Immunologische und klinisch-diagnostische Studien an tumor-assoziierten Antigenen PDF
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FORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NQRDRHEIN-WESTFALEN Nr. 2903/Fachgruppe Medizin Herausgegeben vom Minister fUr Wissenschaft und Forschung Prof. Dr. Gerhard Uhlenbruck Dr. med. Gerold Wintzer Dr. rere nat. Jiirgen Kania cand. med. Olaf Koch Abteilung Immunbiologie der Mediziniscl.en Klinik der Universităt zu Kăln Immunologische und klinisch -diagnostische Studien an tumor-assoziierten Antigenen Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek Immunologische und klinisch-diagnostische Studien an tumor-assoziierten Antigenen Ger hard Uhlenbruck ••• - Opladen : Westdeutscher Verlag, 1979. (Forschungsberichte des Landes Nordrhein Westfalen ; Nr. 2903 : Fachgruppe Medizin) ISBN 978-3-663-01849-0 ISBN 978-3-663-01848-3 (eBook) DOI 10.1007/978-3-663-01848-3 NE: Uhlenbruck, Gerhard [Mitarb.] © 1979 by Springer Fachmedien Wiesbaden Urspriinglich erschienen bei Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen 1979 ISBN 978·3·663·01849·0 Inhalt Immunchemie des CEA Klinische CEA-Studien 29 Bedeutung der Bestimmung von Plasmaglycoproteinen in der Diagnostik und in der Nachsorge maligner Tumoren 64 Immunbioloqie tumor-assoziierter Antigene im Hinblick auf das Problem der Metastasierung .................... 75 Literatur 92 Wir da~~en den MTA Cornelia Bottinger, Evelyn Janssen und Dorit Karduck fur Ihre wertvolle Mitarbeit. - 3 - Immunchemie des CEA 1. Historisches Die Anfange der immunologischen Untersuchungen von Beziehungen zwischen Tumor- und Embryonalgewebe gehen auf Hirszfeld et al. (1932) und Witebsky (1929) (1,2) zurUck. Beide Autorengruppen entdeckten "Verwandtschafts reaktionen" zwischen menschlichem Embryonal- und Tumor gewebe. Leider erkannte man damals nicht die Bedeutung dieser Arbeiten, und erst 1965 publizierte Tatarinov (3) die Entdeckung eines embryospezifischen Globulins im Serum von Patienten mit Primartumoren der Leber. Unabhangig von Rogalsky (1964) postulierten dann Gold und Freedman (1965) die Existenz des karzinoembryonalen Antigens (CEA) in menschlichen Kolon-Tumoren und dem homologen Embryonalgewebe (4,5). Sie gingen von folgender Arbeitshypothese aus: Wenn ein Tumor MakromolekUle produziert, die in dem entsprechenden Normalgewebe nicht vorkommen, dann ware nach Extraktion der Tumoren eine Immunantwort (z.B. in Kaninchen) gegen aIle im Extrakt vorkommenden Determinanten, also auch gegen die tumor spezifischen, zu erwarten. Nach Absorption des Kaninchen serums mit Extrakten aus Normalgewebe dUrften nur die Antikorper Ubrig bleiben, die ausschlie6lich mit tumor spezifischen Determinanten reagieren. Derartige Anti seren reagieren kreuz mit Extrakten aus homologen Embryonalorganen. Die Bedeutung der karzinoembryonalen Antigene fUr die Tumordiagnostik wurde jedoch erst erkannt, als Abelev et al. 1967 embryonale Antigene im Serum von Tumorpatienten fanden (6) und Thomson et al. 1969 die Hypothese aufstellten, da6 das Vorkommen von CEA im Serum diagnostisch fUr das Vorhandensein eines Tumors im gastrointestinalen Bereich sei (7). In der nachfolgenden Zeit konzentrierte sich das Interesse auf a) die Isolierung und Charakterisierung des CEA MolekUls, b) die Entwicklung eines Testsystems fUr die Routinediagnostik, c) klinische Studien zur Diagnose und Verlaufskontrolle kolorektaler Tumoren und - 4 - d) die Anwendung der immunchemischen Eigenschaften des CEA MolekUls im Hinblick auf eine Immuntherapie kolo rektaler Tumoren. Seit der Isolierung und Charakterisierung von CEA auch aus Normalgewebe (Kolonschleimhaut und KolonspUlflUssigkeit) (8,9), ist allerdings bewiesen, daE das Auftreten von CEA bei neoplastischen Vorgangen kein qualitatives, sondern vielmehr ein quantitatives Geschehen ist, dessen Regulationsmechanismen noch ganzlich unver standen sind. 2. Physikochemie und Analytik Die biochemische und physikochemische Charakterisierung des CEA MolekUls gelingt nur mit einer gewissen Unscharfe. Es scheint so zu sein, daE sich "das CEA" aus einer Population isomerer Formen zusammensetzt, wobei offenbar die Inhomogenitat auf die Variabilitat des Kohlenhydrat - Anteils zurUckzufUhren ist. Das konventionell isolierte CEA ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 200000, wovon 50-60 % auf den Kohlenhydratanteil entfallen (10). Diese hohe Konzentration an Kohlenhydraten bewirkt die guten Loslichkeitseigenschaften, die bei der Reinigung des Glykoproteins ausgenutzt werden: CEA bleibt selbst in 1m Perchlorsaure in Losung. Der Proteinanteil besteht aus einer Polypeptidkette, da nach Reduktion und Alky lierung das Molekulargewicht unverandert bleibt (11) und auEerdem die Proteinkette im automatischen Edman-Abbau sequenzierbar ist, d.h. einheitlich vorliegt (12). In Tabelle I sind einige physikochemische Eigenschaften zusammengefaEt (13,14). - 5 - I Einige physikochemische Eigenschaften des ~ konventionell gereinigten CEA pI 2 - 5 S20,w 7 Stokes- 65 i radius Dichte 1,37 g/ml MG 200000 Die Aminosaurenanalyse (Tab. II) zeigt keine Besonder heiten auf, auSer vielleicht dem Fehlen von Methionin und dem relativ hohen Anteil saurer Aminosauren und Pro lin (13). Die Analysen des Kohlenhydratanteils weisen betrachtlich hohere Schwankungen auf, was auf eine gewisse Gewebe- bzw. Tumorabhangigkeit schlieSen laSt (13). Moglicherweise liegen auch Praparationsartefakte vor (siehe unten). GalNAc wird nicht oder nur in Spuren (abhangig von der Blutgruppe des Patienten) gefunden. 3. Struktur des CEA MolekUls a) Primarstruktur Von der Aminosaurensequenz sind biaher nur die ersten 30 N-terminalen Aminoaauren publiziert (12). Dieae relativ bescheidene Ausbeute ist bedingt durch die Natur des Glykoproteins. Auf Grund des hohen Zuckergehalts sind einerseits die Ausbeuten beim automatischen Edman-Abbau vergleichsweise gering, zum anderen gestaltet sich die Isolierung von homogenen Peptiden schwierig, da offenbar identische Peptide eine unterschiedliche Zuckerzusammen setzung haben. Abb. 1 gibt die Sequenz der ersten 30 N-terminalen Aminosauren wieder. Bemerkenswert ist der hohe Anteil hydrophober Aminosauren, wie z.B. in der - 6 - ~ II Aminosaurenzusammensetzung des CEA Molektils Aminosaure Anteil in Gewichts-% Asparaginsaure 14,1 - 16,6 Glutaminsaure 10,6 - 12,4 - Serin 8,1 10,5 Threonin 7,9 - 9,6 Isoleucin 4,7 - 6,0 Leucin 8,2 - 10,3 Prolin 4,6 - 10,0 Glycin 3,1 - 5,5 Alanin 3,8 - 6,2 Valin 5,8 - 7,3 Tyro sin 3,6 - 5,8 Phenylalanin 2,2 - 3,8 Lysin 2,8 - 3,4 Histidin 1,8 - 2,4 Arginin 3,3 - 4,9 Cystein o - 0,8 Methionin 0 Die Daten geben die Schwankungsbreite von vier verschiedenen CEA Praparationen an (13). Kohlenhydratzusammensetzung des CEA Molektils ~III Monosaccharid Anteile in Gewichts-% Fucose 11,3 - 21,0 Mannose 11,3 - 21,7 Galaktose 15,6 - 26,6 Neuraminsaure 3,9 - 10,7 N-acetylgalaktosamin 1 , 1 - 2,6 N-acetylglukosamin 35,7 - 43,3 Die Daten stammen aus vier verschiedenen Laboratorien (s.o.) und verdeutlichen die betrachtliche Variabilitat des Kohlenhydratanteils des CEA Molektils. - 7 - Va117-Leu-Leu-Leu-Val - Sequenz, auf deren Bedeutung noch eingegangen wird (Tertiarstruktur). 6 8 10 Lys Leu Thr lIe Glu Ser Thr Pro Phe ABn a h H h H B h b nbhhHBbhbh 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Val Ala Glu Gly Lye GIn Val Leu Leu Leu Q h H H B h h h H H H pH BbbhHhhh 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Val His Asn Leu Glu Leu Ala Ser Ala Asn a h b H H H H H b P H h B h b ~~ Die Sequenz der ersten 30 N-terminalen Amino sauren des CEA MolekUls, wie sie von Coligan et ale (12) bestimmt wurden. Gleichzeitig eingetragen sind die qualitativen Wertungen der einzelnen Aminosauren bezUglich ihrer Fahigkeit, eine a - Helix bzw. eine S-Faltblatt struktur zu bilden. Dabei bedeuten: H (strong former), h (former), I (weak former), i (indifferent), b (breaker) und B (strong breaker) jeweils fUr a - Helices in der ersten Reihe und S-Faltblattstrukturen in der zweiten. Die Bestimmung der Primarstruktur des Kohlenhydrat- anteils ist ebenfalls nicht abgeschlossen. Die Anwendung von Lektinen definierter Bindungsspezifitat (Abb. 2) und Methylierungsanalysen vor und nach Einwirkung von Glyko sidasen und zyklischem Smith-Abbau sowie der Vergleich mit Kohlenhydratstrukturen anderer Glykoproteine ftihrten zu der heutigen Modellvorstellung Uber die Struktur der proteinstandigen und terminalen Zuckersequenzen (11,15,16). - 8 - 1 2 3 4 5 13 11 9 7 14 12 10 8 6 Abb. 2: Prazipitationsreaktionen einer gereinigten CEA Fraktion (siehe auch Abb. 7) mit divers en Lektinen im Agargel-Doppeldiffusionsverfahren. 1 = Ricinus communis, 2 = Triticum vulgare (WGA) , 3 = Canavalia ensiformis (Con A), 4 = WGA, 5 = Ricinus communis, 6 = Tridacna squamosa, 7 = CEA, nach Inkubation mit Neuraminidase (Vibrio cholerae) und S-Galaktosidase (E.coli), 8 = Con A, 9 = CEA, nach Inkubation mit S-Galaktosidase (E.coli), 10 = T. squamosa, 11 = CEA, nach Inkubation mit Neuraminidase (V.cholerae), 12 = Con A, 13 = CEA, unbehandelt, 14 = T. squamosa Aus dem Prazipitationsmuster laSt sich folgendes schlieEen: a) Nach Einwirkung von S-Galaktosidase reagiert CEA kaum noch mit T. squamosa - Hamolymphe; dies deutet auf terminale Galaktose hin. b) Die starke Reaktion des unbehandelten CEA mit WGA beruht in diesem System ausschlieSlich auf der Anwesenheit terminaler Neuraminsaure (NANA), da nach Neuraminidase behandlung die CEA Molektile nicht mehr von WGA prazipitiert werden. Dies ist besonders bemerkenswert, als die hier benutzte CEA-Fraktion u.a. mit glcNAc von einer WGA - Affinitatssaule eluiert wurde. c) Ricin reagiert, im Gegensatz zu T. squamosa, nicht mit unbehandeltem CEA; moglicherweise liegt hier eine sterische Hinderung durch NANA vor. Es sei noch angemerkt, daB sich durch Perchlorsaureextraktion gewonnenes CEA im wesentlichen
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