i THE EFFECTS OF FOLK MEDICINAL PLANTS VISCUM ALBUM L. AND EPILOBIUM HIRSUTUM ...

198 Pages·2015·2.54 MB·English

THE EFFECTS OF FOLK MEDICINAL PLANTS VISCUM ALBUM L. AND
EPILOBIUM HIRSUTUM L. ON PROTEIN AND mRNA EXPRESSIONS OF RAT
LIVER BILE ACID SYNTHESIZING CYPs

A THESIS SUBMITTED TO
THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
OF
MIDDLE EAST TECHNICAL UNIVERSITY

BY

TUBA ÇULCU

IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS
FOR
THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY
IN
BIOCHEMISTRY

SEPTEMBER 2015

i
ii
Approval of the Thesis:
THE EFFECTS OF FOLK MEDICINAL PLANTS VISCUM ALBUM L. AND
EPILOBIUM HIRSUTUM L. ON PROTEIN AND mRNA EXPRESSIONS OF RAT
LIVER BILE ACID SYNTHESIZING CYPs

submitted by TUBA ÇULCU in partial fulfillment of the requirements for the
degree of the degree of Doctor of Philosophy in Biochemistry Department,
Middle East Technical University by,

Prof. Dr. Gülbin Dural Ünver ________________
Dean, Graduate School of Natural and Applied Sciences

Prof. Dr. Orhan Adalı ________________
Head of Department, Biochemistry

Prof. Dr. Orhan Adalı ________________
Supervisor, Biology Dept., METU

Prof. Dr. Alaattin Şen ________________
Co-Supervisor, Biology Dept., Pamukkale University

Examining Committee Members:

Prof. Dr. N.Tülün Güray _______________
Biology Dept., METU

Prof. Dr. Orhan Adalı _______________
Biology Dept., METU

Prof. Dr. Mümtaz İşcan _______________
Faculty of Pharmacy, Ankara University

Assoc. Prof. Dr. Çağdaş Devrim Son _______________
Biology Dept., METU

Assoc. Prof. Dr. Birsen Can Demirdöğen _______________
Biomedical Engineering Dept., TOBB

Date: 03.09.2015

iii
I hereby declare that all information in this document has been
obtained and presented in accordance with academic rules and ethical
conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I
have fully cited and referenced all material and results that are not
original to this work.

Name, Last name : Tuba ÇULCU
Signature :

iv
ABSTRACT

THE EFFECTS OF FOLK MEDICINAL PLANTS VISCUM ALBUM
L. AND EPILOBIUM HIRSUTUM L. ON PROTEIN AND mRNA
EXPRESSIONS OF RAT LIVER BILE ACID SYNTHESIZING CYPs

Çulcu, Tuba
Ph. D., Department of Biochemistry
Supervisor : Prof. Dr. Orhan Adalı
Co-supervisor : Prof. Dr. Alaattin Şen
September 2015, 172 pages

Plants include many phenolic and polyphenolic compounds that are
important in medicine, cosmetics and nutrition. Viscum album L. is a bi-
perennial shrub and an evergreen semi-parasitic plant widely distributed in
Europe. Epilobium hirsutum L., great willow-herb, grows in Eurasia, North
Africa, Europe, Southern Australia and United States. Due to having a huge
phenolic profiles, Viscum album L. and Epilobium hirsutum L. have many
different biological functions including anti-tumor, anti-oxidant and anti-
cancer. Thus, Viscum album L. and Epilobium hirsutum L. have been used
traditionally for prevention and treatment of some diseases since the
throughout the history of human. In mammals, excessive cholesterol is
removed mainly through conversion to bile acids and cytochromes P450s
initiate all quantitatively significant pathways of cholesterol metabolism and
bile acid biosynthesis. The bile acid pathway is very important in
maintaining normal cholesterol levels. There are two pathways namely the
classical pathway and the acidic pathway involved in bile acid synthesis
catalyzed by CYP7A1 and CYP27A1, respectively. These two pathways
v
produce cholic acid (CA) and chenodeoxycholic acid (CDCA) roughly
equal by CYP8B1 and CYP7B1.
This study is the first about the possible potency of medicinal plants Viscum
album L. and Epilobium hirsutum L. extracts and their major polyphenolic
ingredients, o-coumaric acid and ellagic acid on rat liver cholesterol and bile
acid metabolizing enzymes. In addition to molecular studies, bioactive
compounds of Viscum album L. and Epilobium hirsutum L. extracts were
identified using Liquid Chromatograph-Mass Spectrometry (LC-MS)
technique. The water extracts of Viscum album L., Epilobium hirsutum L, o-
coumaric acid and ellagic acid were injected intraperitoneally as 10 mg/kg,
37.5 mg/kg, 30 mg/kg and 20 mg/kg for 9 days, respectively. Then, in vivo
effects of these plants and their major phenolic ingredients on rat liver
cholesterol and bile acid metabolizing CYPs were analyzed by determining
protein and mRNA expression levels using western blotting and qRT-PCR
techniques, respectively. The results showed that Viscum album L. caused a
0.9 fold decrease in protein expression of CYP7A1 and CYP7B1, but 1.4
and 1.3 fold increases in protein expression of CYP27A1 and CYP8B1,
respectively. Viscum album L. caused 9, 1.3 and 2.4 fold decrease in mRNA
expression of CYP7A1, CYP27A1, CYP7B1, respectively, however, 4.2
fold increase in mRNA expression of CYP8B1. Injection of o-coumaric acid
to rats resulted 0.8 fold decrease in protein expression of CYP7A1,
CYP27A1, CYP8B1 and CYP7B1. However, o-coumaric acid caused 1.8,
1.3, 2.3 and 2.3 fold increase in mRNA expression of CYP7A1, CYP27A1,
CYP8B1 and CYP7B1, respectively. Epilobium hirsutum L. caused 0.6, 0.8
and 0.6 fold decrease in protein expression of CYP7A1, CYP8B1 and
CYP7B1, respectively, whereas 1.3 fold increase in protein expression of
CYP27A1. Epilobium hirsutum L. caused 2.1, 1.4 and 4.1 fold decrease in
mRNA expression of CYP7A1, CYP27A1, CYP7B1, respectively,
however, 2.3 fold increase in mRNA expression of CYP8B1. Injection of
ellagic acid to rats resulted 0.7, 0.8 and 0.8 fold decrease in protein
vi
expression of CYP27A1, CYP8B1, CYP7B1, respectively, but one fold
increase of protein expression of CYP7A1. Ellagic acid caused 2.6, 1.7, 1.8
and 2.3 fold increase in mRNA expression of CYP7A1, CYP27A1,
CYP8B1 and CYP7B1, respectively. In addition, the CYP7A1 enzyme
activity was determined by an Isocratic High-Performance Liquid
Chromatography Assay using a calibration curve obtained by different
cholesterol concentrations. According to these results, even though Viscum
album L. and o-coumaric acid caused fold change in protein and mRNA
expressions of bile acid metabolizing CYPs, serum cholesterol levels
remained unchanged. Epilobium hirsutum L. and ellagic acid-treated
animals showed a significant decrease in total cholesterol level compared to
control animals. Therefore, bases on doses and time point that applied in
this study, the medicinal plant Epilobium hirsutum L. and its polyphenolic
compound, ellagic acid, may have regulatory effects on bile acid
metabolizing enzymes. In conclusion, the synthesis of bile acids from
cholesterol by CYP-catalyzed reactions may be altered due to the changes in
CYP protein and mRNA expressions which may be resulted by the
treatment of animals with Epilobium hirsutum L. and ellagic acid.

Key words: Viscum album L., Epilobium hirsutum L., o-coumaric acid,
ellagic acid, CYP7A1, CYP27A1, CYP8B1, CYP7B1, bile acids,
cholesterol, protein expression, mRNA expression, rat liver.

vii
ÖZ

TIBBİ BİTKİ VİSCUM ALBUM L. VE EPİLOBİUM HİRSUTUM L.
’NİN SIÇAN KARACİĞER SAFRA ASİT METABOLİZMASINDA
ROL OYNAYAN CYP ENZİMLERİNİN PROTEİN VE mRNA
EKSPRESYONLARI ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ

Çulcu, Tuba
Doktora, Biyokimya Bölümü
Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Orhan Adalı
Ortak Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Alaattin Şen
Eylül 2015, 172 sayfa

Bitkiler tıp, kozmetik ve beslenme sektöründe önemli rol oynayan çok fazla
sayıda fenolik ve polifenolik maddeler içerirler. Viscum album L. Avrupa‟
da yaygın olarak dağılan ve iki yıllık yapraklarını dökmeyen yarı parazit bir
bitkidir. Epilobium hirsutum L., yakı otu, Avrasya, Kuzey Afrika, Avrupa,
Güney Avustralya ve Amerika Birleşik Devletleri' nde yetişir. Önemli
fenolik profillerine sahip olan Viscum album L. ve Epilobium hirstum L.
anti-tümör, anti-oksidan ve anti-kanser gibi çok farklı biyolojik işlevlere
sahiptir. Bu nedenle Viscum album L. ve Epilobium hirsutum L. insanlık
tarihi boyunca bazı hastalıkların önlenmesinde ve tedavi edilmesinde
geleneksel olarak kullanılmıştır. Memelilerde fazla kolesterol genellikle
safra asitlerine dönüştürülerek vücuttan uzaklaştırılır. Siokrom P450
enzimleri kolesterol ve safra asit metabolizmasının önemli basamaklarını
başlatır. Safra asit yolağı kolesterol dengesinin korunmasında çok
önemlidir. Safra asit sentezinde klasik ve asidik olmak üzere iki yolak vardır
viii
ve bu yolaklar sırasıyla CYP7A1 ve CYP27A1 enzimleri tarafından
katalizlenir. Ayrıca bu iki yolak CYP8B1 ve CY7B1 enzimleri vasıtasıyla
kolik asit ve kenodoksikolik asit üretir.
Bu çalışma tıbbı bitkiler Viscum album L. ve Epilobium hirsutum L. ve
onların polifenolik içerikleri olan o-kumarik asit ve elajik asit „in sıçan
karaçiğer kolesterol ve safra asitlerini metabolize eden enzimler üzerine
etkilerini araştırılmasında bir ilktir. Moleküler çalışmalara ek olarak, Viscum
album L. ve Epilobium hirsutum L. özütlerinin biyolojik olarak aktif
bileşenleri LC-MS yöntemi ile belirlenmiştir. Viscum album L. (10 mg/kg),
Epilobium hirsutum L. (37.5 mg/kg), o-kumarik asit (30 mg/kg) ve elajik
asit (20 mg/kg) „in sulu ekstreleri wistar albino sıçanlara 9 gün boyunca
intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. Daha sonra, bu bitkilerin ve fenolik
bileşiklerinin kolesterol ve safra asitleri metabolizmasında rol oynayan
CYP‟ler üzerine in vivo etkileri protein ve mRNA seviyesinde western bolt
ve qRT-PCR tekniği kullanılarak analiz edilmiştir. Sonuçlar Viscum
album‟un CYP7A1 ve CYP7B1 enzimlerini protein ekspresyonlarını 0.9 kat
azalltığını fakat CYP27A1 ve CYP8B1 enzimlerinin protein
ekspresyonlarını sırasıyla 1.4 ve 1.3 kat arttırdığını göstermiştir. Viscum
album L. CYP7A1, CYP27A1, CYP7B1 enzimlerinin protein
ekspresyounlarını sırasıyla 9, 1.3 ve 2.4 kat azaltırken, CYP8B1‟ in
ekspresyonunun 4.2 kat artmasına neden olmuştur. o-Kumarik asit tüm
enzimlerin protein ekpresyonunu 0.8 kat azaltırken, CYP7A1, CYP27A1,
CYP8B1 ve CYP7B1 enzimlerinin mRNA ekspresyonlarını sırasıyla 1.8,
1.3, 2.3 ve 2.3 kat arttırmıştır. Epilobium hirsutum L. CYP7A1, CYP8B1,
CYP7B1 enzimlerinin protein ekspresyonlarını sırasıyla 0.6, 0.8 ve 0.6 kat
azaltırken, CYP27A1 enziminin protein ekspresyonunu 1.3 kat arttırmıştır.
Ayrıca Epilobium hirsutum L. CYP7A1, CYP27A1, CYP7B1 enzimlerinin
mRNA ekspresyonlarının sırasıyla 2.1, 1.4 ve 4.1 kat azalmasına neden
olurken, CYP8B1 enziminin mRNA ekspresynunun 2.3 kat artmasına neden
olmuştur. Elajik asit CYP27A1, CYP8B1, CYP7B1 enzimlerinin protein
ix
ekspresyonlarını sırasıyla 0.7, 0.8 ve 0.8 kat azaltırken, CYP7A1 enziminin
protein ekspresyonunu 1 kat arttırmıştır. Ayrıca elajik asit CYP7A1,
CYP27A1, CYP8B1 ve CYP7B1 enzimlerinin mRNA ekspresyonlarını
sırasıyla 2.6, 1.7, 1.8 ve 2.3 kat arttırmıştır. Ayrıca CYP7A1 enzim
aktivitesi farklı kolesterol konsantrasyonları kullanılarak stamdart grafik
çizilerek HPLC yöntemi ile belirlenmiştir. Tüm bu sonuçlara göre, Viscum
album L. ve o-kumarik asit özütleri ile muamele edilmiş hayvanlarda safra
asit sentezinde rol oynayan enzimlerin protein ve mRNA ekspresyonlarında
değişim belirlenmesine rağmen, serum kolesterol seviyesinde değişim
belirlenmemiştir. Epilobium hirsutum L. ve elajik asit özütleri muamele
edilmiş hayvanların serum kolesterol seviyesi kontrol örnekleri ile
karşılatırıldığında önemli bir azalma tespit edilmiştir. Bu çalışmada
uygulanan dozlar ve dozların ugulanma zamanı dikkate alındığında tıbbi
bitki Epilobium hirsutum L. ve onun fenolik bileşeni olan elajik asitin safra
asit metabolizmasındaki enzimler üzerinde düzenleyici etkileri olduğu
gösterilmiştir. Sonuç olarak, Epilobium hirsutum L. ve elajik asit safra asit
sentezini katalizleyen CYP enzimlerinin mRNA ve protein ekspresyonunu
değiştirerek safra asit sentezini etkileyebilir.

Anahtar kelimeler: Viscum album L., Epilobium hirsutum L., o-kumarik
asit, elajik asit, CYP7A1, CYP27A1, CYP8B1, CYP7B1, safra asitleri,
kolesterol, protein ekpresyonu, mRNA ekspresyonu, sıçan karaciğeri.

x