculas es un sistema biológi-
.,. r,, lr¡1.rs o paftículasvirales), y alllhay que buscadas. Unavez conseguidas enestado puro,
¡,rrr r lr ¡¡ st'r'rnanipuladas in uitroen distinto grado mediante el empleo de actividades enzi-
,!r rr, r', r lt' l¡rdfl especificidad, 1o que permite el análisis de sus productos, la deducción de
. t rr, , , .irirrilicativos a partir sus resultados y la construcción previo diseño de moléculas de
.
rrl, rur.r t ornpleja para su ultericlr tttilización. Pero, para esto último, es generalmente nece-
,, r, , r¡ ( olocrar al ácido nucleico manipulado en un contexto celular, en el que se le pueda ver
,, r, I r (r.\l)resar su información); es la fase de experimentación in uiuo, enormemente rica en
r, rrlr rr l, rs y aplicaciones (nuevos productos, nuevos fenotipos) (figura 1.1).
I r lrrr:t'nicría Genética es un amplio recetario que incorpora procedimientos muy diver-
.. \ r( ) sicrnpre conectados. Puede concebirse como un archivo de distintos documentos
, r , r.r( lr r lfs gq¡s¡¿¡te actualización: ciertas recetas son ya clásicas yhanalcanzado un nivel
, t. , rlrr l,rrl rlifícil de mejorar; otras son superadas por nuevas versiones o nuevos métodos
. r, ,rlt,ur clesplazadas o sustituidas por éstos. Sin embargo, no existe ningún orden prees-
r rt ,1, , rt lt ) l)iira su aplicación; cada receta seráutllizada o no, y en un orden pafiicular, depen-
. lr, r r, l, ¡ r lcl experimento y de la propia decisión del experimentador.
¡)¡¡¡ttlttht I liltl ltti¡ttttl (it)lt(1lk:¡l tlll¡l P¡u,()ltllllt(:tt tlttltttt:tl lll
l'tt¡t t,tlituit,ttlo: tlt,fttr,ft¡¡1ut itttt.¡'( (ilIt( l('t'¡::,(t( it¡tt tlt'ttt itltt.s ttltt lt'tt rr.s, rlt',';litl,trl, r:;.tl
i, vivo i1 tNGENtEnln ceruETtcA tr',l,tttrit'rllo ), :tl :tlt:tti:;i'; t sl ltlt lrll:tl ,1,' lltolt't ttl:ts tlt l )NA o l{NA'
i in vttro llt,lt¡tft¡.s tlt, nt¿util¡ttlttt-it¡n in villo ¡/r, rtt itltx ttttLlt'ittt.s. t¡rlt' lrrtst:tlt llt Itlotlifit;tr'iott
rlr.ll):t lrrr¡lt'tt¡l:t, su:utt¡rlilitlrci<>l¡ ill t'iln¡t> l:t ct¡ttsll'tt<tir-rll <lt'tllolt'ttll:ts lt't,¡llllri
#{ 'J- ll.iltl(:i.
? euccaélruiólatiscas AISLAMIENTO nuáccleidícoo {I ll-' It,t nit ¿ts rlt,tlott.ttit'(k,t)NA, crryt> olrjctivo cs c'l ltisl:ttttit't-lto clc tttl cottitttlto tlt't t'ltr
tejido l.r, ¡rolllttlollts tkr utl clclctlllitlltcl<t f't'agtllcll-tto clc I)NA cxogctlo.
l'tttt ttlit¡iL,ntt¡s tlt'cxl)rcsión ole un I)NA t:xri,qerut ert célula,s btx¡tetlutkru.s, tliligitlos
O
,r l;r pr-orlLrt'r'ion clc ltr pr<>tcína cocliflcacla cn él o a ln constrtlcc'itirr clc: c:Óltll:rs tl ()l1lll
-*)
bacterias r r isr r ros <r rn lrc'tiviclaclcs ur-tevas.
cultivo
¿/\_lr\l t\\ ----------:r VtrUS l-1. Aislamiento y caracterización de ácidos nuc¡e¡cos
cultivo
Lt ¡:; ti.t:ir.los nucleicos son biomoléculas presentes en el interior che las células (nút'lt'o,
,,rti.rr¡¡lrrs 9 citoplasma), donde desempeñan sus diferentes funciones. La preparackitttlt'
lrl...t i\ rr ltNA implica su extracción^paftir de la fuente bioiógica donde están localizrrclos,
rr,.r li;¡rl(: cl uso de dif'erentes técnicas y procedimientos (capítulo 2) que, en esencia, lle t'
,rllr r(,n lrL rotura cle la compafiimentalización celular y la separación de la molécula l;ltst'lt-
,l.r ,r ¡rrltir cle la mezcla que resulta. E1 camino es más o menos complejo dependienclo clt'l
Ir¡ ,o t lc rnaterial de partida (bacteria, cé1ula vegetal, célula animal) y del compuest() qtlc s('
l,r:;t :r (l)NA cromosómico, DNA plasmídico, RNA mensajero, etc.). Ciertos ácidos nr-lc'lt'i-
, r ,:. sc clrClre ntran empaquetaclos en pcu'tícul6,s uirales; en ese estado son inactivos y sírlr I
rrr;lrif iestan sus capacidades cuando alcanzan(.infección) el interior de una célula sensil>lc.
l,:,tr ¡s áciclos nucleicos pueden extraerse de las partículas virales por una vía sencilla; cr-r
, x irsi()nes también pueden recuperarse de la célula infectada'
'li-as el aislamiento y purificación del ácido nucleico, ia siguiente etapa suele consistir
,'¡ l'¡ carrlcterización c1e su molécula mediante el empleo de diversas técnicas (capítulos 3
r' .i ). Este análisis puede alcanzar diferentes niveles de profundidad: detección, análisis clc'
MJ l)uleza, valoración cuantitativa y determinación de parámetros estructurales.
l.os procedimientos actuales permiten enfrentarse al aislamiento de cualquier tipo clc
.rt icio nucleico. Su caracteizaciónestftrctural es, en principio, totalmente asequible; la limi-
trrción más seria es la planteada por el tamaño de la molécu1a que, en ocasiones, es en( )r-
rnc y obliga a su fraÉlmentación, específica o no específica, con objeto de faciiitar su mane-
jo y análisis (manipulación).
1,2. Los ácidos nucle¡cos como soporte de la informac¡ón genét¡ca
rrtlt I I Panorámicageneral delalngenieríaGenétrca:sustratos,procedimientosylirr)rlr I Los ácidos nucleicos son macromoléculas con contenido informativo, formadas por lrt
rr r,,l clisposición polimérica de cuatro <liferentes rnonómerc¡s (dAMP, dGMP, dTMP y dCMP, crr
el DNA; y AMP, GMq UMP y CMP, en el RNA), unidos covalentemente a través de enlaccs
t,r':t (lesupresentaciónyestudio,todosestospl.,cecrimientosscvi,¡.r riiéster.fosforico o puentes fosfocliéster, dando lugar a cadenas con polaridad (extremo 5 'y
,rjirrr).¡r (,'
)(ltr('.s, en ftrnción del objetivo pafiicular q.r. perrigu.n (figura l. I ): eExsttare fmacoe t3a, )d ey lcao mn oulné courldae dne o á sceidcou ennucciolet. icdoe n(cuocnleoóctididao sc oom boa sneisv enli terosgtreuncatudraa.ls perismpeacríiofit)'o I.:r
Itttyniltn ltt ( ¡tt t.rlilxt Vt ilt ttt tt tt t I
c'lt1l:ttilltl)1ll'11 (()llt('tt('¡'itlli¡r'llllt<ii)ny('sllt lrlrst'l):rr:r su.r(lu;t(¡()n(()ltoso¡ror.lt'tlt, l:r l¡tli
tnltci(-)n (lcné1ica.
En sucesivos niveles estnlctltrales (sccunclario, (clt ilrlio, t tr;rlt,r'nr¡r-ir¡), l:r rrr<>li.t.L¡l¡t t
ácido nucleico adopta cliferentes organizacioncs:
- Monocatenaia o de hebra sencilla (ss, single strand'), o bicatenaria o cle cloltlc lrt,lr
(ds, d.oble strand,), con estructura secundaria en doble bétice.
*
Lineal, con exlremos 5'y 3', o circular, sin extremos; las moléculas circulares bicatclrlrrh
pueden formar círculos covalentemente cerrados en los que las dos hel¡ras están qt,r.li
das sobre sí mismas, o círculos abiertos, en los que sólo una hebra está cerracTamic:rrln
que la otra presenta extremos 5'y 3'. Las moléculas circulares covalentemente cerrrrl¡
pueden mantener un cierto superenrollamiento dando lugar a topologías característir,¡r
- Las moiéculas de ácidos nucleicos son polianiones cuyas cargas han cle estar c()¡tt.¡
rrestadas; in uiuo esto se consigue mayoritariamente por su interacción con proteírti
básicas (histonas, proteínas ribosomales, etc.); esta interacción provoca Ia orga¡i7i
ción del material nucleico en estructuras nucleoproteicas complejas (ribosoma, nuclcr
soma, cromatina, cromosoma, mRNPs o partículas ribonucleoproteicas, etc.).
En su situación nafiva, estas moiéculas siempre están asociadas a proteínas, en su may(
tía de naturalezabási,ca, formando complejos nucleoproteicos. En disc¡lución en estarl
puro, resultan estabilizadas por la presencia de cationes (Mg2*, Na*, Kn, etc. ) que neutlrl
zanlas muchas cargas negativas aportadas por los restos de fosfato de la cadena.
La mayot parte del DNA se encuentra en forma de DNA cromosómico, asociado a p¡r
teínas y dando lugar a los cromosomas; las bacterias contienen normalmente un único cr<
mosoma, mientras que las células eucariotas tienen varios y encerrados en el núcleo. Lir
mitocondrias presentes en el citoplasma de Ia célula eucariota (y los cloroplastos de ias có¡
las vegetales) poseen su propio DNA. Además, algunas células (bacterias y levaduras) tarr
bién contienen DNA adicional, generalmente estructurado en forma circular; son molér.¡
las de funcicrnamiento autónomo conocidas como plásmid.osy enormemente útiles co¡rr
uectores para el clonaje de DNA. Una gran variedad de virus contiene genomas formac¡¡
por moléculas de DNA, mono o bicatenarias.
El RNA celular se agrupa en tres clases principales de moléculas: el ribosómico (rRNA,
pafie integrante clel ribosoma; e\ RNA c|,e transferencla (tRNA), encargado de activar y trans
portar lcrs amin<l¿icicl<>s ¿tl tnoment() cle ia síntesis proteica; y el mensajero (pRNA), sintcti
zatlo a partir cle la scct-tcnciu clc un gen enla lranscripcióny portador de la información
:r
ribosoma para c'onclttc'ir- ll síntesis clc una proteína. Las moléculas de RNA están complles
tas por una únic;t cltclctlt r.rr¡c'lcotíclica, aunqlle suelen tener una gran densidad de estl¡t.
tura en doble hélice intraclttcnaria. 'Iambién existen vinrs con genomas formados por molti
culas de RNA.
1.3. Manipulación in vitro de ácidos nucte¡cos
En este segundo conjunto de métodos se agrupan aquellos que permiten un trabajo ir
uitro, en medios definidos y en condiciones controladas, sobre una molécul a pura de áci
r (:,tl)tltth) I ltuyttttttttit (;.,ttitll('¡l llll,l l,tlttt)ttitltil:,t r¡rtttt'r'tl ,,' I
l" rrrr( l( r(() l)l( \'l.llll( lllt :tisl:ttl:t (t;r¡rtltllr)s') il ()) lil ol rltlivotlt t'sl:ts l('(('l:l t'sl:t ttttlttt
i,itlttt rt)tt lttt¡.t!tltttttttltl,lt.l llNA,rrlt'l liNA;1r:r¡t t'llost'tlliliz:ttl, tllsi t'rtlttsivillll('lll(', (lili'
r, rrlr.. ¿/r tu,ttltttlt,.¡ (,tt;,int(ll¡(r/.s, (,n.q('n('rrl (l('gr':ltt t's¡tecif it'icllrtl, y cti sit llllly()ríll clis¡lorli
l,l,,, orrrt.tt i:tllttt'ltlt'.
Lt tttrrttiltrrlttt itjn in t)ilr()dc ácicl<is nLrclcic()s pcrsiglle cliversos ob,etivos. llno es el
liul.¡rl(,¡t('(ttt(tlt!¡('().l.trutiliz:rc'iór:|tleen(k)nucleasasclerestricciólTpermitelafragmenta-
, r,,r¡ t lt. rr¡ l)NA l)()l siti()s csl)ccíf:ic()s (capítr-rlo 5), y el análisis de los fragmentos prodllci-
,l, , , t t tt ¡tt lisis da rcstricckirz) (capítr-rkr 6) es la base para avanzar en ia caractetizaci1n de la
rr,,lr'r rrl:r (c't¡¡.slrttcc.ítitt de mapas cle restricción)y paralarealtzaciÓn de diferentes pruebas
rr¡ r(.ri( rrs rlc intcrós ltásico y aplicaclo (kFLPs, cliag,nóstico genético, buellas genéticas, etc').
I r , 1, rrr.q,rrcííxt cnzintíttica cle un fiagmento cebador en presencia de análogos de nucleóti-
,1, ,:, t,s t,l firnclzrrncnto cIe\t'ts procedimientos d.e determinación cJe secuencia (capítulo 15),
, ¡\ ( ) (.()lr()cil¡icnt() es el primer paso para la identificación de genes y de regiones regula-
, l, ,r , rs rlc la cxpresión.
I rrr sc¡{unclo objetivo esla moclificaciónpuntual <le la molécula, bien en posiciones inter-
n.t:; ( trrutagé¡¿esls') (capítulos 7, 8 y 16), bien en sus extremos con el fin de permitir sv unión
, rrziil rírrica a otra (unión por DNA-tigasa) (capitvlo 9). La modificación de una región codi-
I r, . rt ¡ ¡r.a permite alterar cle forma programada la información genética contenida y la crea-
, r )rl (lcr nuevos procluctos proteicos (ingeniería de proteínas) (capítuio 2 del volumen II).
t,l rt,tgque de extremos amplíala base parala construcción de estn¡cturas mixtas, requisito
I)r(.vi() para el clonaje de DNA. Esto ha forzado la búsqueda de actividades enzimáticas con
1,, .' , ¡,,.rrp"rar los obstáculos en la unión cle fragment os (.síntesis cJe DNA recoTnbinante).
¡n tercer objetivo, de repercusiones extraordinarias, es la amplificación in uitro de
.,t.t trencias mecliante Ia reacción en cadenct. cle la polimerasa, PCR(capítulo fl). Esta técni-
, rr lra revolucionado eI área de la investigación genética y, allnque con algunas limitacio-
¡('s, se presenta como la alternativa in uitro a la metodologia in uiuo del clonaje.
Los tres tipos de objetivos son perf'ectamente factibles con 1as herramientas enzimáticas
,rr.tr¡almente disponibles. Existe un gran niimero de diferentes actividades que posibilitan
r:r¡to la rotura por puntos específicos, como la modificación de posiciones concretas de la
rrr<rlécula. Constantemente se producen incorporaciones alalarga lista de enzimas qLie a)'u-
,lrrn a ampliar las capaciclades existentes (nucleasas que cortan por sitios muy poco fre-
(.Uentes, polimerasas resistentes a la temperatura, etc.). El estallido que supllso la aparicrón
,lc 1a pCR sigue siendo justificado por la clescripción de nuevas y mejores aplicaciones de
l:r técnica (pCR cuantitativa'). Lautilización del análisis de restricción y de la PCR ha amplia-
t¡¡ extraordinariamente el campo de acción del análisis de DNA, que se ha impuesto como
tócnica esencial paralainvestigación genética (estuclio de poblaciones, análisis de caracte-
r.es cuantitativos, etc.), para el diagnóstico c1e enf'ermedades hereditarias (diaÉlnóstico pre-
('()z) y paral^ identificación de individuos (meclicina forense).
Los procedimientos cle analisis de lq secuencia de nucleótidos de un DNA hao avaoza-
clo cle manera sobresaliente; la potencia de las técnicas actuales y el apoyo que suministran
l6s programas y el equipo informático para el mancjo de los resultaclos hacen viable cual-
,¡.,i.. pi,ry.cto analítico cle grandes regiones e, incluso, de genomas completos (genómi-
.:a). Aigunos ejernplos actuales son: entre los pequeños genomas de bacterias, los de Hae-
mopbilus influenzae, Escbericbia coli o Helicobacter pylori; entre los de levaduras, los de
Saccharom.yces cereuisicte o Scbizosaccbaromyces pombe;entre los genomas de ellcariotas
Itn¡tvtlttt ttt ( ltt¡¡¡tl¡¡'¡¡ V¡iltt¡utut I
sr¡lx'r'i()r'r',s, lt,>s <lt' (,'ttt'nt)rb(.rl)(lil¡.\ c/t,,qrit.s, ;lftltitltl*i:, lltr¡l¡,¡¡,,,, l)t.tt.sttf lrilrr tttt,lttttrt,t!rls
Iet", Mtts LtLt.tsct.tIt.tsy f I(lnt() sdll¡(ns.
1.4. Las enz¡mas como herramientas para el traba¡o
con ác¡dos nucle¡cos
Las enzimas son herramientas moleculares insustituibles en el trabajo con ácidos nuclcl.
cos. Generalmente presentan actividades bastante estables, funcionan en reacciones sengi-
llas, pueden ser fácilmente inactivadas (por d,esnaturalización por calor, eliminación clc
cofactores, etc.) y retiradas del medio (extracción con fenol), lo que las hace muy cómocllrs
para el trabalc> in uitro. Sin embargo, su Éaran apoftación es que p..r..rtn.r una alta especi-
ficidad, clave para poder trabaiar sobre un diseño previo cleiexperimento.
Sin duda, las enzimas más importantes son las endonucleasai cle restricción, detectaclas
en los sistemas de restricción-modificación bacterianos y pro<lucidas por aislamiento de s¡
fuente original o por expresión cle sus genes clonados. elgunas de estas enzimas son capa-
ces de cofiar una molécula de DNA de doble hebra por sitios perfectamente definidos (áia-
nas o sitios cJe restricción); esto es la base para sll utilización como herramientas analíticas
(-analizando el resultado de la rotura pueden deducirse clatos acerca cle la posición de s¡s
dianas específicas) y como elementos cle producción de fragmentos específicos de DNA
para su clonaje.
Además de las enzima.s de restricción, existen rnuchas otras actividades, en su mayoría
comerciales, de uso cotidiano en un laboratorio cle Ingeniería Genética. Su demanda es dc
tal orden qlle estas actividades se han converticlo en objetivo importante de producción y
venta cle muchas empresas especializadas en proc|-rctos de uso én laboratorits de investi-
gaciírn. Su participación en procedimientos usuales cle Ingeniería Genética hallevacjo altt
c<r¡rrcrcializ¿rción de kits capaces de llevar a cab<'¡ clistintas etapas preparativas, analíticas g
clc nraniptrla ción in uitro de ácidos nucleícos.
1.5. Clonaje de DNA en s¡stemas celulares
lin cstt't'11[gr':rfi'sc' iltt'lttyc'n :t<ltrcllzrs lccctas que permiten transferiruna molécula de
DNA rrl irrtcliol rlt' urrrr t'('lulrr ( or,qrutismrt bospetlador) y conseguir su mantenimiento en
eila y cll st¡s tlt'sc'c'trtlit'ttlt's (t:r¡ríttrlos l0l l6). Este paso es, probáblemente, el máximo res-
ponsalllc clt' totlo t'l tlc's:trlrrllrt ¡.roslt'l'ior-clc la Ingeniería Genética: gracias a él se consiguen
aislar secttc'llc'i:ts c'ottctc'lrts rr ¡r:rrtil clc un material tan complejo y giande como un g"r-rl,..'u
complekr; Lrnll vcz ;tisl:ttl:r, t'srt scc ucnc'ilL poclrá ser amplificadta, aializadae, incluso-, expre-
sada.
Como elcucntos ct'tltlltlcs clc cstu t.ecnología aparecen el DNA recombinante que se
transfiere y la célula hos¡xrLuhtrci c¡rrc lo r-ccibe , 1o mantiene y colabora a su amplificación
(capítulo 10). El pritnero cs sintctizuclo utilizanclo métodos incluidos en el apartado ante-
rior; es el frtlto cle un trabajo clcsarxrll:rclo in uitroutilizando herramientas enzimáticas. El
organismo receptor por excelcnci¿r es la bacteria E. coli, que se emplea de forma general
en el trabajo sistemático de clonaje, aunque esta tecnología ie ha expandido a otros muchos
\
t),tl¡tltth¡ I lttulttltltttl¡t (;ttllitlt(:¡t ttl)tt l),ttttttiitttt!',t tlttl,t't,tl
¡1,¡,, ( ( lrrl.¡,.:, (¡lr:r., lr:lt lt ri,rs, lt.r':rrl¡t;r:;, t t lttl:ts ('tt( itti()l;t:j ( ll ( llll¡v(), lt'jitlos \r(,(l('l;ll(:',
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I rr r':,t:t l:r:;t ir¡ r,¡t,().1') ¡rosilriliclrr<l (lu('li('rt('(fl il)vc'sti,qltclot-llltl-ll il-ltitlil'cll cl ('xl)('ri
rr¡ rt( ) ( :, rnry l¡nlilir(lir y Ir:r tk'(()nlilrr ('n ('l ('()n()(iltticltt() (lttct ptlc(I:t tencl'se cle la lli<ll<l
!,r r ,lr. l.r ,,,lul:r lros¡x'rl:rtlolrr, (lr.t(. lx)nllita llL anticipaci(tn cle rcst¡ltacl()s, y en e1 trabajo clc
,,,rr,,trrrt.t.it¡¡ in t,iln¡r¡trcltrrylr rculizecl()paralasíntesisclelrecombinante.Unavezenel
rrrt, ri()r tlt'l sistt'nrr lriologic'o,cl firtlrrriclelamoiécul:rclonadadependedesurelacióncon
I r rrr.r, ¡trirrrli:r rnolc'c'ulll clr. llr r'óhrla hospedadora y el éxito del experimento descansa en
, ¡rr,. l.rs st.c.¡r'¡c.ilrs clcl rcr'ol-ultinante sean aclecuaclamente reconociclas por los complejos
rrr,,lt.r'ul:rlc,s t'clr.llulcs. l)ar:i eso, se cLrenta con la participación de una de ias piezas incor-
| ,, ,r. r( l;rs t'n cl l)NA rcr(()lnl)inant e Gl DNA uector) en Ia que se colocan todas aquellas secuen-
, r.r:, ( l¡(., [ic¡ coclificanclo funciones, bien apofiando señales para las proteínas celulares,
,( ,¡ r1('(.('s1u'i1rs para que el recombinante completo pueda mantenerse y replicarse en 1as
,,.lul:rs clonclc cstá y puecla posteriofmente recupefarse arnplificado.
l,()s proceclimicntos para la transferencia de DNA son muy diversos y van desde la cap-
I r r r : r t lc prccipitados clel DNA con losfato cálcico, hasta el bombardeo de la céiula con micro-
rrr ry¡r.tiles cle metal con el DNA adsorbido en su superficie (.biolísticc,t). En muchos casos
(¡ .ri ¡c(.esarío continuar e1 trabajo sólo con las células que han captado el DNA extraño, lo
' IU(' sLr cr()nsillue utilizando marca'clores.fénotípicos cle selección'
lll clgnaje cle DNA es la base de la mayoría de las aplicaciones de la IngenieÁa Genétí-
, ;r. lln primef lugar, eS una forma de aislar genes o secuencias ptuas a pafiir de un Éaenoma
, r rnrpleto (la alternativa es la PCR); esto 1leva detrás todas las posibiliclades de análisis, mani-
lrrrlación y utilización de esa secuencia. Además, permite la conselwación de 1a secuencia
(.()tno parte inteÉarante clel clon dt¡rante tiempo indefinido y su recuperaciÓn en cantidades
,rr.rchó mayores que las iniciales (amplfficación).Finalmente, esta tecnología hace posible
¡r expresión de la información genética contenicla en 1a secuencia clonada; esto es de gran
i¡terés descle el punto cle vista productivo (síntesis de proteínas heterÓlogas en cultivos bac-
tcri¿rnos) y es el fundamento c1e la construcción dc organismos modificados genéticamen-
tc' (GMOs) u organismos transgéniccts.
1.6. Papeles de la célula en la lngen¡ería Genética.
Sistemas hospedadores
La Ingeniería Genética trabaja con moléculas de ácidos nucleicos, sobre todo con DNA,
y 1o hace en dos escenarios: el tubo de ensayo (trabajos in uitrc¡) y la céh-rla (experimen-
tos in uiuo'). El entorno natural del DNA es la céluia, y por tanto en ella hay que buscar-
lo (aislamiento) y en ella hay que verlo actuar (clonaje). Así la célula aparece como fuen-
te natural de gran parte de los ácidos nucleicos y c()mo escenario en donde desempeñarán
su papel.
- La m¡ryoría de los proceclimientos de análisis y manipulación se clesartolla in uitrc¡.
sobre moléculas cle DNA puras que, previamente, han tenido que ser aisiadas a par-
tir un conjunto de células (cultivo, tejido, organismo completo). La célula es el
c1e
material. cle particla para los procedimientos preparativos.
lntl.utk,t ln (itttt¡tlhtt Vttlttt¡¡tttt I
f )r¡l ,r rrr llrtl,, lrr tc'lrrllr cs t'r "/ttrx¡nttr¡./," tr,.trr.:;t. ilr.v:'l ir (.;rrx) rlr.lrrr J'r11t.rrt,r,.,
crx¡lctitttcttt<ls c'cntl-:tlcs clc ltrgcrricli:r (;('na'li(:r. lis rrliliz:r<l;r t.orrro ,,áo.yrt ,rlrttl,t.tl'
recilrir trn DNA ex<igeno, lrl¿tlltctncl-l()) colalrollu':r su lrrn¡>lilic.:rr.i<in y, crr :rlgu¡¡s t.a1s>.^sra,
permitir su expresión.
- Además, la intensa actividad metabólica qlle tiene lugar en la céh-rla es aprgvechaclir
Epas ruan d siroigfiisrt ilcaa pdroo d"buicoc.iróyne adceto cf'o mdopnudees topsu eddee na ltoor ivgainloa"rr s(ep rportoedínuacsto, sa nctoibdióifitcicaocslo, se tcp:r. l)r,
(nuevos) DNAs introduciclos.
- Finalmente, la célula puede ser el producr.o del proceso de manipulación, incl'so c.'
valor comercial. La expresión del DNA clonacio puede conclucir ila apanción cle nuc-
uosfenotipos, nuevas estirpes con nuevas aupn.idnd., que la conviefien enun ,tgerb
te bíológico capaz de realizar trabajos pafiiculares (descontaminación, fijaciónde nitr(>
geno, etc.).
De todo lo dicho se deduce la importanc ia de la célula como escenario biológico en el
que se desenr'-r-relve gran pafie cle los procesos que la Ingeniería Genética estudia, estimu-
elasyte uetsilcizean'a Lriao mneattoudraoll;o gesíata deetal pcalo ndaeje t rianlc>laujyoe i nr eucieutoaess puanraa lofagsrea relsae rneciinasl epraciróan c ldeeslc DubNriAr ya
poner en práctica todo el enorme potencial de la Ingeniería Genética.
La Ingeniería Genética emplea un rango muy amplio de sistemas biológicos: microor-
ganismos, virus y fagos, líneas celuiares de insectos, plantas o mamíferos, orlanismos mul-
ticelulares (plantas' animales). con una dificultad muy clesigua r,la mayoriade los tipos celu-
lares puede actLlar como receptores de DNA, aunque algunos se utilizan más fiecuentemente
que otros' Hoy por hoy, los caballos debatarla son la bacteria E. coli,lalevadura s. cereui-
siaey varías líneas celulares de animales.
/.6.7. Escherichia coli y otros hospedadores procar¡otas
E' coli es uno de los organismos mejor conociclos de la biosfera y fue el primer hospeda-
dor utilizado en experimentos de clonaje de DNA. Esta bacteria Gram-negativa tiene forma
de bacilo; su citoplasma está rodeaclo por una enl.uelta compuesta por una membrana plas-
mática y por una membrana externa, entre las que se encuentra el espacio periplásmico que
contiene la pared celular de pepticloglicanos. Su cromosoma es una molécula de clsDNA con
unas4'64 Mb (exactamente,4.639.22r pb);muchas cepas de E. coricontienen, además ,varias
copias de uno o varios plásmiclos, moléculas circulares cle dsDNA de replicación autónoma.
Se encuentra en el intestino humano y no es patógeno. En el taboütorio puede ..;;,
sobre un medio de cultivo muy simpre (iales, elemeito, traza y una fuente de carbono),
aunque en un medio rico, con vitaminas y aminoácldos (como el medio LB), crece mejor. pue-
de crecer en presencia (aerobiosis) o ausencia (anaerobiosis) de oxígeno. su tiempo de gene-
ración en condiciones óptimas (meclio LB, a 37 oc, con oxígeno) esáhededor de 20 minutos.
En ei laboratorio suele crecerse en tubos o matraces, sobre medio rico, a temperatura con-
trolada y con una agitación adecuada para lograr una buena aireaciln(en baño cle agua o
arcón termostatizado). Para su utilización a nivel indust¡ial, se utilizan fermentador.í qrr.
controlan todos los parámetros.