Haurigot, Lorena Cristina. 2010 12 22

229 Pages·2014·6.03 MB·Spanish

by  Haurigot, Lorena Cristina

Tesis Doctoral
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uunn ssiisstteemmaa ddee sseeccrreecciióónn ddee pprrootteeíínnaass
ttiippoo II eenn AAggrroobbaacctteerriiuumm ttuummeeffaacciieennss
Haurigot, Lorena Cristina
2010-12-22
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Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Cita tipo APA:
Haurigot, Lorena Cristina. (2010-12-22). Identificación y caracterización de un sistema de
secreción de proteínas tipo I en Agrobacterium tumefaciens. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Haurigot, Lorena Cristina. "Identificación y caracterización de un sistema de secreción de
proteínas tipo I en Agrobacterium tumefaciens". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires. 2010-12-22.
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UNIVERSIDAAD DE BUUENOS AIRES
FFacultadd de Cienncias Exaactas y NNaturalees
Departtamentoo de Quíímica Bioológica

IIDENTIFFICACIIÓN Y CCARACCTERIZAACIÓNN DE UNN
SISTEMAA DE SECRECIÓÓN DE PROTEEÍNAS TTIPO I EEN
AAGROBBACTEERIUM TTUMEFAACIENSS

Teesis presenntada paara optarr al título de Doctoor de la UUniversidaad
dde Buenos Aires enn el área Químicaa Biológicca

Lic. Loorena Cristina Haaurigott

DIIRECCIÓÓN:
DDra. Ánggeles Zorrreguietaa

DIRECCCIÓN ASIISTENTE:
DDra. Danniela Marta Russoo

Consejeero de eestudios:
Dr. Luis Quesadda Allué

Luggar de traabajo: Fuundación Institutto Leloir
Bueenos Airees, 2009
A mis padres, Ferica Schwender e Hiram Haurigot
A Martin Haurigot y Leyla Haurigot
A Juan Manuel Calvo
AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Ángeles Zorreguieta por dirigir esta tesis y brindarme la posibilidad de
hacerla en su laboratorio. Por enseñarme el valor del trabajo, a confiar en mi misma y
a no dejarme vencer por ningún obstáculo, por imposible que parezca. Porque supo
fomentar mi creatividad dándome mucha libertad lo que promovió mi crecimiento
profesional y personal. Por todo Angeles, muchas gracias!
A mi codirectora Dra. Daniela Russo, gracias Dani por tanta paciencia, por
escucharme y acompañarme en momentos tan difíciles y alentarme siempre, por
ayudarme y enseñarme.
A Jimena Berni y Alejandro Rabossi, no puedo más que agradecerles con todo
mi corazón. Gracias por ser mis amigos, mis consejeros y por ayudarme tanto, por
acompañarme y alegrar el día a día. Ustedes fueron el motor que me permitió llegar
hasta acá. A la Dra. Ana María Stella, excelente profesora y amiga. A Juan Carlos
Calvo.
A los laboratorios que colaboraron y aportaron a esta tesis: Dr. Goldbaum (FIL),
Dr. Pitossi (FIL), Dr. Santa Colomma (FIL), Dr. Wappner (FIL), Dr. Quesada Allué (FIL), Dr.
Etchenique (FCEN).
A los amigos que coseche en estos años que me han soportado
pacientemente, Leandro Martínez Tosar, Edgardo Salvatierra, Guillermo Taminelli,
Vanina Alzogaray, Gustavo Geerken, Pablo Nikel y Silvia Agüero y a los amigos que
están desde siempre Jimena Berni, Soledad Alessandro, Horacio Padula, Javier
Lombardi, Analía Rombolá y Soraya Perez Rullán.
A Alicia Ulloa, por estar al empezar y al terminar, Gracias Ali! A Susana Carrillo
por contenerme durante estos años.
A mi familia Martin, Leyla, sobre todo a mi mama, mi ejemplo de mujer, de
amor y de paciencia, gracias mami. Mis tíos Guillermo y Lucia Schwender y Anita
Schwender. Los que ya no están pero siguen siempre conmigo, mi papa y mi hermano
Marcelo y a mi sobrinitos amados Manuel, Federico, Agustín y Abril, siempre le dieron
alegría a mi vida. A Gonzalo, con todo mi amor.
A mi amor, Manuel, gracias mi vida por estar conmigo y acompañarme.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, AL CONICET y a
la FIL.
A los que no agradezco puntualmente pero siempre estuvieron ahí, aportando
su esfuerzo y buena voluntad para que pudiera hacer mi trabajo. Espero no olvidar a
nadie.
A todos muchas gracias…
Identificación y caracterización de un Sistema de Secreción de Proteínas Tipo I en
Agrobacterium tumefaciens
RESUMEN
Los Sistemas de Secreción de Proteínas tipo I (T1SS) permiten a una amplia
variedad de bacterias Gram-negativas secretar proteínas al medio extracelular; estos
sistemas participan en varias respuestas fisiológicas como la adaptación al medio
ambiente y contribuyen a la virulencia en diversos patógenos. Los T1SS están formados
por un componente de membrana interna (ABC) un componente de fusión de
membrana (MFP) y un componente de membrana externa (OMF). Los genes de los
dos primeros (e inclusive el OMP) suelen estar formando un operón y pueden estar
adyacentes a los genes que codifican sus proteínas sustrato.
En la bacteria simbionte Rhizobium leguminosarum, el T1SS, PrsDE, es
responsable de la secreción de diversas proteínas que participan en la supervivencia
del rizobio en el suelo, favoreciendo la formación de estructuras comunitarias
denominadas biofilms. A. tumefaciens es un fitopatógeno de alto interés agronómico y
biotecnológico. A pesar de la relevancia que los TISS muestran tener en diversas
bacterias Gram negativas, hasta la fecha no se ha avanzado en el estudio y la
relevancia fisiológica de estos sistemas de secreción en este fitopatógeno.
En este trabajo, se aisló a partir de una biblioteca genómica proveniente de A.
tumefaciens el cósmido pIJ7760 que fue capaz complementar el fenotipo de
secreción de cepas mutantes en el sistema PrsDE de R. leguminosarum. Se determinó
que dicho cósmido alberga los genes de un sistema homólogo al que se denominó
AspD-AspE, Agrobacterium secretion protein D and E) formado por un componente
ABC (dominio de unión a ATP) y otro MFP (proteína de fusión de membranas),
respectivamente. Este sistema fue responsable de la secreción de una proteína, a la
que se denominó Hla, de función desconocida codificada rio arriba de aspDE. El
análisis de las secuencias del cósmido permitió identificar, río arriba de hla, genes cuyo
productos presentan alta similitud de secuencia aminoacídica con receptores de
hemo (denominado hlaR) y a factores sigma y anti sigma (denominados hlaS y hlaI).
Las zonas promotoras de ambos loci presentaron secuencias consenso de
reconocimiento del regulador RirA que responde a la concentración de hierro
extracelular. Rio arriba de estos genes se identificó un probable sistema ABC de
captación de hemo (denominado ahuUVTB) que presenta en su región promotora
secuencias de reconocimiento de RirA y del regulador del metabolismo del hemo IrrA.
El análisis de las proteínas presentes en el medio extracelular en diversas
condiciones de cultivo y nutricionales permitió reflejar un complejo control y una
regulación diferencial de la secreción de la proteína Hla en el hospedador sustituto R.
leguminosarum A34 y A. tumefaciens C58. Se observó una muy elevada secreción de
Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 en medios ricos de cultivo. Se
determinó que esta desregulación se debe a que la cepa de A34 contiene una
mutación ancestral en algún regulador desconocido hasta la fecha que provoca un
fenotipo pleiotrópico. Este regulador es codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI y
regula, la secreción de Hla. El estudio de la regulación en el pariente heterólogo R.
leguminosarum mostró que la secreción de Hla también se ve reprimida por los
reguladores globales de respuesta a hierro descriptos en Rhizobiaceae, RirA e IrrA. Por
otro lado, el agregado de hemoglobina como fuente de hemo extracelular, indujo la
secreción de Hla como proteína mayoritaria en el contexto heterólogo de Rhizobium.
El análisis del contexto genético de hla mostró que este gen está incluido en un locus
sinténico a otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo a través de
hemóforos, aunque Hla no presenta similitud de secuencia aminoacídica con
hemóforos caracterizados. Sin embargo, la purificación por columna de afinidad de
hemina mostró que Hla presenta capacidad de unir hemina y sería el primer hemóforo
descripto en la familia Rhizobiaceae.
Mediante mutagénesis dirigida se generó una mutante de secreción en aspD
de A. tumefaciens C58. Los fenotipos asociados a esta mutante mostraron un carácter
pleiotrópico, tanto la autoagregación bacteriana, la adhesión a soporte abiótico y la
motilidad en agar se vieron afectadas. En A. tumefaciens la secreción de Hla
respondió principalmente a condiciones microóxicas/anóxicas, además de a la
ausencia de hierro y presencia de hemo. Interesantemente, la mutante deficiente en
la secreción de Hla fue incapaz de inducir la formación de tumores en Kalanchoe sp.
En conjunto, los resultados presentados en este trabajo sugieren que el T1SS
AspDE, participaría en la captación de hemo extracelular a través de la secreción de
un nuevo hemóforo (Hla) probablemente en condiciones microaerófilas y de bajo
hierro presentes en el contexto del tumor.
Palabras claves: T1SS, hemóforo, Agrobacterium, virulencia, Rhizobium
Identification and characterization of a Type I Secretion System in
Agrobacaterium. tumefaciens

ABSTRACT

Type I secretion systems (TISSs) enable a wide spectrum of Gram-negative
bacteria to deliver proteins to the extracellular medium. This secretion machinery has
been shown to be involved in several physiological responses such as adaptation to
the environment and virulence. T1SS are composed by an inner membrane
component (ABC), a membrane fusion component (MFP) and an outer membrane
component (OMP). ABC and MFP are ussually encoded as an operon and they can
even be located in adjacency to some of their substrate proteins.

The PrsDE System of the related symbiont R. leguminosarum is responsible for the
secretion of several proteins that participate in the survival behaviour of rhizobia in the
soil by the establishment of structured communities known as biofilms. A. tumefaciens is
an important agroeconomical and biotechnological phytopathogen. Despite the
physiological relevance of the subject, previous observations suggested the presence
of T1SS in A.tumefaciens since C58 strain genome sequences are available (2001),
however there have been no advances in the characterization or functional studies of
the secretion system in this phytopathogen.

In this work, heterologous functional complementation assay has been carried
out using an A. tumefaciens genomic library to revert PrsDE mutant strains of R.
leguminosarum A34. This strategy allowed us to isolate an A. tumefaciens cosmid,
pIJ7760 encoding a T1SS, namely AspDE (Agrobacterium secretion protein D and E).
aspD and aspE genes encoded the ABC (ATP binding domain) and MFP (membrane
fusion protein) components of the secretion system respectively. Hla, a conserved
unknown protein located upstream in the cosmid, was identified as a substrate of
AspDE system. The genetic analysis of the surrounding region revealed a putative heme
receptor (HlaR) and an ECF sigma and antisigma factor (HlaSI) encoded upstream of
Hla. These genes have a RirA (global iron regulation) consensus sequence in their
promoter region. Another putative ABC uptake system (AhuUVTB) was identified in
pIJ7760 with recognition sequence for RirA and IrrA (heme response regulator).

Extracellular protein analysis from different cultured conditions shown that
complex and differential control of the secretion of Hla occurs between R.
leguminosarum A34 and A. tumefaciens C58 strains. An elevated Hla secretion was
observed in rich medium in the R. leguminosarum A34 heterologous host. This miss
regulation was found to be in response to a so far unknown mutation which triggers
pleiotropic phenotypes. This regulator is encoded in the pRL1JI symbiotic plasmid and
appears to regulate Hla secretion. The modulation of Hla secretion was studied using
the related strain R. leguminosarum, and revealed that the secretion of the protein is
also controlled by the two global regulators previously described in Rhizobiaceae, RirA
and IrrA. Additionally, adding hemoglobin as an extracellular heme source induces the
secretion of Hla as the major protein in the R. leguminosarum heterologous context.
Despite the fact that Hla shows no homology with previously characterized
hemophores, the gene is included in a region with remarkable homology to a locus
involved in heme uptake through hemophores. Hla was purified from extracellular
medium cultures using hemin affinity column suggesting novel hemophore in
Rhizobiaceae family.
Using directed mutagenesis, an aspD secretion mutant was generated in A.
tumefaciens C58 strain. Phenotypic characterization revealed that the mutation has a
pleiotropic phenotype affecting the bacterial aggregation, adhesion to an abiotic
surface and agar-motility. Studies on A. tumefaciens showed that apart from
responding to iron starvation and addition of heme to the medium, Hla secretion mainly
responds to microoxic/anoxic conditions. Interestingly, aspD mutant, unable of Hla
secretion was avirulet, as shown by incapability of tumor induction in Kalanchoe sp.
plants.
Taking together, these results suggest that the AspDE Type I Secretion System
characterized in this work could be involved in heme uptake through the secretion of a
novel hemophore (Hla) probably in the low iron and microaerobiosis present in the
tumor.
Key words: T1SS, haemophore, Agrobacterium, virulence, Rhizobium
Parte de los resultados que se describen en esta tesis serán publicados en los
siguientes trabajos:

The AspDE TISS is involved in the secretion of Hla, a new hemin-binding protein required
for full virulence in Agrobacterium tumefaciens.
Lorena Haurigot, Marcela Ferella, Christine Finnie, Daniela Russo, Allan Downie and
Angeles Zorreguieta

The hla aspDE hemophore locus of Agrobacterium tumefaciens belongs to a gene
cluster that responds to iron, heme and low oxygen conditions.
Lorena Haurigot, Daniela Russo and Angeles Zorreguieta