Identification of the major allergen in Periplaneta americana by HPLC-ESI-MS/MS

2005·0.29 MB·

by  Chuan, Hu

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&’’(，)（* &）：+’(,+’- .//0’)()12&-2
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美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析
胡 川4，&，刘志刚4!，李金生&，韩庆国4，林立丰+，阴伟雄+
（4>深圳大学生命科学学院微生物基因工程重点实验室，广东深圳 (4*’2’；
&>江西医学院基础医学部，南昌 ++’’’2；+> 广东省疾病预防控制中心昆虫研究所，广州 (4’+’’）
摘要：为了建立美洲大蠊 -./+0)$&.#$$(./+"$&$变应原蛋白的质谱鉴定方法，我们将美洲大蠊粗浸液通过L6!61(&离子交换层
析、/B"98;#M%/1&’’凝胶过滤层析等分离步骤得到纯化的3)NL蛋白，对纯化前后的该3)NL蛋白分别进行/L/1O!F6及凝胶内
胰酶酶切，再经液相色谱1电喷雾1串联质谱（POEQ16/.1R/SR/）在线联机分析，所得质谱数据进入网站（9@@"：SSTTTH78@#$UC;$B<;BH
;?7）进行R8C;?@检索比对。通过对两者质谱鉴定结果的比较来评估美洲大蠊天然主要变应原蛋白的纯化效果。结果表明，
纯化蛋白经 POEQ16/.1R/SR/鉴定是美洲大蠊主要变应原蛋白；离子交换层析等纯化步骤可以去除同一分子量的杂蛋白（如
卵黄原蛋白），从而获得较好的鉴定结果。我们首次成功地运用质谱建立起变应原蛋白的新鉴定方法。
关键词：美洲大蠊；液相色谱；电喷雾；串联质谱；变应原；鉴定
中图分类号：V-2( 文献标识码：! 文章编号：’)()12&-（2 &’’(）’&1’+’(1’(
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8%%B#XB<；$DB<@$A$;8@$?<
质谱已经成为一项在蛋白质组学领域中有推动 原。目前国内临床上所使用的蟑螂浸液均为粗浸
意义的技术，尤其在蛋白质的鉴定方面起着重要的 液，含有多种杂蛋白（如蛋白酶）（^?#D8C9 .# $)H，
作用（J?B"C@?#AA，4--3）。变应原蛋白的研究是变态 4--+；\?<X@$7 .# $)H，4--+）。我国南方的蟑螂种类
反应的基础，是提高变态反应性疾病防治水平的原 主要是美洲大蠊 -./+0)$&.#$ $(./+"$&$，占3’d，为优
动力。‘B#<@?< 和 ‘#?T（< 4-2)）首次报道蟑螂变应原 势种群（叶世泰，4-*3）。为了尽可能使用具有我国
蛋白是引起 型变态反应的一种重要的昆虫变应 区域特色（即本地化）并经过标准化的蟑螂变应原以
!
基金项目：国家自然科学基金项目（+-*2’’34）；广州市科技重点项目（&’’&5&16)’&4）
作者简介：胡川，男，4-3)年生，硕士，讲师，从事蛋白纯化研究，6178$%：9:;9:8<4-3)=42+>;?7
!通讯作者 !:@9?#A?#;?##BC"?<DB<;B；6178$%：E5F=CG:HBD:H;<；IB%H：’3((1&2((*-)4
收稿日期 JB;B$KBD：&’’)1’41’)；接受日期 !;;B"@BD：&’’)1’-1&)
A8E 昆虫学报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$ LV卷
在临床变态反应疾病的诊断和脱敏治疗中提高诊断 白酶FU78 #以及G88 # 788 BB-3*# R! !$? ，待
" " L A
的特异性和治疗疗效，我们运用离子交换层析与凝 充分湿润并覆盖干燥胶粒后，再补充 G88 # 788
"
胶过滤层析等方法对美洲大蠊主要变应原进行了纯 BB-3*# R! !$? ，AKT酶解G7 H。
L A
化和免疫学特性鉴定（另文报道），但其变应原蛋白 !"%"% 混合肽提取：充分酶解后稍离心收集上清
的生物质谱鉴定尚未见报道。本文旨在运用快速灵 液，沉淀胶粒中再加 G88 # 8SGQ 三氟乙酸，L8T
"
敏的!"#$%&’(%)’*)’技术建立变应原蛋白新的鉴 7 H，稍离心收集上清液，合并上清液，冷冻干燥，再
定方法，现将结果报道如下。 用7F8 # 8SGQ 三氟乙酸溶解混匀后进行 !"#$%
"
&’(%)’*)’鉴定分析。
! 材料与方法 !"& ’()*+,-.+/-0/-条件
高压液相色谱仪（!"#$）通过电喷雾离子源
!"! 供试昆虫 （&’(）接口与质谱仪（)’）在线联接。!"#$条件：色
美洲大蠊由广东省疾病预防控制中心昆虫研究 谱柱为 $ ：>?.+1@A88’+（F B，GS7 BB W 7F8
7V "
所惠赠，经本室纯培养多代后取材进行样品制备。
BB）；洗脱梯度为 FQ UE8Q，E8 B,5；流动相：1液
!"# 主要试剂和设备 为含8S7Q甲酸的水溶液（水为 !"#$级），+液为含
电泳装置（+,-%./0 公司）；!"#$%&’(%)’*)’ 8S7Q甲酸的乙腈溶液；流速 8SA B#*B,5；柱温：室
（12,3456 7788 94:,49 #$*)’; <:/=）；乙腈（美国 <40,/ 温；检测波长为 G7L 5B；自动进样器进样 G8 #。
"
公 司）；甲 酸（色 谱 纯，天 津）；>?.+1@A88’+ &’(%)’*)’检测条件：电喷雾电离源（&’(）；正离子
（123,456）；胰酶（":-B42/公司）；三氟乙酸（<C1，美国 模式（=-9,6,X4 B-04）；扫描范围：G88U7V88 B*>，分离
<40,/公司）。 宽度为L B*Y；自动串级质谱分析（1Z6-%)’*)’），干
!"$ 样品制备 燥气温度GF8T，干燥气流速78 #*B,5。
美洲大蠊粗浸液制备参照乔秉善（7DDE）方法。 !"1 质谱分析
粗浸液经;&1& FG 离子交换层析得到目的峰收集 将质谱所得所有肽段的质量数及其 )’*)’ 图
液，该液冷冻干燥后经 !,=:4= ’4=H/I:J3! ’%G88 凝胶 谱（碎片离子质量数）同时送入 R$+(5:数据库，使用
过滤层析获得含KL M;纯化蛋白的目的收集峰，采 )/9I-（6 网址：H66=：**[[[\ B/6:,]9I,45I4\ I-B*，)/6:,]
用N4964:5 O3-66,52对该蛋白在各步层析中的变应原 ’I,45I4 #60，^_）中的串级质谱数据搜索功能（)’*)’
活性做免疫学鉴定，其中一抗血清为对蟑螂过敏患
(-59 ’4/:IH）与数据库中相应肽段的理论质量数及其
者阳性血清（深圳市人民医院变态反应科惠赠），二
)’*)’裂解图谱进行相关性比较检索鉴定。
抗为生物素标记的羊抗人 (2&（!），链霉亲和素为辣
根过氧化物酶所标记，;1+显色。该 KL M;蛋白即 # 结果
为质谱鉴定的样品。
!"% 凝胶内酶切 #"! 美洲大蠊2% 34蛋白的分离、纯化及活性鉴定
!"%"! ’;’%"1P& 分离：将美洲大蠊粗浸液以及其 图7为美洲大蠊粗浸液经离子交换层析和凝胶
经两步层析后所得纯化蛋白样品分别进行 ’;’% 过滤层析后 ’;’%"1P& 分析及 N4964:5 O3-66,52 鉴定
"1P&（7GQ分离胶，FQ浓缩胶），考马斯亮蓝 .%GF8 结果，凝胶过滤层析目的峰为分子量 KL M;的单一
染色，脱色，用刀片分别将纯化前后的KL M;单一蛋 活性条带，该条带和粗浸液中具有相同分子量的
白条带以7 BBA 体积切成胶粒，用含F8Q乙腈的GF ’;’%"1P&条带均为经凝胶内酶切的目的条带。
BB-3*# R!L!$?A 溶液使之脱色完全，微加热使胶粒 #"# 纯化抗原的质谱分析
完全干燥。 待鉴定的蛋白条带经胰蛋白酶酶切后，肽段混
!"%"# 酶切前处理：干燥胶粒中加含7SF B2*B#二 合物上!"#$%&’(%)’*)’，所获得的相关质谱数据经
硫苏糖醇的GF BB-3*# R!L!$?A，FET水浴7 H，弃二 )/9I-6检索，将前L个得分最高的匹配结果并排序。
硫苏糖醇；加含 78 B2*B# 碘乙酰胺的 GF BB-3*# 未经色谱纯化的美洲大蠊粗浸液中KL M;蛋白和经
R! !$? ，暗室 AKT 7 H，弃碘乙酰胺，788 BB-3*# 色谱纯化的 KL M; 蛋白的 !"#$%&’(%)’*)’ 鉴定结
L A
R! !$? 洗涤数次，干燥过夜。 果分别如图G、图A所示。
L A
!"%"$ 胰蛋白酶酶切：干燥胶粒加8S7 2* #胰蛋
" "
C期 胡 川等：美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析 MHX
图! 美洲大蠊粗浸液及其各纯化步骤目的收集峰"#"$%&’(分析（&）和)*+,*-./01,,2.3鉴定（4）
5236! "#"$%&’(（&）7.8)*+,*-./01,,2.3（4）19+*:;*.,270<=-1>7,13-7?=@19,A1+,*?+
2.<0;82.3#(&($<*00;01+*BC D(E7.8F2?-*?"*?=7<-@0!G "$CHH’5E
I：分子量标志I7-J*-；!：美洲大蠊全虫粗浸液 E-;8**K,-7<,19 !"#$%&’(")’’*"#$+’(’；
C：#(&(BC离子交换层析目的收集峰L7-3*,?*7J19D(E；M：凝胶过滤层析目的收集峰L7-3*,?*7J19’5E6
!"#$%$&’&()*%+,-.#/+,01#",
"<1-*2+ N!H"O1（3 %），A=*-*%2+,=*?-1/7/202,@,=7,,=*1/+*-P*8>7,<=2+7-7.81>*P*.,6
D.82P28;7021.++<1-*+QBC2.82<7,*28*.,2,@1-*K,*.+2P*=1>1013@（!RHSHB）6
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&<<*++21. I7++ L1,70+<1-* %*?,28*+>7,<=*8 #*+<-2?,21.
32：!!CTUVU!C C!BWHW BV! !T P2,*0013*.2.$C［!"#$%&’(")’’*"#$+’(’］
32：!!BM!BWT XBVUV CCC T 700*-3*.［!"#$%&’(")’’*"#$+’(’］
32：!!BWHXTX VUX!X !VB B 700*-3*.［!"#$%&’(")’’*"#$+’(’］
32：!CWMMMCB W!!CM !!T U 700*-3*.E-$%D?-*<;-+1-（700*-3*.%*-7M）
32：!UMU!UCT C!CBTU !H! M P2,*0013*.2.［!"#$%&’(")’’*"#$+’(’］
图C 美洲大蠊粗浸液中XV J#蛋白F%OE$("D$I"YI"鉴定结果
5236 C I7+<1,+*7-<=-*+;0,+19XV J#?-1,*2.9-1>,=*<-;8**K,-7<,19 !"#$%&’(")’’*"#$+’(’
未经纯化粗浸液的 XV J#蛋白经质谱鉴定（图 XBSVUV J#变应原蛋白（匹配分数最高，VUW分），图M
C）最具可能（匹配分数最高，BV! 分）是美洲大蠊卵 还列出了数据库中该蛋白的一些基本信息如等电点
黄原蛋白$C（P2,*0013*.2.$C），其次才是美洲大蠊变应 （USU!）及氨基酸序列，阴影标记的序列为肽段及碎
原蛋白（匹配分数CCC分）。 片离子质量数理论值与实测值相符的肽段序列，共
经离子交换和凝胶过滤层析后所得的XV J#纯 计!B个肽段的串级质谱图得到了匹配，质量数相符
化蛋白经质谱鉴定（图 M）最具可能是美洲大蠊 的肽段的序列覆盖率为!XZ。
G*H 昆虫学报 ,+)’-().*.&./$+’0$($+’ KH卷
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?*) CRWZ+XR+!O !+-FYQ-Z[W !Q-+QEUWO- V+RWVOUXXD -CR-!ODW-E
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G*) XUERO!-V[W ZWU!YZVZWR ++YUVYYF-W VQOU+C-!C+ XV-[EC+RF-
G>) CZW[+\QR;F V;Y[QWQOR+ -RWEWFX+!Z -UYQ;XOYFY UQ+WEWZXVZ
K*) XV!+UOCDW+ UQ+XFWDQC! ;RCRVWR+OV Q-ZEWO;XY! !FQC[FYWYR
K>) ;Z+U-QWF!+ UVXMX+FXRR VWZYXDFRZY VQYXCUQEY; XRQ!VF!!;;
>*) !F!VF!WRO+ ZQQY!FC+[X QF[WW;FQ!V QWMUW-XO++ +-QUQQUU[E
>>) ZEZWY;YE-W YQ[FXVFZX- WVWQCZ!WMU YUVURQW-FF Q-+UZ-ZFRQ
L*) ;VFWFZWE-O DWZQFYY;ZV QQWFXYVFYE V
图G 美洲大蠊JK ]F纯化蛋白V-+MNX!;ND!^D!鉴定结果
Z&,: G D3’"#0’%3$"/$%’<40’#PJK ]F1<$&P&%71$#0%&9#P !"#$%&’(")’’*"#$+’(’
尽管-%$ 3G蛋白与其他已知的变应原无任何序
6 讨论
列相似性，具高度种属特异性，但它与昆虫存贮蛋
白、昆虫幼虫激素抑制蛋白及节肢动物的血蓝蛋白
\< 和 +3（9 )IHH）、\<等（)IIL）报道了美洲大蠊
分别有 ?*B)T _GLB>T不等的序列同源性，这说明
粗浸液有I种变应原成分，通过 \%’0%$9 24#00&9,鉴定
美洲大蠊的主要变应原可能与昆虫的血淋巴蛋白有
其中J? ]F和JH ]F蛋白可以结合)**T的美洲大蠊
关，因而代表着血蓝蛋白超家族一类新的蛋白质
致敏患者血清特异性 ;,X，为美洲大蠊主要变应原
（\< ") ’&:，)IIJ）。而昆虫卵内的卵黄物质是成虫
-%$ 3（G M$N-;组分）。高波等（?**>）用基因工程技术
期在脂肪体合成后释放到血淋巴中，最后被发育的
使美洲大蠊变应原 M$ -;在大肠杆菌中得到高效表
卵母细胞选择性地摄取积累，卵黄物质在被卵母细
达，并证实该重组变应原具有良好的 ;,X结合活性。
胞摄取前称为卵黄原蛋白（6&0%44#,%9&9）。卵黄原蛋
/期 胡 川等：美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析 %?7
白进入血淋巴是否与!"# $%结合及以何种形式结合 白质量控制和标准化具有重要意义。
尚不能确定。我们的结果证实，尽管在&’&(!)*+上
参 考 文 献（!"#"$"%&"’）
分子量均为,- .’，但未经纯化的粗浸液中,- .’蛋
白经质谱鉴定最具可能是美洲大蠊卵黄原蛋白(/， C"#4DE4 :&，C#EF4 :，672-1 =4A"GD $HH"#IJ(B#"HKLK4$#J ADM@K"A EN DO"
其次才可能是美洲大蠊变应原蛋白，而经纯化后所 GEG.#E$GO5 %5 &$$!’()*$+,5 -../,0$5，%0：0?2P06%1
3"44 QC，9$44 9，9"4I <R，SE4I &3，SOKD"OEMA" <9，67871
得的,- .’ 蛋白经质谱鉴定最具可能是美洲大蠊
+H"GD#EAB#$J KE4KT$DKE4 NE# L$AA AB"GD#EL"D#J EN H$#I" UKELEH"GMH"A5
,01-2- .’变应原蛋白，这提示卵黄原蛋白的降解片
12+!,2!，/-（2 -7/2）：2-P,61
段与 !"# $ %变应原蛋白在 &’&(!)*+上呈近似分子 *$E C，;KM V*，WK4I 9，WM :，;ME &S，;$K X，/??01 +YB#"AAKE4，
量（,- .’）共分离，因此美洲大蠊粗浸液中未经纯化 BM#KNKG$DKE4 $4@ GO$#$GD"#KT$DKE4 EN DO" )L"#KG$4 GEG.#E$GO <# !=
的,- .’蛋白经凝胶内酶切质谱鉴定结果有卵黄原 $HH"#I"45 &2"#3,"0.0$0(+2#1+,+2#，-（8 6）：6%P6,［1 高波，刘志刚，
邢苗，徐宏，罗时文，赖仞，/??01 美洲大蠊变应原<# !=的表
蛋白的成分，但经过色谱纯化尤其是离子交换层析
达、纯化与免疫学特性鉴定5 昆虫学报，-（8 6）：6%P6,］
之后，由于带电荷性质不同从而导致两者被完全分
RE#@$AOZX，)L"4@ 9Q，SKHHK$LAE4 &;，QE4"A QR，!HM4."DD *)，677%1
离，故 ,- .’ 纯化蛋白的凝胶内酶切质谱鉴定结果 +NN"GD EN LKYK4I $HH"#I"4KG "YD#$GDA GE4D$K4K4I 4!$.+,"50670’+/.，85
匹配分数最高的前-项均为美洲大蠊变应原成分而 9#’+,#!，$4@GEG.#E$GOFKDOB"#"44K$H#J"I#$AA5 &,,5 &$$!’()，,（6 %）：
完全排除了卵黄原蛋白的成分，因此我们认为纯化 /-?P/-21
步骤对质谱鉴定结果会产生重要影响，在对目的蛋 [K$4W:，:"3<，/??%1 !#ED"ELKGA：ZO"E#J$4@9"DOE@5 C"K\K4I：&GK"4G"
!#"AA［5 钱小红，贺福初，/??%1 蛋白质组学：理论与方法5 北京：科
白凝胶内酶切进行质谱鉴定之前有必要进行一定的
学出版社］
色谱（如离子交换层析等）以去除杂蛋白的干扰。
[K$EC&，67721 +YB"#KL"4D$H Z"GO4EHEIJ EN )HH"#IJ5 C"K\K4I：!".K4I ]4KE4
事实上，在蛋白质组学研究中，将高灵敏度质谱 9"@KG$H<EHH"I"!#"AA5［乔秉善，67721 变态反应学实验技术5 北
与高分辨度二维凝胶电泳二大关键技术的结合（即 京：中国协和医科大学出版社］
对/’(!)*+上斑点进行质谱鉴定）已是当前蛋白质 XE"BADE#NN !，677,1 9$AA AB"GD#EL"D#J K4 B#ED"K4 ADM@K"A N#EL I"4EL" DE
NM4GDKE45 */’’!,":7+,+0,+,;+0"!255，8：2P6%1
组学研究中必不可少的技术平台。以电喷雾电离和
&$4@"#=，X$MHN(:"KLAEDO 9，&K"DOENN <，;EO$MA <，9"J"# :+，C$M# W，
基质辅助激光吸电离为代表的软电离技术开拓了质
67781 )HH"#IJ DE &67!’(+$$/6(@"#K^"@ "4TJL"A K4 DO" U$.K4I K4@MAD#J：
谱一个崭新领域———生物质谱，并很快渗透到蛋白
K@"4DKNKG$DKE4EN U"D$(YJHEAK@$A" N#EL &67!’(+$$/6,+(!’ $A $ 4"F $HH"#I"4
质研究领域（3"44 !" #$5，6787）。电喷雾所产生的多 （)AB46-）5%5&$$!’()*$+,5-../,0$5，6?（/ /）：/02P/2-1
电荷离子易碎裂使碰撞活化灵敏度提高，特别适合 SE4IDKL&，;"O#"#&C，&$H^$IIKEQ+，:E#4"#S+，677%1 !#ED"$A"$GDK^KDJK4
GEG.#E$GO$4@ U$AK@KELJG"D" $HH"#I"4 "YD#$GDA5 &$$!’() <’025，6-（-）：
于串联质谱分析；而9&与已有的生物大分子研究方
/2%P/281
法如液相色谱等互补从而使联机 :!;<(+&=(9&>9&
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具有准确，灵敏，快速的特点，适用于蛋白质和多肽 GO$#$GD"#KT$DKE4ENL$\E#$HH"#I"4A5%5 &$$!’()*$+,5 -../,0$5，8/：,/,
的肽质量指纹谱和一级结构分析（钱小红和贺福初， P,%01
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国外有学者（&$4@"# !" #$5，6778）通过液相色谱(
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电喷雾(质谱建立肽质量指纹谱而鉴定了曲霉菌中
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各种变应原蛋白的酶性质，其中最主要的变应原被
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鉴定为!(木糖苷酶（)AB 4 6-）。美洲大蠊主要变应 KLLM4EGO"LKG$HGO$#$GD"#KT$DKE4ENDO")L"#KG$4GEG.#E$GO!"#$%（<#(
原的质谱鉴定国内外尚未见报道。本文首次报道了 !=）KAE$HH"#I"4KG^$#K$4DA5 =0$5-../,0$5，%（- 6）：6P81
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［叶世泰，678,1实用变态反应学5北京：人民卫生出版社］
应原蛋白分析鉴定中的应用，提高了其鉴定结果的
可靠性，在变态反应学技术领域对纯化的变应原蛋
（责任编辑：黄玲巧）