Identifikation af fibroblaster med stamcellekarakteristika i det humane bryst

63 Pages·2010·2.31 MB·English

Identifikation af fibroblaster med
stamcellekarakteristika i det humane bryst

Speciale i biologi ved Københavns Universitet
Camilla Aabye Hansen, september 2010

Vejleder:
Lone Rønnov-Jessen
Sektion for celle- og udviklingsbiologi
Biologisk institut

1
Indholdsfortegnelse
Abstract………………………………………………………………………………………........ 3
Resumé……………………………………………………………………………………………. 4
Forkortelser………………………………………………………………………………………. 5
Indledning………………………………………………………………………………………… 7
Teori ……………………………………………………………………………………………… 8
Normalt brystvæv…………………………………………………………………………………. 8
Brystkræft…………………………………………………………………………………………. 9
Den mesenkymale stamcelle………………………………………………………………………. 11
Pericytter………………………………………………………………………………………….. 14
Problemformulering……………………………………………………………………………... 16
Metode……………………………………………………………………………………………. 16
Isolation af fibroblaster…………………………………………………………………………… 16
Dyrknings assay..………………………………………………………………………………….. 17
Stromasfære assay………………………………………………………………………………… 18
FACS……………………………………………………………………………………………… 19
Differentierings assay……………………………………………………………………………… 20
Immunocytokemi og immunohistokemi…………………………………………………………... 21
Resultater…………………………………………………………………………………………. 24
Etablering af stromasfærer assay………………………………………………………………….. 24
Karakterisering og differentiering af stromasfærer……………………………………………….. 27
Prospektiv isolering af fibroblaster……………………………………………………………….. 32
CFU-F assay……………………………………………………………………………………… 37
Differentiering af MSCA-1+ og MSCA-1- celler………………………………………………… 38
Ekspression af MSC-markører i normalt brystvæv og invasiv cancer……………………………. 41
Diskussion………………………………………………………………………………………... 45
Konklusion/perspektivering…………………………………………………………………….. 50
Referencer……………………………………………………………………………………….. 51

2
Abstract
It is well established that many epithelial carcinomas in general and human breast carcinomas in
particular cause profound changes in the surrounding stroma. The significance for tumor
development and progression of the individual stromal components is, however, far from
elucidated, but the interest has now been further spurred by the suggestion that mesenchymal stem
cells are present in multiple tissues and may participate in regenerative and pathological processes.
The present thesis seeks to establish whether cells with profiles and characteristics of mesenchymal
stem cells can be identified among fibroblasts of normal breast tissue and whether cells with similar
profiles are present in invasive breast carcinomas.
First, fibroblasts were isolated from three normal breast biopsies and cultured under non-adherent
conditions to test for their ability to form stromaspheres analogous to what has been described
previously for other cells with stem cell characteristics. Spheres were readily formed with a
reproducible frequency among biopsies. It was, however, not possible to passage the cultures to
demonstrate self-renewal. Next, stromaspheres were plated in monolayer and characterized by
immunocytochemistry using a panel of markers previously described to identify mesenchymal stem
cells. Initially, stromaspheres expressed MSCA1 but no CS, but within 5-7 days a population of CS-
positivr cells arose. In comparison, TRA-2-49 was heterogeneously expressed throughout and
NFGR was almost not expressed neither in early nor late cultures. Subsequent flow assisted cell
sorting separated the population into MSCA-1+ and MSCA-1- populations. Whereas the MSCA-1+
population readily underwent osteogenic differentiation and to some extent also adipogenic
differentiation, this was not the case for the MSCA-1-. Finally, the panel of MSC markers was
applied to a series of normal breast biopsies and invasive breast carcinomas. This showed that
MSCA-1, TRA-2-49 and NGFR in normal tissue, are localized to interstitial fibroblasts as well as
perivascular fibroblasts of larger vessels. MSCA-1 is in 4 out of ten breast carcinoma´s, expressed
in strokes of myofibroblasts, TRA-2-49 has a broader expression profile and is expressed in strokes
of myofibroblasts, in all the 6 carcinomas investigated. In three out of the eight carcinoma´s tested,
NGFR was expressed in stromal cells and in two of those it was obvious, that it was perivascular
NGFR+ fibroblasts, which were recruited.
Collectively, these results suggest that a subpopulation among human breast fibroblasts exhibit
characteristics of MSCs and as such display a heterogeneity among fibroblasts not previously
described. Also, cells with a similar profile may contribute to the stroma of invasive carcinoma, but
the extent and significance require further investigations.
3
Resumé
Det er veletableret at mange epiteliale carcinomer generelt og specielt i humane brystcarcinomer,
forårsager store forandringer i det omkringliggende stroma. Hvorledes og i hvor høj grad de enkelte
stromale komponenter påvirker tumor dannelsen og udviklingen, er på nuværende tidspunkt ikke
klarlagt. Hvad der har øget interessen, er at det er blevet foreslået at mesenkymale stamceller er
tilstede i flere væv og den muligvis deltager i regenerative og patologiske processer.
Dette speciale vil forsøge at fastslå om der i fibroblast populationen i normalt brystvæv, er en celle
med mesenkymale stamcelle karakteristika og hvorvidt denne celletype er tilstede i invasive bryst
carcinomer. Først blev fibroblaster isoleret fra tre normale biopsier og dyrket under non-adhærente
betingelser, for at teste deres evne til at danne stromasfærer analogt til hvad der tidligere er blevet
beskrevet for andre celler med stamcelle karakteristika. Der dannedes hurtigt sfærer, med en
reproducerbar hyppighed blandt biospier. Det var dog ikke muligt at passere kulturerne og
demonstrerer evnen til selvfornyelse. Stromasfærerne blev plated i monolagskultur og karakteriseret
immunocytokemisk ud fra et panel af markører, som tidligere er benyttet til identificering af
mesenkymale stamceller. Stromasfærerne udtrykte ved udsætning MSCA-1 men ikke CS, men
indenfor 5-7 dage opstod en population af CS-positive celler. Til sammenligning var TRA-2-49
heterogent udtrykt i begge kulturer og NGFR næsten ikke udtrykt i hverken tidlige eller sene
kulturer. Efterfølgende blev cellerne ved flow assisteret celle sortering adskilt i en MSCA-1+ og en
MSCA-1- cellepopulation. MSCA-1+ cellepopulationen kunne differentiere i osteogen retning og i
en hvis grad adipogen retning, hvilket ikke var tilfældet for MSCA-1- cellepopulationen. Til sidst
blev et panel af MSC-markører testet på flere normale brystbiopsier og invasive brystcarcinomer.
Dette viste at MSCA-1, TRA-2-49 og NGFR i normalt væv er lokaliseret i intersitielle fibroblaster
og perivaskulære fibroblaster i større kar. I invasive brystcarcinomer var strøg af MSCA-1+
myofibroblaster. TRA-2-49 har et bredere ekspressionsmønster end MSCA-1 i brystcarcinomer og
udtrykkes i alle seks carcinomer undersøgt. I tre ud af otte carcinomer var NGFR udtrykt i
stromaleceller og i to af biopsierne var det tydeligt at det var NGFR+ perivaskulære fibroblaster,
som blev rekrutteret.
Disse resultater forslår, at der er en subpopulation blandt humane brystfibroblaster, som har MSC
karakteristika, og som sådanne udviser en heterogenitet blandt fibroblaster ikke tidligere beskrevet.
Celler med en lignende profil, bidrager muligvis til stroma hos invasive carcinomer, men
betydningen af dette og i hvilke grad det er tilfældet, kræver yderligere undersøgelser.

4
Forkortelser
α-MEM: α-Minimum Essential Medium
α-SMA: α- glat muskel aktin
APC: allophycocyanin
bFGF: basic fibroblast growth factor
BM-MSC: knoglemarvs-deriverede mesenkymale stamceller
BSA: bovine serum albumin
cAMP: cyclic adenosinmonofosfat
CFU: colony forming unit
CFU-F: fibroblast colony forming unit
CS: chondroitin sulfat
DAB: 3.3´-diaminobenzidine
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMEM/F12: Dulbecco's Modified Eagle Medium/ nutrient mixture F-12
DMSO: dimethyl sulfoxide
ECM: ekstracellulær matriks
EDTA: etylen diamin tetra acid
EGF: epidermal growth factor
FACS: fluorescence activated cell sorting
FBS: fetal bovine serum
GA-1000: gentamicin sulfate og amphotericin-B
5
hEGF: human epidermal growth factor
HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
hMSC: Human Mesenchymal Stem Cells
IBMX: 3-isobutyl-1-methylxanthine
MCGS: Mesenchymal Cell Growth Serum
MEBM: Mammary Epithelium Basal Medium
MEGM: Mammary Epithelial Cell Growth Medium
MMP: metalloproteinase
MSC: mesenkymale stamcelle
MSCA-1: mescenchymal stromal cell antigen-1
MSCBM: Mesenchymal Stem Cell Basal Medium
MSCGM: Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
NGFR: nerve growth factor receptor
NGS: natural goat serum
PBS: phosphate buffered saline
PDGF: platelet derived growth factor
STBI: sojabønne trypsin inhibitor
TDLU: terminal duct lobular unit
TNAP: tissue non-specific alkaline phosphatase
TGF-β: transforming growth factor-β
VEGF: vascular endothelial growth factor
6
Indledning
Det er veletableret, at cancer som oftest opstår i epitel, og at etablering og udvikling af tumorer er
afhængig af interaktion med det omgivende stromale væv, herunder blodkar og fibroblaster. Dette
gælder også for udvikling af invasive tumorer i den humane brystkirtel, hvor stroma reagerer på
epitelial cancer med bl.a. angiogenese og akkumulering af såkaldte myofibroblaster (Rønnov-Jessen
et al., 1996). Myofibroblaster er glat muskel-differentierede stromale celler, som er vist
eksperimentelt at være genereret hovedsageligt fra fibroblaster, mens glatte muskelceller og
pericytter tilsyneladende kun bidrager i begrænset omfang (Rønnov-Jessen et al., 1995). Imidlertid
har den senere tids fokus på mesenkymale stamceller (MSC), og udbredelsen af deres lokalisation
fra kun knoglemarv til adskillige andre væv (da Silva et al., 2006) samt deres eventuelle rolle i
reaktive væv (Karnoub et al., 2007), åbnet for spørgsmålet om, hvorvidt også humant normalt
brystvæv indeholder MSC, og i givet fald i hvilket omfang disse rekrutteres til det reaktive stroma i
carcinomer. Besvarelsen af dette spørgsmål kræver som udgangspunkt, at der etableres en
markørprofil, en isolationsmetode samt dyrknings- og differentieringsassays for MSC fra humant
brystvæv, og dette er netop afsættet for mit speciale.
I nærværende rapport beskrives i teoriafsnittet først opbygningen af det normale brystvæv og de
ændringer specielt stroma undergår ved invasiv cancer. Dernæst beskrives kort opdagelsen af MSC
og deres karakteristika, og deres mulige relevans for cancer. Efter et metodeafsnit følger
resultatafsnittet, hvor jeg lægger vægt på baggrund for valg af markører, dyrknings- og
differentieringsmedier og – assays, og afsnittet munder ud i et forslag til en profil af MSC i human
brystvæv. Den efterfølgende diskussion sammenligner mine resultater med litteraturen indenfor
området, og specielt diskuteres nomenklatur og fejlkilder. Til sidst gøres status og der gives forslag
til videre undersøgelser.

7
Teori
Normalt brystvæv
Den humane brystkirtel går gennem flere større forandringer i forbindelse med dens udvikling og
vækst; i livmoderen, i løbet af de første to leveår, i puberteten, i forbindelse med graviditet og ved
involutionen. Brystkirtlen når sin maksimale udvikling i forbindelse med graviditet, den gennemgår
ved graviditet, først vækst og efterfølgende atrofi. Ved menopausen sker der en involution af
brystet. Hvordan brystet histologisk ser ud, afhænger meget af, hvor i udviklingen og hvor i cyklus
individet befinder sig (Ferguson & Anderson, 1981;Russo et al., 1992).
Brystkirtlen udvikles fra ektoderm, og er et kirtellegeme, der ligger indlejret i fedt og bindevæv. I
fosterlivet dannes to linære fortykkelser, der på hver side strækker sig fra armhulen til lysken. Hos
mennesket tilbagedannes fortykkelserne, på nær i området ved brystregionen. Der vokser nu, på
hver side, en epidermal epitellap i dybden. Der opstår fra lappen ca. 20 sekundære lapper, der
vokser i dybden i form af epiteliale strenge. Disse kanaliseres og bliver til gange, der inden fødslen
forgrener sig, og bliver til et par gange. Hver af disse 20 gange repræsenterer anlægget til en lobus.
Det dermale mesenkym omkring gangene differentierer ud i et løst intralobulært bindevæv, der
omgiver gangene og deres forgreninger samt et tættere interlobulært bindevæv som danner septa
mellem ganganlæg og opdeler kirtlen i lobi (Vorherr, 1974). Lobi adskilles af tæt interlobært
bindevæv, der omfatter det tætte bindevæv, som omslutter alle forgreninger af en gang.
Efter fødslen sker der en involution af den sekretoriske del af kirtelanlægget. Hos drenge foregår
der ingen yderligere udvikling af kirtelvævet. Hos piger sker der en stimulation med østrogen fra
ovarierne, som fører til vækst af brystkirtlen. Væksten fører til videreudvikling af gangsystemet,
hvor enderne af de enkelte forgreninger danner små fortykkelser, der er forstadier til alveoler.
Sekretoriske alveoler udvikles først i forbindelse med graviditet. (Anbazhagan et al., 1991).

Brystet er en kirtel, som består af ca. 20 lobi, som adskilles af et tæt interlobært bindevæv og fedt.
Hver lobulus indeholder en selvstændig kirtel med en udførselsgang. Gangen fra lobulus er beklædt
med et to-laget epitel. Grene fra gangene danner interlobulære gange, der er opbygget af enlaget
cylinderisk epitel, som aftager i højde til kubisk i de mindste intralobulære udførselsgange. Mellem
epitelet og basalmembranen findes altid et lag af myoepitelceller. Forgreningerne fra ductus
lacterifus er omgivet af et løst cellerigt bindevæv uden indhold af fedt. Hver lobus består af talrige
lobuli, der udgøres af de mindste forgreninger. Gangene forgrener sig ved tvedeling. Den terminale
ende af gangen går ind i en lobulus og forgrener sig her uregelmæssigt i et antal intralobulære
8
gange. Den terminale ende, med tilhørende lobulus udgør den funktionelle enhed i brystkirtlen
(betegnes terminal duct lobular unit, TDLU) (Geneser, 1986;Russo & Russo, 1987).

Brystkirtlens stromale væv består af flere komponenter; adipocytter, fibroblaster, blodkar,
immunceller og ekstracellulært matriks (ECM). I den humane brystkirtel udgør det interstitielle
stroma en væsentlig del af brystkirtlens samlede volumen (Drife, 1986). Der er fire typer stroma i
brystet, fedtvæv, interstitial/interlobulært tæt bindevæv, intralobulært løst bindevæv, interlobært og
blodkar.
Det tætte bindevæv består af ECM og et varierende antal fibroblaster, spredt som enkeltceller, samt
arterier, arterioler, vener, venoler og kapillærer (Rønnov-Jessen et al., 1996). Fibroblaster har
mange forskellige funktioner; deposition af ECM, regulering af epitelial differentiering og
regulering af inflammation. Fibroblaster syntetiserer hovedparten af ECM komponenterne, såsom
kollagen type I, type II, type III, type V og fibronektin. Til dannelse af basalmembranen secernerer
fibroblasterne kollagen type IV og laminin. Fibroblasterne producere også flere matrix
metalloproteinases (MMPs) som nedbryder ECM, og derved opretholdes ligevægt. De spiller
derudover en vigtig rolle i opretholdelse af homeostase i det nærliggende epitel, gennem sekretion
af vækstfaktorer og direkte stromal-epitelial interaktion (Rodemann & Møller, 1991;Tomasek et al.,
2002;Chang et al., 2002;Wiseman & Werb, 2002). Ved cancer udfører MMP en kontinuerlig
nedbrydning af ECM. Denne evne til at nedbryde ECM øger tumorens udbredelse og
metastaserings-evne (Duffy, 1992).

Brystkræft
Cancer opstår som mutationer i det normale brystepitel, og kan starte som en benign forandring et
såkaldt in situ carcinom. De to mest almindelige typer af carcinoma in situ er lobular carcinoma in
situ og ductal carcinoma in situ. Lobular cacinoma in situ betragtes som en markør for øget risiko
for senere at udvikle et invasivt carcinom, hvorimod ductal carcinoma in situ oftere lader til at være
en forløber for invasivt carcinom (Posner & Wolmark, 1992). Mere end 90 % af tumorcellers
fænotype er luminal. De første celleforandringer der sker, er ductal hyperproliferation af
epitelcellerne, som så udvikler sig fra in situ carcinom til et invasivt, der til sidst leder til metastaser
(Nagle et al., 1986;Burstein et al., 2004).
9
Det er generelt accepteret, at brystkræft opstår pga. genetiske forandringer i epitelcellerne, men
forskellige studier tyder på, at tumorvækst ikke kun skyldes de maligne cancerceller, men at
tumorstroma også spiller en rolle (Rønnov-Jessen et al., 1996;Kalluri & Zeisberg, 2006). I nogle
tumorer består størstedelen af tumoren af stromalt væv. I brystkræft kan det stromale væv udgøre
over 90 % af den samlede tumormasse, og der ses ofte en udtalt vækst af bindevævet (desmoplasi)
(Rønnov-Jessen et al., 1996). Det desmoplastiske stroma viser forandringer i sammensætningen af
celler og forandringer i ECM-opbygningen sammenlignet med det normale stroma (Dvorak, 1986).
Tumorstroma har øget indhold af kollagen, proteoglykaner, glykosaminoglykaner specielt
hyaloronic acid og chondroitin sulfat (CS) (Rønnov-Jessen et al., 1996). Forandringerne i det
stromale væv skyldes bl.a. at tumorcellerne producerer modulerende vækstfaktorer, såsom basic
fibroblast growth factor (bFGF), vascular enothelial growth factor (VEGF), platelet derived growth
factor (Song et al., 2005), ligander, interleukiner, colony stimulating factor og transforming growth
factor-β (TGF-β). Disse faktorer modulerer stroma på flere måder, bl.a. induceres angiogenese og et
inflammatorisk respons, der aktiverer de omkringliggende fibroblaster, glatte muskelceller og
adipocytter, hvilket fører til yderligere sekretion af vækstfaktorer og proteaser (Coussens & Werb,
2002;Manabe et al., 2003;Bergers & Benjamin, 2003;De Wever & Mareel, 2003).
Induktion af angiogenese er essentiel for tumorens vækst og metastasering, og der vil i
tumorstromaet, sammenlignet med det normale, ses flere blodkar, idet der udtrykkes angiogenese
fremmende cytokiner, såsom VEGF (Carmeliet & Jain, 2000;Folkman, 2003). Sekretion af
cytokiner fra tumorcellerne resulterer i rekruttering af bl.a. lymfocytter, makrofager og neutrofile
granulocytter til tumorens mikromiljø. Dette inflammatoriske miljø kan påvirke overlevelse, vækst,
mutationer, proliferation, differentiering og metastasering af tumor- og stromaceller. Derudover kan
disse cytokiner regulere kommunikationen mellem tumor- og stromaceller og tumorcellers
interaktioner med ECM (Coussens & Werb, 2002).
En af de mest fremtrædende cellulære forandringer i forbindelse med cancer er en øgning i antallet
af myofibroblaster. Myofibroblasterne kunne være deriveret fra stromale fibroblaster, vaskulære
glatte muskelceller eller pericytter fra kapillærerne (Skalli et al., 1986;Skalli et al., 1989;Rønnov-
Jessen et al., 1990). Rønnov- Jessen et al. har vist, at interstitielle og perivaskulære fibroblaster kan
give ophav til myofibroblaster, og at de vaskulære glatte muskelceller fra den venøse del af
karnettet kan mobiliseres af tumorcellerne til at migrere mod tumoren. (Rønnov-Jessen et al., 1995).
En anden fremtrædende celleforandring ved invasive carcinomer, er et tab af myoepitel. I de fleste
10