Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований: Учебно-методическое пособие для студентов биологических и медицинских факультетов университетов

60 Pages·2021·0.82 MB·Russian

by  Коллектив авторов

РоССИйСкИй ГоСУдАРСтвенный
ПедАГоГИчеСкИй УнИвеРСИтет им. А. И. ГеРценА
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ IN SITU
ГИБРИДИЗАЦИЯ В ПРАКТИКЕ
НАУЧНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
(для студентов биологических
и медицинских факультетов университетов)
Учебно-методическое пособие
Санкт-Петербург
Издательство РГПУ им. А. И. Герцена
2021
ББК 28.04я73
Ф 69
Печатается по решению кафедры анатомии и физиологии
человека и животных РГПУ им. А. И. Герцена
Утверждено в качестве учебно-методического пособия на заседании
учебно-методического совета ФГБУ НМИЦ им В. А. Алмазова
Рецензенты:
канд. биол. наук О. Г. Чиряева (Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии
и репродуктологии им. Д. О. Отта»)
канд. биол. наук А. М. Злотина (Федеральное государственное бюджетное
учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени
В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации)
Составители:
канд. биол. наук А. Ф. Сайфитдинова
канд. биол. наук И. Л. Пуппо
Ф 69 Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных
и клинических цитогенетических исследований (для студентов
биологических и медицинских факультетов университетов). —
Санкт-Петербург : Изд-во РГПУ им. А. И. Герцена, 2021. — 60 с.
ISBN 978-5-8064-2984-2
Учебно-методическое пособие содержит описание методов физической лока-
лизации последовательностей ДНК на хромосомах на основе гибридизации нук-
леиновых кислот in situ для решения фундаментальных и прикладных задач. Дает-
ся описание принципа метода FISH и история его создания. Представленная
информация изложена в соответствии с требованиями государственного образова-
тельного стандарта и основана на последних достижениях современной науки,
а также на собственном опыте авторов в развитии и применении FISH. Пособие
содержит подробные протоколы с описанием методических особенностей для
практического применения в различных научных и клинических цитогенетических
исследованиях, вопросы и задания для контроля освоения материала.
Пособие предназначено для студентов биологических и медицинских факуль-
тетов университетов, а также медицинских и педагогических институтов, аспи-
рантов и специалистов, использующих гибридизацию in situ в научных исследо-
ваниях и диагностике.
ББК 28.04я73

© А. Ф. Сайфитдинова, И. Л. Пуппо, составители, 2021
© Издательство РГПУ им. А. И. Герцена, 2021
ISBN 978-5-8064-2984-2 © С. В. Лебединский, оформление обложки, 2021
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1
ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ ... 5
Вопросы для самостоятельного контроля ................ 20
Глава 2
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА FISH В ПРАКТИКЕ НАУЧНЫХ
И КЛИНИЧЕСКИХ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 21
2.1. Методики приготовления препаратов для in situ
гибридизации ...................................... 22
2.1.1. Методика приготовления препаратов метафазных
хромосом и интерфазных ядер из лимфоцитов
периферической и пуповинной крови человека........ 22
2.1.2. Методика приготовления препаратов метафазных
хромосом и интерфазных ядер из клеток
культивированных фибробластов человека............ 24
2.2. Протоколы приготовления и мечения зондов ............ 26
2.2.1. Протокол 1. Мечение ДНК-зондов методом ник-
трансляции ...................................... 26
2.2.2. Протокол 2. Оптимизация размеров меченых
фрагментов...................................... 27
2.2.3. Протокол 3. Олигомечение ДНК со случайными
праймерами ..................................... 28
2.2.4. Протокол 4. Мечение зондов методом ПЦР.......... 29
2.2.5. Протокол 5. Очистка ПЦР продукта................ 30
2.2.6. Протокол 6. Получение меченых РНК зондов........ 31
2.2.7. Протокол 7. Оценка эффективности мечения зонда ... 32
2.3. Метафазная и интерфазная in situ ДНК гибридизация..... 33
2.4. Несколько туров in situ ДНК гибридизации на одном
препарате .......................................... 40
2.5. Интерпретация полученных результатов после FISH
по протоколу ДНК гибридизации ...................... 40
2.6. Детекция РНК на цитологических препаратах с помощью
FISH .............................................. 43
2.6.1. Детекция транскриптов на кусочках ткани или целых
эмбрионах (whole mount FISH)...................... 43
2.6.2. Детекция транскриптов на криосрезах ............. 46
2.6.3. Детекция транскриптов в культуре клеток .......... 47
2.6.4. Контрольные эксперименты при постановке РНК FISH 48
Вопросы для самостоятельного контроля ................ 49
2.7. Приложения к главе 2 ............................... 49
Глава 3
ПРАВИЛА ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТА FISH ИССЛЕДОВАНИЯ .... 51
Задания ............................................ 54
Ответы на задания ................................... 56
Словарь терминов ........................................ 57
Список литературы ....................................... 59
Глава 1

ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ
Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе
свойства нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод
гибридизации in situ позволяет точно определить локализацию прак-
тически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно
в клетке или клеточном ядре, на метафазных хромосомах, растянутых
хроматиновых фибриллах и микроматрицах благодаря использованию
высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Особую вос-
требованность методы гибридизации in situ приобрели в последнее
время в связи с развитием персонализированной таргетной биоме-
дицины. В последние 30 лет технология флуоресцентной in situ
гибридизации (FISH) интенсивно развивалась и преобразовалась в
целый комплекс методов, позволяющих получать информацию не
только о физической локализации нуклеиновых кислот, но и об ор-
ганизации генома и кариотипа. Различают FISH на растянутых
фибриллах, на метафазных хромосомах, на распластанных интер-
фазных ядрах и на фиксированных препаратах клеток, сохраняющих
трехмерную организацию (3D-FISH). В зависимости от особенностей
исследования и решаемых им задач выделяют следующие разновид-
ности: одновременную многоцветную FISH с использованием раз-
личных зондов, многоцветную FISH с зондами к отдельным хромо-
сомным сегментам (M-FISH), многоцветный бэндинг хромосом
(MCB-FISH), хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), межвидовое цвет-
ное сегментирование хромосом (Rx-FISH), спектральное кариоти-
пирование (SKY), супрессорную FISH в присутствии избыточного
количества конкурентной ДНК (CISS), сравнительную геномную
гибридизацию (CGH). Несмотря на различия отдельных протоколов,
все они включают этапы денатурации меченого зонда и нуклеиновых
кислот на препарате с последующей их одновременной ренатурац ией
двойной спирали (рис. 1).
В качестве зонда, в любой разновидности гибридизации in situ,
используются фрагменты нуклеиновых кислот, в состав которых
включены репортерные молекулы. Прямое мечение осуществляется
5
Рис. 1. Схема гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием
меченого зонда (репортерная молекула обозначена звездочкой)
включением предшественников нуклеиновых кислот, непосредствен-
но конъюгированных с красителем. Обычно для этого используют
органические флуорохромы на основе химически модифицированных
родаминов или цианинов, т. к. они обладают хорошими спектральны-
ми характеристиками и стабильностью в водных растворах. Для одно-
временной многоцветной FISH зонды метят флуорохромами, спектры
которых не перекрываются. В некоторых случаях, краситель вводят в
состав зонда методами твердотельного химического синтеза, однако
наиболее распространены методы биохимического синтеза на основе
различных полимеразных реакций. Для непрямого мечения использу-
ются предшественники, несущие химические модификации, не пре-
пятствующие биохимическому синтезу нуклеиновых кислот, такие
как биотин, дигоксигенин, динитрофенол, эстрадиол, а также этинил.
Используют дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, связанные ковален-
тно с репортерной молекулой углеводородным линкером для облег-
чения включения такого предшественника в синтезируемый зонд.
На препаратах такие репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин,
динитрофенол, эстрадиол) детектируют веществами, имеющими к ним
высокое сродство, например различными вариантами авидина для
детекции биотина или специфичными антителами. Для визуализации
используют хромогенные или флуоресцентные красители. Этинили-
рованные предшественники выявляют проведением на препарате так
называемой клик-реакции, которая происходит при комнатной темпе-
ратуре в водной среде в присутствии медного катализатора между
этинилом в составе зонда и азидной группой, функционализирующей
краситель.
Состав и размеры зондов варьируют в зависимости от целей экспе-
римента и особенностей метода. Последовательность, комплементар-
6
ная исследуемой, может быть представлена РНК, одно- и двунитевой
ДНК, а также искусственными аналогами, или ксенонуклеиновыми
кислотами, несущими в своем составе химические модификации,
не существующие в природе, однако сохраняющие информационные
свойства нуклеиновых кислот. Длина зонда может колебаться от 20–
40 п.н. вплоть до 1000 п.н. Каждый вариант имеет свои преимущества
и недостатки. Рассмотрим их более подробно. Чаще всего использу-
ются двунитевые ДНК зонды, устойчивые к внешним воздействиям,
которые можно успешно метить различными способами, однако они
требуют обязательной денатурации перед использованием. Однони-
тевые ДНК зонды не требуют денатурации, но если для их получения
используют метод ПЦР с праймером к антисмысловой цепи, то эффек-
тивность такой реакции значительно ниже, поскольку количество
продукта увеличивается в арифметической прогрессии, тогда как при
использовании двух праймеров нарастание происходит в геометриче-
ской прогрессии. Недостатком ДНК-зондов является то, что они
с трудом проникают внутрь толстых объектов. В этом случае предпоч-
тительнее использование РНК зондов, которые получают методом
транскрипции in vitro в присутствии меченых предшественников.
Такие зонды имеют высокое удельное включение модифицированных
предшественников, а, кроме того, позволяют легко удалять с препара-
та несвязавшиеся однонитевые молекулы РНК простым переварива-
нием РНКазой А. Однако они чувствительны к действию РНКаз на
всех этапах гибридизации, что накладывает дополнительные требова-
ния к работе с ними. Легко проникают внутрь любых образцов и устой-
чивы к действию РНКаз синтетические олигонуклеотидные пробы,
но из-за технологических сложностей длина их ограничена, поэтому
работать с ними приходится при низких температурах, иначе есть риск
полностью отмыть весь зонд с препарата.
Использование в качестве зондов для FISH ксенонуклеиновых
олигонуклеотидов, несущих в своем составе отдельные основания
замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК), которые включаются в поли-
пептидную цепь также как и природные нуклеиновые основания,
позволяет повысить их устойчивость (рис. 2). Кроме того, структурная
особенность входящей в их состав замкнутой рибозы увеличивает
жесткость сахарного остова полимера, что не позволяет такому олиго-
нуклеотиду сворачиваться и повышает температуру плавления дуп-
лекса. Это свойство позволяет уменьшить эффективную длину зондов
и повысить специфичность гибридизации.
7
Рис. 2. Варианты основания ЗНК, в которых замыкание рибозы
осуществляется с участием различных химических соединений
Практически не имеют недостатков зонды на основе пептидно-
нуклеиновых кислот (ПНК), которые представляют собой линейные
полимеры синтетических амидов, несущих азотистые основания,
связанных в цепь пептидной связью. За счет сходства по размеру
с мономером нуклеиновой кислоты такие полимеры могут компле-
ментарно взаимодействовать с природными нуклеиновыми кислотами,
однако они устойчивы к ферментам. Отсутствие отрицательного за-
ряда оси таких полимеров дает им преимущества при формировании
дуплексов с заряженными природными молекулами, благодаря чему
они легко проникают в ткани, а также обладают способностью взаимо-
действовать с двунитевой ДНК на препарате, комплементарно связы-
ваясь с одной нитью ДНК и вытесняя другую из дуплекса, что делает
ненужным предварительную денатурацию ДНК образца. Однако такие
зонды нельзя получать и метить в лабораторных условиях, а заказ и
приобретение их у фирм-изготовителей требует существенных мате-
риальных затрат.
В зависимости от типа мишени, зонды можно разделить на следу-
ющие группы:
• специфично окрашивающие целые хромосомы (хромосомные
пэйнты),
• специфично окрашивающие отдельные плечи хромосом или хро-
мосомные сегменты,
• маркирующие центромеры отдельных хромосом (последователь-
ности альфа-сателлитов),
• маркирующие районы локализации других сателлитных последо-
вательностей,
8
• окрашивающие теломерные последовательности,
• маркирующие субтеломерные районы отдельных хромосом,
• маркирующие конкретные локусы хромосом (на основе клониро-
ванных последовательностей генома, отдельных генов или их
фрагментов).
В качестве зондов могут выступать как белок-кодирующие, так
и некодирующие последовательности. В зависимости от задач иссле-
дования используют разные виды зондов или их комбинацию.
Определившись с типом зонда и выбрав подходящую метку, необ-
ходимо произвести включение меченого предшественника в состав
зонда. Самым дешевым методом, позволяющим пометить любую
двунитевую ДНК, является метод ник-трансляции. Поскольку процесс
мечения определяется одновременной работой двух ферментов —
ДНКазы I, наносящей однонитевые разрывы, и ДНК полимеразы I,
обладающей 5’–3’ экзонуклеазной и полимеразной активностями, успех
мечения в значительной степени зависит от качества очистки исходной
ДНК и предварительного тестирования активности ферментов.
Концевое мечение с использованием дезоксинуклеотидил транс-
феразы применяется главным образом для включения радиоактивно-
го предшественника или мечения олигонуклеотидных зондов. В на-
стоящее время вместо этого метода чаще используют твердотельный
химический синтез с включением метки на одном из концов олиго-
нуклеотида, который дает более уверенное включение и дешевле
в производстве.
Метод олигомечения со случайными праймерами основан на ис-
пользовании коротких олигонуклеотидных (6–9 п.н.) затравок, с рав-
ной вероятностью отжигающихся вдоль всей денатурированной мо-
лекулы ДНК и способности фрагмента Кленова ДНК полимеразы I
к 5’–3’ полимеразной активности. Он позволяет получать зонды с
большей долей включения меченого предшественника, чем концевое
мечение и ник-трансляция, но длина меченых фрагментов может быть
ограничена только длиной матрицы, что не всегда удобно, а, кроме
того, себестоимость зонда, полученного таким образом, выше. Тем не
менее, этот метод достаточно прост и пользуется популярностью. При
необходимости мечения этим методом сложных матриц, обогащенных
вторичными структурами, используют изотермический вариант этого
метода с полимеразами, обладающими геликазной активностью (на-
пример, большой субъединицы полимеразы BstI или полимеразы
бактериофага Ф29). В этом случае важно осуществлять контроль
9
за длиной образовавшихся фрагментов и проводить предварительную
фрагментацию матрицы химическими или физическими методами,
в зависимости от особенностей нуклеотидной последовательности.
Наиболее дешевым и вместе с тем самым эффективным методом
получения меченых ДНК зондов является метод ПЦР. Кроме высокой
эффективности включения меченых нуклеотидов, этот метод позво-
ляет увеличить количество исходной матрицы в среднем в 104 раз.
При необходимости получить зонд для локализации известной после-
довательности используются праймеры, находящиеся на расстоянии
100 п.н. — 1000 п.н., не образующие шпилек и не комплементарные
друг другу. При использовании в качестве матрицы геномной ДНК
рекомендуется до реакции мечения получить первичный амплификат
и убедиться, что его длина соответствует предполагаемой. Дополни-
тельно желательно провести секвенирование полученного фрагмента
по Сэнгеру, чтобы убедиться в его соответствии ожидаемому по нук-
леотидному составу. В том случае, если необходимо получить зонд
для клонированного фрагмента неизвестной нуклеотидной последо-
вательности, можно воспользоваться стандартными праймерами,
фланкирующими полилинкерный участок вектора. Необходимо пом-
нить, что наилучший результат получается при использовании зондов
длиной 200–700 п.н., при этом допустимо использование последова-
тельностей до 1000 п.н., но если клонированный фрагмент длиннее,
его придется разрезать подходящей рестриктазой или ДНКазой I. Для
этого готовят раствор 1,5 мкг/мл ДНКазы; 0,1M MgCl и добавляют
2
прямо в реакционную смесь в таком количестве, чтобы после 10–15 мин
инкубации в растворе были фрагменты длиной 200–500 п.н. Ингиби-
руют ДНКазу прогреванием в течение 2–3 мин при 94оС.
Использование ПЦР с вырожденными праймерами позволяет метить
любые последовательности ДНК достаточно эффективно, причем,
имея даже незначительное число копий исходной ДНК-матрицы, мы
можем получить неограниченное количество меченого зонда. Снача-
ла проводят несколько низкотемпературных циклов, позволяющих
праймерам фланкировать участки ДНК матрицы, причем, варьируя
условия первых циклов можно задавать специфичность отжига и
длину полученных фрагментов. В следующих высокотемпературных
циклах полученные фланкированные последовательности амплифи-
цируются по стандартному протоколу ПЦР. Меченый предшественник
вводится в реакцию только после проверки длины первичного амп-
лификата. 1–10 мкл исходного ПЦР продукта берут в реакцию мече-
10