In vitro Studien zum Einfluss von Extrakten aus Kaffee, Artischocke, Ingwer, Erdbeerbaum und Tee ...

231 Pages·2017·7.4 MB·German

by  Teresa Röhrig

In vitro Studien zum Einfluss von Extrakten aus
Kaffee, Artischocke, Ingwer, Erdbeerbaum und
Tee auf die Phosphodiesterase-Aktivität

Vom Fachbereich Chemie der Technischen Universität Kaiserslautern
zur Verleihung des akademischen Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“
genehmigte Dissertation

D386

Vorgelegt von Teresa Röhrig

Betreuung: Prof. Dr. Elke Richling

Datum der wissenschaftlichen Aussprache: 20.01.2017

Diese Arbeit entstand im Zeitraum von April 2012 bis August 2016 im Arbeitskreis von Prof.
Dr. Elke Richling an der TU Kaiserslautern

Datum der wissenschaftlichen Aussprache: 20.01.2017

Prüfungskommission
Vorsitz: Prof. Dr. Markus Gerhards
1. Berichterstatter: Prof. Dr. Elke Richling
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Melanie Esselen

Ich danke Frau Prof. Dr. Richling und Frau Prof. Dr. Esselen für die Anregungen und
wohlwollende Unterstützung während der Promotionszeit.

Für meine Familie

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis......................................................................................................... VI
Kurzzusammenfassung ...................................................................................................... VIII
Abstract ................................................................................................................................ IX
1 Einleitung ....................................................................................................................... 1
2 Stand der Wissenschaft.................................................................................................. 3
2.1 Zyklische Nukleotide, Phosphodiesterase und relevante physiologische Prozesse . 3
2.1.1 Nukleotid-vermittelte Signalkaskaden ............................................................... 4
2.1.2 Phosphodiesterasen ........................................................................................ 7
2.1.3 Phosphodiesterase Familie 4 ..........................................................................11
2.1.4 Zyklische Nukleotide und Thrombozytenaktivierung ........................................12
2.1.5 Zyklische Nukleotide und Gefäßerweiterung ...................................................17
2.1.6 Zyklische Nukleotide und Inflammation ...........................................................18
2.2 Kaffee – Coffea arabica ..........................................................................................20
2.2.1 Allgemein ........................................................................................................20
2.2.2 Gewinnung des Rohkaffees und Röstung .......................................................20
2.2.3 Übersicht der Inhaltsstoffe von Kaffee .............................................................21
2.2.4 Studien zum Kaffeekonsum und Erkrankungen ...............................................23
2.2.5 Interventionsstudien zur PDE-Hemmung durch Kaffee ....................................24
2.2.6 Koffein .............................................................................................................27
2.2.7 Chlorogensäuren .............................................................................................32
2.2.8 Alkylpyrazine ...................................................................................................35
2.2.9 Melanoidine .....................................................................................................39
2.3 Artischocke – Cynara scolymus..............................................................................46
2.3.1 Allgemein ........................................................................................................46
2.3.2 Chlorogensäuren .............................................................................................47
2.3.3 Flavonoide ......................................................................................................47
2.3.4 Weitere sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe.........................................................51
2.4 Ingwer – Zingiber officinale .....................................................................................53
II

2.4.1 Allgemein ........................................................................................................53
2.4.2 Monoterpene und Sesquiterpene ....................................................................54
2.4.3 Gingerole ........................................................................................................56
2.4.4 Weitere sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe.........................................................60
2.5 Erdbeerbaum – Arbutus unedo ..............................................................................61
2.5.1 Allgemein ........................................................................................................61
2.5.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe .....................................................................61
2.5.3 Physiologische Wirkungen ..............................................................................64
2.6 Tee – Camellia sinensis .........................................................................................65
2.6.1 Allgemein ........................................................................................................65
2.6.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe .....................................................................65
2.6.3 Physiologische Wirkungen ..............................................................................66
2.7 Kinetik der Enzymhemmung ...................................................................................68
2.7.1 Grundlegende Enzymkinetik............................................................................68
2.7.2 Kompetitive Hemmung ....................................................................................69
2.7.3 Unkompetitive Hemmung ................................................................................70
2.7.4 Nicht-kompetitive Hemmung ...........................................................................71
3 Problemstellung ............................................................................................................73
4 Material und Methoden ..................................................................................................75
4.1 Material ..................................................................................................................75
4.1.1 Verbrauchsmaterial .........................................................................................75
4.1.2 Geräte .............................................................................................................75
4.1.3 Chemikalien ....................................................................................................76
4.2 Allgemeine Zellkultur ..............................................................................................78
4.2.1 LXFL529L Zelllinie ..........................................................................................78
4.2.2 Phosphodiesterase-Ausstattung von LXFL 529L und LXFL 529 ......................78
4.2.3 Mediumwechsel ..............................................................................................78
4.2.4 Subkultivieren - Passagieren ...........................................................................79
4.2.5 Kryokonservierung ..........................................................................................79
4.2.6 Zellzahlbestimmung und Viabilitätstest ............................................................79
III

4.2.7 Test auf Mycoplasmenkontamination ..............................................................80
4.2.8 Verwendete Lösungen ....................................................................................81
4.3 cAMP-Phosphodiesterase Aktivitäts-Assay ............................................................82
4.3.1 Isolation der Phosphodiesterasen ...................................................................82
4.3.2 cAMP-Phosphodiesterase-Aktivitäts-Assay .....................................................82
4.3.3 Proteinbestimmung nach Bradford ..................................................................83
4.3.4 Verwendete Lösungen ....................................................................................83
4.4 Aufarbeitung und Charakterisierung der Kaffees ....................................................86
4.4.1 Extraktherstellung K2, K4 ................................................................................86
4.4.2 Extraktherstellung K1, K3 ................................................................................86
4.4.3 Extraktherstellung Roh- und Röstkaffee ..........................................................86
4.4.4 Extraktherstellung entkoffeinierter, rekoffeinierter Kaffee ................................87
4.4.5 Grobfraktionierung K2 .....................................................................................87
4.4.6 Fraktionierung der löslichen Kaffeefraktion ......................................................87
4.4.7 Subfraktionierung der Fraktion F8 ...................................................................88
4.4.8 Hydrolyse der Fraktion F8 ...............................................................................88
4.4.9 Ultrafiltration der Fraktion F8 ...........................................................................88
4.4.10 Darstellung N-Caffeoyltryptophan und N-p-Cumaroyltryptophan .....................88
4.4.11 Charakterisierung der Kaffeeextrakte und Fraktionen mittels HPLC-DAD .......91
4.4.12 Strukturaufklärung der Fraktionen F7 und F8 mit HPLC-ESI-MS/MS ..............92
4.5 Aufarbeitung und Charakterisierung der Artischocke ..............................................94
4.5.1 Extraktherstellung aus Artischockenblättern (ALE) ..........................................94
4.5.2 Strukturaufklärung des Artischockenextraktes mittels HPLC-ESI-MS/MS........94
4.5.3 Charakterisierung des Artischockenextraktes mittels HPLC-DAD....................94
4.6 Aufarbeitung und Charakterisierung des Ingwers ...................................................96
4.6.1 Kommerzieller Extrakt (GRE) ..........................................................................96
4.6.2 Extraktherstellung aus Ingwerpulver (GPE) .....................................................96
4.6.3 Fraktionierung des Ingwerpulverextraktes (GPE) ............................................96
4.6.4 Strukturaufklärung der Ingwerextrakte mittels HPLC-ESI-MS ..........................96
4.6.5 Charakterisierung der Ingwerextrakte mittels HPLC-DAD ...............................97
IV

4.7 Aufarbeitung und Charakterisierung der Erdbeerbaumfrüchte ................................99
4.7.1 Extraktherstellung aus Erdbeerbaumfrüchten (SFE) .......................................99
4.7.2 Strukturaufkärung des Erdbeerbaumextraktes mittels HPLC-ESI-MS/MS .......99
4.7.3 Charakterisierung des Erdbeerbaumextraktes mittels HPLC-DAD ................ 100
4.8 Aufarbeitung und Charakterisierung des Grüntees ............................................... 102
4.8.1 Extraktherstellung aus Grünteeblättern (TXE) ............................................... 102
4.8.2 Strukturaufklärung des Grünteeextraktes mittels HPLC-ESI-MS/MS ............. 102
4.8.3 Charakterisierung des Grünteeextraktes mittels HPLC-UV/Vis ...................... 103
4.9 Deskriptive Statistik und Berechnungen ............................................................... 104
4.9.1 Untersuchung der Varianzen ......................................................................... 104
4.9.2 Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz ............................................ 104
4.9.3 Korrelation ..................................................................................................... 104
4.9.4 Ausreißertest ................................................................................................. 104
5 Ergebnisse und Diskussion ......................................................................................... 105
5.1 Einfluss von Koffein, Brühmethode und Röstprozess des Kaffees auf die
Phosphodiesterase-Aktivität ............................................................................................ 105
5.1.1 Einfluss des Koffeins auf die Phosphodiesterase-Aktivität in vitro ................. 105
5.1.2 Einfluss der Brühmethode und des Röstgrades auf die Phosphodiesterase-
Aktivität in vitro ............................................................................................................ 107
5.1.3 Einfluss der Röstung der Kaffees auf die Phosphodiesterase-Aktivität in vitro
107
5.2 Aktivitäts-geleitete Fraktionierung......................................................................... 110
5.2.1 Grobfraktionierung ........................................................................................ 110
5.2.2 Feinfraktionierung der löslichen Fraktion FS ................................................. 111
5.2.3 Identifizierung der Leitsubstanzen in Fraktion F8 .......................................... 115
5.2.4 Subfraktionierung von Fraktion F8................................................................. 118
5.2.5 Hydrolyse der Fraktion F8 ............................................................................. 119
5.2.6 Ultrafiltration der Fraktion F8 ......................................................................... 120
5.2.7 Identifizierung der PDE-hemmenden Stoffklasse in Fraktionen F6, F7, F8 .... 121
5.2.8 Diskussion ..................................................................................................... 124