Table Of Content

2993 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ ΤΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑΣ ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ Αρ. Φύλλου 137 22 Ιουνίου 2007 ΠΡΟΕΔΡΙΚΟ ΔΙΑΤΑΓΜΑ ΥΠ’ ΑΡΙΘΜ. 108 4. Την υπ’ αριθμ. 78/2007 γνωμοδότηση του Συμβουλί− Τροποποίηση των Παραρτημάτων II, ΙΙΙ, IV, V, VI και VIΙ ου της Επικρατείας μετά από πρόταση του Υπουργού του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214) «Μέτρα για τον έλεγχο του Οικονομίας και Οικονομικών και του Υφυπουργού Αγρο− παθογόνου βακτηρίου των γεωμήλων και της ντομά− τικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, αποφασίζουμε: τας Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. σε Άρθρο 1 συμμόρφωση προς την Οδηγία 98/57/ΕΚ του Συμβου− Σκοπός λίου.», σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 2006/63/ΕΚ Με το παρόν προεδρικό διάταγμα αντικαθίστανται τα της Επιτροπής και συμπλήρωση διατάξεων του δι− Παραρτήματα II, ΙΙΙ, IV, V, VI και VIΙ του π.δ. 255/2000 (Α΄ ατάγματος αυτού. 214), σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 2006/63/ΕΚ (L Ο ΠΡΟΕΔΡΟΣ 206/36, 27.7.2006) της Επιτροπής «για την τροποποίηση ΤΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑΣ των παραρτημάτων II έως VIΙ της Οδηγίας 98/57/ΕΚ του Έχοντας υπόψη: Συμβουλίου για τον έλεγχο του Ralstonia solanacearum 1. Τις διατάξεις (Smith) Yabuuchi et al.» και συμπληρώνονται διατάξεις α) Του άρθρου 1 παρ. 1, 2 και 3 του ν.1338/1983 «Εφαρ− του διατάγματος αυτού. μογή του Κοινοτικού Δικαίου» (A΄ 34) όπως η παρ. 1 Άρθρο 2 έχει τροποποιηθεί με τη διάταξη του άρθρου 6 παρ. 1 (άρθρο 1 Οδηγίας 2006/63/ΕΚ) του ν.1440/1984 «Συμμετοχή της Ελλάδος στο κεφάλαιο, Τα Παραρτήματα II, ΙΙΙ, IV, V, VI και VIΙ του άρθρου 11 στα αποθεματικά και στις προβλέψεις της Ευρωπαϊκής του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214) αντικαθίστανται αντίστοιχα Τράπεζας Επενδύσεων, στο κεφάλαιο της Ευρωπαϊκής ως εξής : Κοινότητος, Άνθρακος και Χάλυβος και του Οργανισμού Εφοδιασμού EURATOM» (Α΄ 70) και του άρθρου 3 του ιδίου ν. 1338/1983, όπως αυτό έχει αντικατασταθεί με «ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ το άρθρο 65 του ν. 1892/90 (Α΄ 101). ΣΧΗΜΑ ΔΟΚΙΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ, ΤΗΝ ΑΝΙ− β) Του άρθρου 4 του ν.2147/1952 (Α΄ 155) «Περί προλή− ΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ RALSTONIA ψεως και καταστολής των ασθενειών και εχθρών των SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. φυτών και περί οργανώσεως της Φυτοπαθολογικής Υπηρεσίας». ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΗΣ γ) Του άρθρου 90 του Κώδικα Νομοθεσίας για την Στο παρόν σχήμα περιγράφονται οι διάφορες διαδι− Κυβέρνηση και τα Κυβερνητικά όργανα που τέθηκε σε κασίες για: ισχύ με το άρθρο του υπ΄ αριθμ. 63/2005 προεδρικού i) τη διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πα− διατάγματος (Α΄ 98). τάτας και της βακτηριακής μάρανσης σε φυτά πατάτας 2. Την υπ’ αριθμ. Υ 132/11.10.2004 (B΄ 1533) κοινή από− και τομάτας καθώς και σε άλλα φυτά ξενιστές· φαση του Πρωθυπουργού και του Υπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων «Ανάθεση αρμοδιοτήτων στον ii) την ανίχνευση του Ralstonia solanacearum σε δείγ− Υφυπουργό Αγροτικής Ανάπτυξης Αλέξανδρο Κοντό.» ματα κονδύλων πατάτας, φυτών πατάτας, τομάτας και 3. Το γεγονός ότι από τις διατάξεις του παρόντος άλλων φυτών ξενιστών, στο νερό και το έδαφος· διατάγματος δεν προκαλείται δαπάνη σε βάρος του iii) την ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum (R. Κρατικού Προϋπολογισμού. solanacearum). 2994 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ζεται στα διαγράμματα ροής που παρατίθενται στη συνέχεια. Μία θετική πρώτη δοκιμή διαλογής (δοκιμή IF, Στα Προσαρτήματα παρέχονται βελτιστοποιημένα PCR/FISH, εκλεκτική απομόνωση) πρέπει να επιβεβαιω− πρωτόκολλα σχετικά με τις διάφορες μεθόδους, επι− θεί από δεύτερη δοκιμή διαλογής με βάση διαφορετική κυρωμένα (validated) αντιδραστήρια και λεπτομέρειες για την προετοιμασία των υλικών δοκιμής και μαρτύ− βιολογική αρχή. ρων. Στο Προσάρτημα 1 παρατίθεται κατάλογος των Εάν η πρώτη δοκιμή διαλογής είναι θετική, η μόλυνση εργαστηρίων που συμμετείχαν στη βελτιστοποίηση και από το R. solanacearum θεωρείται πιθανή και πρέπει να επικύρωση των πρωτοκόλλων. πραγματοποιηθεί δεύτερη δοκιμή διαλογής. Εάν και η Λόγω του ότι τα πρωτόκολλα αφορούν την ανίχνευ− δεύτερη δοκιμή διαλογής είναι θετική, η υποψία μόλυν− ση ενός οργανισμού καραντίνας και περιλαμβάνουν τη σης επιβεβαιώνεται (πιθανολογούμενη εμφάνιση του πα− χρήση βιώσιμων καλλιεργειών του R. solanacearum ως θογόνου) και πρέπει να συνεχισθεί η πραγματοποίηση υλικών μαρτύρων, είναι απαραίτητο να εφαρμοσθούν οι δοκιμών σύμφωνα με το σχήμα. Εάν η δεύτερη δοκιμή διαδικασίες υπό τις κατάλληλες συνθήκες καραντίνας, διαλογής είναι αρνητική, τότε θεωρείται ότι το δείγμα με επαρκείς εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων και δεν έχει μολυνθεί από το R. solanacearum. υπό την προϋπόθεση προηγούμενης χορήγησης των Η επιβεβαίωση της παρουσίας του οργανισμού, κατάλληλων αδειών από τις αρμόδιες αρχές που είναι όπως αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 1 του π.δ. υπεύθυνες για θέματα καραντίνας φυτών. 255/2000 (Α΄ 214), σημαίνει την απομόνωση και ταυτο− Οι παράμετροι που καθορίζουν τη διεξαγωγή των δο− ποίηση καθαρής καλλιέργειας του R. solanacearum και κιμών πρέπει να εξασφαλίζουν σταθερή και αναπαραγώ− επιβεβαίωση της παθογένειας. γιμη ανίχνευση των επιπέδων του R. solanacearum στα καθορισθέντα όρια των επιλεγμένων μεθόδων. Η ακριβής παρασκευή των θετικών μαρτύρων είναι ΕΝΟΤΗΤΑ Ι επιτακτική. Η διενέργεια δοκιμών σύμφωνα με τα απαιτούμενα ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΩΝ όρια προϋποθέτει επίσης την εξασφάλιση ορθών παρα− 1. Σχήμα ανίχνευσης για τη διάγνωση της καστα− μέτρων, συντήρηση και βαθμονόμηση του εξοπλισμού, νής σήψης και της βακτηριακής μάρανσης (Ralstonia την προσεκτική μεταχείριση και συντήρηση των αντι− solanacearum) σε κονδύλους πατάτας και φυτά πατά− δραστηρίων καθώς και τη λήψη όλων των απαραίτητων τας, τομάτας ή άλλα φυτά ξενιστές που παρουσιάζουν μέτρων για την αποφυγή μόλυνσης μεταξύ των δειγ− συμπτώματα καστανής σήψης ή βακτηριακής μάραν− μάτων, π.χ. το διαχωρισμό των θετικών μαρτύρων από σης. τα ελεγχόμενα δείγματα. Είναι απαραίτητο να εφαρμό− Η διαδικασία εξέτασης προορίζεται για κονδύλους και ζονται πρότυπα ελέγχου της ποιότητας έτσι ώστε να αποφεύγονται διοικητικά και άλλα σφάλματα, ιδιαίτερα φυτά πατάτας που παρουσιάζουν τυπικά ή ύποπτα συ− όσον αφορά την σήμανση και την τεκμηρίωση. μπτώματα της καστανής σήψης ή μαρασμού των φυτών. Η πιθανολογούμενη εμφάνιση του παθογόνου, όπως Η διαδικασία περιλαμβάνει μία δοκιμή ταχείας διαλο− αυτή αναφέρεται στο άρθρο 4 παράγραφος 2 του π.δ. γής, απομόνωση του παθογόνου αιτίου από μολυσμένο 255/2000 (Α΄ 214), σημαίνει την ύπαρξη θετικού αποτε− αγγειώδη ιστό σε (εκλεκτικά) υλικά και, σε περίπτωση λέσματος των διαγνωστικών δοκιμών ή των δοκιμών θετικού αποτελέσματος, ταυτοποίηση της καλλιέργειας διαλογής που διενεργήθηκαν επί δείγματος, όπως ορί− ως Ralstonia solanacearum. ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2995 2996 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2. Σχήμα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του παθογόνου· ακολουθεί δε, στην περίπτωση απομόνωσης Ralstonia solanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών τυπικών αποικιών, επιβεβαίωση μιας καθαρής καλλι− κονδύλων πατάτας έργειας ως καλλιέργειας R. solanacearum. Το θετικό Αρχή: αποτέλεσμα μίας μόνον δοκιμής διαλογής δεν επαρκεί Η διαδικασία εξέτασης αποσκοπεί στην ανίχνευση για να θεωρηθεί το δείγμα ύποπτο. μολύνσεων σε λανθάνουσα μορφή σε κονδύλους πατά− Οι δοκιμές διαλογής και οι δοκιμές απομόνωσης πρέ− τας. Το θετικό αποτέλεσμα τουλάχιστον δύο δοκιμών πει να επιτρέπουν την ανίχνευση 103 έως 104 κυττάρων/ διαλογής(3) που βασίζεται σε διαφορετικές βιολογικές ml αιωρήματος του ιζήματος, συμπεριλαμβανομένων ως αρχές, πρέπει να συμπληρώνεται με την απομόνωση του θετικών μαρτύρων σε κάθε σειρά δοκιμών. *01001372206070036* ΦΕΚ 137 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2997 3. Σχήμα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων φυτών ξενιστών (1) (cid:506)(cid:540)(cid:529)(cid:652)(cid:304)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) III.2.1. (cid:534)(cid:538)(cid:302)(cid:306)(cid:302)(cid:305)(cid:547)(cid:542)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:555)(cid:541)(cid:304)(cid:542)(cid:302)(cid:541)(cid:304)(cid:534)(cid:529)(cid:537)(cid:536)(cid:303)(cid:304)(cid:538)(cid:534)(cid:541)(cid:528)(cid:306)(cid:550)(cid:542). (2) (cid:517)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:537)(cid:544)(cid:303)(cid:544)(cid:538)(cid:304)(cid:543)(cid:302)(cid:534)(cid:550)(cid:534)(cid:530)(cid:546)(cid:539)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:547)(cid:534)(cid:539)(cid:529)(cid:542)(cid:306)(cid:545)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:546)(cid:306)(cid:544)(cid:547)(cid:652)(cid:302)(cid:537)(cid:544)(cid:534)(cid:553)(cid:542)(cid:544)(cid:547)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:544)(cid:542)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) III.2.1. (3) (cid:520)(cid:306)(cid:536)(cid:542) (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:531)(cid:652)(cid:306)(cid:550)(cid:305)(cid:536) (cid:652)(cid:544)(cid:547) (cid:303)(cid:554)(cid:544) (cid:306)(cid:544)(cid:547)(cid:540)(cid:528)(cid:548)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:544)(cid:542) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546) (cid:541)(cid:304) (cid:533)(cid:528)(cid:305)(cid:536) (cid:303)(cid:538)(cid:302)(cid:307)(cid:544)(cid:545)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546) (cid:533)(cid:538)(cid:544)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546) (cid:302)(cid:545)(cid:548)(cid:529)(cid:546) (cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538) (cid:537)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546), (cid:652)(cid:545)(cid:529)(cid:652)(cid:304)(cid:538) (cid:542)(cid:302) (cid:303)(cid:538)(cid:304)(cid:543)(cid:302)(cid:548)(cid:537)(cid:304)(cid:531)(cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:541)(cid:553)(cid:542)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:539)(cid:302)(cid:538)(cid:304)(cid:652)(cid:538)(cid:533)(cid:304)(cid:533)(cid:302)(cid:531)(cid:550)(cid:305)(cid:536).(cid:518)(cid:545)(cid:302)(cid:534)(cid:541)(cid:302)(cid:306)(cid:544)(cid:652)(cid:544)(cid:538)(cid:304)(cid:531)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:306)(cid:544)(cid:547)(cid:540)(cid:528)(cid:548)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:544)(cid:542)(cid:541)(cid:531)(cid:302)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530)(cid:303)(cid:538)(cid:302)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:530)(cid:546).(cid:520)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:531)(cid:652)(cid:306)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:652)(cid:544)(cid:547)(cid:536)(cid:304)(cid:542) (cid:540)(cid:553)(cid:534)(cid:550) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530) (cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538) (cid:302)(cid:545)(cid:542)(cid:536)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:530), (cid:306)(cid:544) (cid:303)(cid:304)(cid:531)(cid:534)(cid:541)(cid:302) (cid:537)(cid:304)(cid:550)(cid:545)(cid:304)(cid:531)(cid:306)(cid:302)(cid:538) (cid:302)(cid:545)(cid:542)(cid:536)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:553). (cid:520)(cid:306)(cid:536)(cid:542) (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:531)(cid:652)(cid:306)(cid:550)(cid:305)(cid:536) (cid:652)(cid:544)(cid:547) (cid:536) (cid:304)(cid:542) (cid:540)(cid:553)(cid:534)(cid:550) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530) (cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538) (cid:537)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:530), (cid:302)(cid:652)(cid:302)(cid:538)(cid:306)(cid:304)(cid:531)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:536)(cid:303)(cid:538)(cid:304)(cid:542)(cid:529)(cid:545)(cid:534)(cid:304)(cid:538)(cid:302)(cid:303)(cid:304)(cid:554)(cid:306)(cid:304)(cid:545)(cid:536)(cid:546)(cid:530)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:305)(cid:305)(cid:544)(cid:306)(cid:529)(cid:545)(cid:550)(cid:542)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:555)(cid:542)(cid:303)(cid:538)(cid:302)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:530)(cid:546)(cid:541)(cid:304)(cid:533)(cid:528)(cid:305)(cid:536)(cid:303)(cid:538)(cid:302)(cid:307)(cid:544)(cid:545)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546)(cid:533)(cid:538)(cid:544)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546)(cid:302)(cid:545)(cid:548)(cid:529)(cid:546)(cid:529)(cid:306)(cid:305)(cid:538)(cid:555)(cid:305)(cid:306)(cid:304) (cid:542)(cid:302)(cid:304)(cid:652)(cid:538)(cid:533)(cid:304)(cid:533)(cid:302)(cid:538)(cid:550)(cid:537)(cid:304)(cid:531)(cid:306)(cid:544)(cid:652)(cid:545)(cid:555)(cid:306)(cid:544)(cid:537)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:553)(cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:306)(cid:529)(cid:540)(cid:304)(cid:305)(cid:541)(cid:302).(cid:508)(cid:528)(cid:542)(cid:536)(cid:303)(cid:304)(cid:554)(cid:306)(cid:304)(cid:545)(cid:536)(cid:530)(cid:528)(cid:540)(cid:540)(cid:304)(cid:546)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546)(cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538)(cid:302)(cid:545)(cid:542)(cid:536)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:529)(cid:546),(cid:306)(cid:544)(cid:303)(cid:304)(cid:531)(cid:534)(cid:541)(cid:302)(cid:537)(cid:304)(cid:550)(cid:545)(cid:304)(cid:531)(cid:306)(cid:302)(cid:538) (cid:302)(cid:545)(cid:542)(cid:536)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:553).(cid:507)(cid:304)(cid:542)(cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538)(cid:302)(cid:652)(cid:302)(cid:545)(cid:302)(cid:531)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:304)(cid:546)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:302)(cid:538)(cid:306)(cid:529)(cid:545)(cid:550)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546). (4) (cid:510)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530)(cid:304)(cid:539)(cid:540)(cid:304)(cid:539)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:530)(cid:546)(cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:541)(cid:553)(cid:542)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:546)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.4. (5) (cid:510)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530) IF (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.5. (6) (cid:517)(cid:538)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546) PCR (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:544)(cid:542)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.6. (7) (cid:510)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530) FISH (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.7. (8) (cid:517)(cid:538)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546) ELISA (cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:544)(cid:542)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.8. (9) (cid:510)(cid:533)(cid:538)(cid:544)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.A.9. (10) (cid:510)(cid:306)(cid:547)(cid:652)(cid:538)(cid:539)(cid:530)(cid:541)(cid:544)(cid:545)(cid:307)(cid:544)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:531)(cid:302)(cid:306)(cid:550)(cid:542)(cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:538)(cid:539)(cid:538)(cid:555)(cid:542)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) II.3.(cid:303). (11) (cid:510) (cid:539)(cid:302)(cid:540)(cid:540)(cid:538)(cid:529)(cid:545)(cid:534)(cid:304)(cid:538)(cid:302) (cid:530) (cid:544)(cid:538) (cid:533)(cid:538)(cid:544)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546) (cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538) (cid:303)(cid:547)(cid:542)(cid:302)(cid:306)(cid:553)(cid:542) (cid:542)(cid:302) (cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:306)(cid:554)(cid:548)(cid:544)(cid:547)(cid:542) (cid:540)(cid:553)(cid:534)(cid:550) (cid:302)(cid:542)(cid:306)(cid:302)(cid:534)(cid:550)(cid:542)(cid:538)(cid:305)(cid:541)(cid:544)(cid:554) (cid:530) (cid:652)(cid:302)(cid:545)(cid:304)(cid:541)(cid:652)(cid:553)(cid:303)(cid:538)(cid:305)(cid:536)(cid:546) (cid:302)(cid:652)(cid:553) (cid:305)(cid:302)(cid:652)(cid:545)(cid:544)(cid:307)(cid:547)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:528) (cid:533)(cid:302)(cid:539)(cid:306)(cid:530)(cid:545)(cid:538)(cid:302). (cid:508)(cid:528)(cid:542) (cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:539)(cid:306)(cid:536)(cid:537)(cid:544)(cid:554)(cid:542) (cid:537)(cid:304)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:528) (cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:306)(cid:304)(cid:540)(cid:529)(cid:305)(cid:541)(cid:302)(cid:306)(cid:302) (cid:305)(cid:306)(cid:538)(cid:546) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546) (cid:303)(cid:538)(cid:302)(cid:540)(cid:544)(cid:534)(cid:530)(cid:546) (cid:302)(cid:540)(cid:540)(cid:528) (cid:306)(cid:302) (cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:306)(cid:304)(cid:540)(cid:529)(cid:305)(cid:541)(cid:302)(cid:306)(cid:302) (cid:306)(cid:550)(cid:542) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:555)(cid:542) (cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:541)(cid:553)(cid:542)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:546)(cid:304)(cid:531)(cid:542)(cid:302)(cid:538)(cid:302)(cid:545)(cid:542)(cid:536)(cid:306)(cid:538)(cid:539)(cid:528),(cid:652)(cid:545)(cid:529)(cid:652)(cid:304)(cid:538)(cid:542)(cid:302)(cid:304)(cid:652)(cid:302)(cid:542)(cid:302)(cid:540)(cid:536)(cid:307)(cid:537)(cid:544)(cid:554)(cid:542)(cid:544)(cid:538)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:529)(cid:546)(cid:302)(cid:652)(cid:544)(cid:541)(cid:553)(cid:542)(cid:550)(cid:305)(cid:536)(cid:546). (12) (cid:510) (cid:302)(cid:543)(cid:538)(cid:553)(cid:652)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536) (cid:306)(cid:302)(cid:547)(cid:306)(cid:544)(cid:652)(cid:544)(cid:531)(cid:536)(cid:305)(cid:536) (cid:539)(cid:302)(cid:537)(cid:302)(cid:545)(cid:555)(cid:542) (cid:652)(cid:538)(cid:537)(cid:302)(cid:542)(cid:555)(cid:542) (cid:539)(cid:302)(cid:540)(cid:540)(cid:538)(cid:304)(cid:545)(cid:534)(cid:304)(cid:538)(cid:555)(cid:542) (cid:306)(cid:544)(cid:547) R. solanacearum (cid:304)(cid:652)(cid:538)(cid:306)(cid:547)(cid:534)(cid:548)(cid:528)(cid:542)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538) (cid:541)(cid:304) (cid:306)(cid:536) (cid:548)(cid:545)(cid:530)(cid:305)(cid:536) (cid:306)(cid:550)(cid:542) (cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:555)(cid:542)(cid:652)(cid:544)(cid:547)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:544)(cid:542)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.B. (13) (cid:510)(cid:303)(cid:544)(cid:539)(cid:538)(cid:541)(cid:530)(cid:652)(cid:302)(cid:537)(cid:544)(cid:534)(cid:529)(cid:542)(cid:304)(cid:538)(cid:302)(cid:546)(cid:652)(cid:304)(cid:545)(cid:538)(cid:534)(cid:545)(cid:528)(cid:307)(cid:304)(cid:306)(cid:302)(cid:538)(cid:305)(cid:306)(cid:536)(cid:542)(cid:304)(cid:542)(cid:553)(cid:306)(cid:536)(cid:306)(cid:302) VI.(cid:299). 2998 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) Ενότητα ΙΙ 1.3. Συμπτώματα σε άλλους ξενιστές Φυτά Solanum dulcamara και S. nigrum. Σε φυσικές Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση του Ralstonia συνθήκες, σπανίως παρατηρούνται συμπτώματα μάραν− solanacearum σε κονδύλους πατάτας και σε φυτά σης στα εν λόγω ζιζάνια–ξενιστές, εκτός εάν οι θερμο− πατάτας, τομάτας Ή άλλα φυτά ξενιστές κρασίες του εδάφους υπερβαίνουν τους 25°C ή τα επί− που παρουσιάζουν συμπτώματα καστανησ σήψης ή πεδα του μολύσματος είναι εξαιρετικά υψηλά (π.χ. για το βακτηριακής μάρανσης S. nigrum που αναπτύσσεται δίπλα σε προσβεβλημένα 1. Συμπτώματα (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa. φυτά πατάτας ή τομάτας). Όταν εμφανίζεται μάρανση, eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) τα συμπτώματα που παρατηρούνται είναι όμοια με αυτά 1.1. Συμπτώματα στην πατάτα που περιγράφονται για την τομάτα. Φυτά S. dulcamara Στο φυτό πατάτας. Το αρχικό στάδιο της μόλυνσης που δεν έχουν υποστεί μαρασμό και τα οποία αναπτύσ− στον αγρό αναγνωρίζεται από τον μαρασμό των φύλλων σονται με τα στελέχη και τις ρίζες σε νερό, ενδέχεται να προς την κορυφή του φυτού σε υψηλές θερμοκρασίες εμφανίζουν απαλό καστανό εσωτερικό μεταχρωματισμό κατά τη διάρκεια της ημέρας με ανάληψη κατά τη δι− του αγγειώδους ιστού σε εγκάρσια τομή της βάσης του άρκεια της νύχτας. Στα αρχικά στάδια της μάρανσης στελέχους ή τμημάτων του στελέχους κάτω από το τα φύλλα παραμένουν πράσινα, αλλά αργότερα ανα− νερό. Ενδέχεται να εκρέει βακτηριακή εξίδρωση από πτύσσεται κίτρινη και καστανή νέκρωση. Παρουσιάζεται κομμένους αγγειώδεις ιστούς ή να εκρέουν κλωστές επίσης επιναστία. Η μάρανση ενός βλαστού ή ολόκλη− γλοιώδους υγρού εάν το κομμένο στέλεχος τοποθε− ρων των φυτών σύντομα καθίσταται μη αναστρέψιμη τηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, ακόμη και εάν δεν και έχει ως αποτέλεσμα την κατάρρευση και το θάνατο υπάρχουν συμπτώματα μάρανσης. του φυτού. Ο αγγειώδης ιστός σε εγκαρσίως κομμέ− 2. Δοκιμές ταχείας διαλογής να στελέχη από μαραμένα φυτά συνήθως εμφανίζεται Οι δοκιμές ταχείας διαλογής είναι δυνατόν να διευ− καστανός, και μία γαλακτώδης βακτηριακή εξίδρωση κολύνουν την προκαταρκτική διάγνωση αλλά δεν είναι εκρέει από την κομμένη επιφάνεια, ή μπορεί να εξέλθει απόλυτα αναγκαίες. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ή πε− με συμπίεση. Όταν ένα κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί ρισσότερες από τις ακόλουθες επικυρωμένες δοκιμές: κατακόρυφα μέσα σε νερό, από τις αγγειώδεις δέσμες 2.1. Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού. (Βλέπε ενότητα VI.A.1.) Στον κόνδυλο πατάτας. Οι κόνδυλοι πρέπει να κό− 2.2. Ανίχνευση πολυ−β−υδροξυβουτυρικών (PHB) κοκ− βονται εγκαρσίως κοντά στο σημείο πρόσφυσης του κίων στολονίου είτε κατά μήκος πάνω από το σημείο πρό− Τα χαρακτηριστικά κοκκία PHB στα κύτταρα του R. σφυσης του στολονίου. Το αρχικό στάδιο της ασθένειας solanacearum καθίστανται ορατά διά χρώσεως λεπτών αναγνωρίζεται από έναν υαλώδη κίτρινο προς ανοικτό επιχρισμάτων (που έχουν προσηλωθεί με θερμότητα) καστανό, μεταχρωματισμό του αγγειώδους δακτυλίου βακτηριακού εξιδρώματος από προσβεβλημένο ιστό σε από τον οποίο εκρέει αυθόρμητα μετά λίγα λεπτά ένα αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου με Nile Blue A ή υπόλευκο βακτηριακό εξίδρωμα. Αργότερα, ο αγγειακός Sudan Black (βλέπε ενότητα VI.A.2.). μεταχρωματισμός καθίσταται εντονότερα καστανός 2.3. Δοκιμές οροσυγκόλλησης και η νέκρωση μπορεί να επεκταθεί στον παρεγχυμα− (Βλέπε ενότητα VI.A.3.) τικό ιστό. Σε προχωρημένα στάδια της ασθένειας, η 2.4. Άλλες δοκιμές μόλυνση εκδηλώνεται εξωτερικά από το σημείο πρό− Στις περαιτέρω κατάλληλες δοκιμές ταχείας δια− σφυσης του στολονίου και τους οφθαλμούς από τους λογής συμπεριλαμβάνεται η δοκιμή IF (βλέπε ενότητα οποίους μπορεί να εκρέει βακτηριακό γλοιώδες έκκρι− VI.A.5.), η δοκιμή FISH (βλέπε ενότητα VI.A.7.), οι δοκιμές μα προκαλώντας την προσκόλληση σωματιδίων του ELISA (βλέπε ενότητα VI.A.8.) και οι δοκιμές PCR (βλέπε εδάφους. Ενδέχεται να εμφανίζονται στην επιδερμίδα ερυθροκάστανες, ελαφρώς βυθισμένες κηλίδες λόγω ενότητα VI.A.6). της εσωτερικής κατάρρευσης των αγγειωδών ιστών. Η 3. Διαδικασία απομόνωσης δευτερογενής ανάπτυξη μαλακών σήψεων από μύκητες α) Λαμβάνεται εξίδρωμα ή τμήματα μεταχρωματισμέ− ή βακτήρια είναι συχνή στα προχωρημένα στάδια της νου ιστού από τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου ασθένειας. πατάτας ή τις αγγειώδεις δέσμες του στελέχους πα− 1.2. Συμπτώματα στην τομάτα τάτας, τομάτας ή άλλων μαραμένων φυτών ξενιστών. Στο φυτό τομάτας. Το πρώτο ορατό σύμπτωμα είναι Παρασκευάζεται αιώρημα των ανωτέρω σε μικρό όγκο η έλλειψη σπαργής στα νεαρά φύλλα. Υπό περιβαλλο− αποστειρωμένου αποσταγμένου νερού ή σε 50 mM ρυθ− ντικές συνθήκες που είναι ευνοϊκές για το παθογόνο μιστικού διαλύματος φωσφορικών (προσάρτημα 4) και (θερμοκρασία εδάφους περίπου 25°C, ατμόσφαιρα κο− το αιώρημα αφήνεται για 5−10 λεπτά. ρεσμένη σε υγρασία), μέσα σε λίγες μέρες εμφανίζε− β) Παρασκευάζουμε μία σειρά δεκαδικών αραιώσεων ται επιναστία και μαρασμός της μιας πλευράς ή και του αιωρήματος. ολόκληρου του φυτού, στη συνέχεια δε πλήρης κα− γ) Μεταφέρουμε 50−100 µl του αιωρήματος και των τάρρευση του φυτού. Υπό λιγότερο ευνοϊκές συνθήκες αραιώσεων σε γενικής χρήσεως θρεπτικό υπόστρωμα (θερμοκρασία εδάφους κάτω των 21°C), ο μαρασμός (NA, YPGA ή SPA·βλέπε προσάρτημα 2) ή/και σε υλικό είναι λιγότερος αλλά μπορεί να αναπτύσσεται μεγά− του Kelman με τετραζόλιο (προσάρτημα 2) ή/και σε λος αριθμός τυχαίων ριζών επί του στελέχους. Είναι επικυρωμένο εκλεκτικό υπόστρωμα (π.χ. SMSA, βλέπε δυνατόν να παρατηρούνται βρεγμένες λωρίδες από τη προσάρτημα 2). Απλώνονται ή εξαπλώνονται γραμμωτά βάση του στελέχους πράγμα που αποτελεί απόδειξη με κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υπο− της νέκρωσης του αγγειακού συστήματος. Σε εγκάρ− στρώματος. Αν θεωρηθεί χρήσιμο, παρασκευάζονται σιες τομές του στελέχους, από τους καστανόχρωμα ξεχωριστά τρυβλία με αραιωμένο αιώρημα κυττάρων μεταχρωματισμένους αγγειακούς ιστούς εκρέει λευκή του Ralstonia solanacearum βιοποικιλίας 2 που χρησι− ή υποκίτρινη βακτηριακή εξίδρωση. μοποιείται ως θετικός μάρτυρας. ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2999 δ) Τα τρυβλία επωάζονται για 2−6 ημέρες στους Εάν κατά τη διάρκεια της αφαίρεσης του κώνου από 28 °C. το σημείο πρόσφυσης του στολονίου παρατηρηθούν − Στα γενικής χρήσεως θρεπτικά υποστρώματα, οι ύποπτα συμπτώματα καστανής σήψη,ς θα πρέπει να παθογόνες απομονώσεις R. solanacearum αναπτύσσουν διενεργηθεί μακροσκοπική επιθεώρηση του κονδύλου μαργαριταρώδους χροιάς υπόλευκες, επίπεδες, ακανό− και να κοπεί ο κόνδυλος αυτός κοντά στο σημείο πρό− νιστες και ρευστώδεις αποικίες που εμφανίζουν συχνά σφυσης του στολονίου. Όλοι οι κομμένοι κόνδυλοι με χαρακτηριστικές σπείρες στο κέντρο. Οι μη παθογόνες ύποπτα συμπτώματα πρέπει να διατηρούνται για 2 του− απομονώσεις του R. solanacearum σχηματίζουν μικρές λάχιστον ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου έτσι ώστε στρογγυλές μη ρευστώδεις, βουτυρώδεις αποικίες που να καταστεί δυνατή η φελλοποίηση και στη συνέχεια έχουν εντελώς κρεμ−λευκό χρώμα. να φυλάσσονται στο ψυγείο (4 – 10 °C) υπό τις κατάλ− − Στο υπόστρωμα Kelman με tetrazolium και στο υπό− ληλες συνθήκες καραντίνας. Όλοι οι κόνδυλοι, συμπε− στρωμα SMSA, οι ελικώσεις είναι αιματέρυθρες. Οι μη ριλαμβανομένων εκείνων που παρουσιάζουν ύποπτα παθογόνες απομονώσεις του Ralstonia solanacearum συμπτώματα,, πρέπει να διατηρούνται σύμφωνα με όσα σχηματίζουν μικρές στρογγυλές μη ρευστώδεις, βου− προβλέπονται στο παράρτημα ΙΙΙ. τυρώδεις αποικίες που έχουν εντελώς βαθυκόκκινο 1.1.2. Οι κώνοι που έχουν ληφθεί από το σημείο πρό− χρώμα. σφυσης του στολονίου συλλέγονται σε μη χρησιμοποι− 4. Δοκιμές ταυτοποίησης του R. solanacearum ηθέντες περιέκτες μίας χρήσης, οι οποίοι είναι δυνατόν Οι δοκιμές για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των να είναι κλεισμένοι ή/και σφραγισμένοι (στην περίπτωση πιθανών απομονώσεων του R. solanacearum παρουσι− που οι περιέκτες έχουν ξαναχρησιμοποιηθεί θα πρέπει άζονται στην ενότητα VI.B. να καθαρισθούν επιμελώς και να απολυμανθούν με χλω− ριούχες ενώσεις). Είναι προτιμότερο να υποβάλλονται ΕΝΟΤΗΤΑ ΙΙΙ οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου σε 1. Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτο− κατεργασία αμέσως. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, απο− ποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγματα ασυ− θηκεύονται στον περιέκτη, χωρίς την προσθήκη ρυθμι− μπτωματικών κονδύλων πατάτας στικού διαλύματος, στο ψυγείο για 72 ώρες το ανώτατο 1.1. Προετοιμασία του δείγματος ή σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες το ανώτατο. Σημείωση: Οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου ⎯ Το τυπικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες ανά δοκιμή. Για πιο εντατική δειγματοληψία απαιτού− διαδικασίες: νται περισσότερες δοκιμές σε δείγματα του μεγέθους α) Οι κώνοι καλύπτονται με επαρκή όγκο (περίπου 40 αυτού. Τυχόν μεγαλύτεροι αριθμοί κονδύλων στο δείγ− ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα μα θα έχει ως αποτέλεσμα παρεμπόδιση ή δυσκολίες 4) και αναταρράσσονται σε περιστροφικό αναδευτήρα στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η διαδικασία όμως (50−100 rpm) για 4 ώρες σε θερμοκρασία χαμηλότερη μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των των 24 °C ή για 16−24 ώρες στο ψυγείο. 200 κονδύλων στην περίπτωση που είναι λιγότεροι οι β) Οι κώνοι ομοιογενοποιούνται με επαρκή όγκο (περί− διαθέσιμοι κόνδυλοι. που 40 ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρ− ⎯ Η επικύρωση όλων των μεθόδων ανίχνευσης που τημα 4), είτε σε αναμείκτη (π.χ. Waring ή Ultra Thurax) περιγράφονται στη συνέχεια βασίζεται στη διενέργεια είτε με σύνθλιψη σε σφραγισμένο σάκο διαβροχής μίας δοκιμών σε δείγματα 200 κονδύλων. χρήσης (π.χ. Stomacher ή Bioreba strong guage polythene, ⎯ Το εκχύλισμα πατάτας που περιγράφεται παρακά− 150 mm x 250 mm· αποστειρωμένο διά ακτινοβολίας) τω μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση χρησιμοποιώντας λαστιχένια ματσόλα ή τον κατάλληλο του βακτηρίου της δακτυλιωτής σήψης της πατάτας, εξοπλισμό σύνθλιψης(π.χ. Homex). Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Σημείωση: Ο κίνδυνος επιμόλυνσης των δειγμάτων Προαιρετική προεπεξεργασία πριν από την προετοι− είναι υψηλός όταν τα δείγματα έχουν ομοιογενοποιηθεί μασία του δείγματος: με τη χρήση αναμείκτη. Πρέπει να ληφθούν προφυλάξεις α) Τα δείγματα επωάζονται στους 25−30 °C για διά− για την αποφυγή της δημιουργίας αερολύματος ή υπερ− στημα μέχρι 2 εβδομάδων πριν από τη διενέργεια των χείλισης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εξαγωγής. δοκιμών για την ενθάρρυνση του πολλαπλασιασμού Πρέπει να εξασφαλισθεί ότι για κάθε δείγμα οι λεπί− τυχόν πληθυσμών του R. solanacearum. δες και τα δοχεία του αναμεικτήρα αποστειρώνονται β) Πλένονται οι κόνδυλοι. Χρησιμοποιούνται κατάλλη− λίγο πριν την έναρξη της διαδικασίας. Εάν πρόκειται να λα απολυμαντικά (χλωριούχες ενώσεις εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή PCR, πρέπει να αποφευχθεί χρησιμοποιηθεί η δοκιμή PCR με στόχο την απομάκρυν− η μεταφορά DNA στους περιέκτες ή τον εξοπλισμό ση τυχόν DNA του παθογόνου) και απορρυπαντικά μετά σύνθλιψης. Στις περιπτώσεις που πρόκειται να χρησιμο− από κάθε δείγμα. Οι κόνδυλοι στεγνώνουν στον αέρα. ποιηθεί η PCR, συνιστάται η σύνθλιψη σε σάκους μίας Η ανωτέρω διαδικασία πλύσης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη χρήσης καθώς και η χρήση σωλήνων μίας χρήσης. για δείγματα που περιβάλλονται από υπερβολικό χώμα 1.1.3. Το υπερκείμενο υγρό μεταγγίζεται. Εάν το υγρό καθώς και στην περίπτωση που πρόκειται να εφαρμο− εμφανίζεται υπερβολικά θολό, καθίσταται διαυγές είτε σθεί η δοκιμή PCR ή η διαδικασία άμεσης απομόνωσης, με φυγοκέντριση σε χαμηλή ταχύτητα (όχι περισσότερο αλλά δεν είναι υποχρεωτική. από 180 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 4−10°C) είτε με 1.1.1. Με ένα καθαρό και απολυμασμένο νυστέρι ή ειδικό διήθηση (40−100 µm) με αντλία κενού, πλένοντας το μαχαίρι λαχανικών, αφαιρείται η επιδερμίδα γύρω από φίλτρο με πρόσθετο (περίπου 10 ml) ρυθμιστικό διάλυμα το σημείο πρόσφυσης του στολονίου του κονδύλου εξαγωγής. έτσι ώστε να φανούν οι αγγειώδεις ιστοί. Αποκόπτουμε 1.1.4. Το βακτηριακό κλάσμα συγκεντρώνεται με φυ− με προσοχή ένα μικρό κώνο αγγειώδους ιστού από το γοκέντριση σε 7.000 g για 15 λεπτά (ή 10.000 g για 10 σημείο πρόσφυσης του στολονίου και προσέχουμε ώστε λεπτά) σε θερμοκρασία 4−10 °C και το υπερκείμενο υγρό η αφαιρούμενη ποσότητα μη αγγειώδους ιστού να είναι απορρίπτεται χωρίς να διαταραχθεί το ίζημα. η ελάχιστη δυνατή. 1.1.5. Το ίζημα αναδιαλύεται σε 1,5 ml ρυθμιστικού δι− (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/ αλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4). Χρησιμοποιούνται sanco/Home/main). 500 µl για το R. solanacearum, 500 µl για το Clavibacter Σημείωση: Κάθε κόνδυλος (με σήψη) που παρουσιάζει michiganensis subsp. sepedonicus και 500 µl για σκο− ύποπτα συμπτώματα της ασθένειας αφήνεται παράμερα πούς αναφοράς. Προστίθεται αποστειρωμένη γλυκερίνη και εξετάζεται χωριστά. σε τελική συγκέντρωση 10−25% (v/v) στα 500 µl της 3000 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) κατάλληλης ποσότητας αναφοράς και στην εναπο− να ανιχνευθούν καθ’ όλη τη διάρκεια του έτους στο μείνασα κατάλληλη ποσότητα δοκιμής, ανακατεύουμε πολυετές φυτό Solanum dulcamara που αναπτύσσεται με στροβιλισμό (vortex) και αποθηκεύουμε στους −16 στα υδατορεύματα. Γνωστοί ξενιστές είναι τα φυτά εθε− έως −24 °C (εβδομάδες) ή στους −68 έως −86 C (μήνες). λοντές της πατάτας, το Solanum dulcamara, το S. nigrum, Οι ποσότητες δοκιμών διατηρούνται σε θερμοκρασία το Datura stramonium και άλλα είδη της οικογένειας 4−10 °C κατά τη διεξαγωγή των δοκιμών. των σολανωδών (Solanaceae). Άλλοι ξενιστές είναι το Δεν συνιστάται η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και Pelargonium spp. και το Portulaca oleracea. Ορισμένα ευ− απόψυξη. ρωπαϊκά είδη ζιζανίων, τα οποία δύνανται ενδεχομένως Εάν απαιτείται η μεταφορά του εκχυλίσματος, πρέπει να φιλοξενούν πληθυσμούς R. solanacearum βιοποικιλίας να εξασφαλισθεί ότι η διανομή θα πραγματοποιηθεί σε 2, φυλής 3 στις ρίζες ή/και τις ριζόσφαιρες υπό ειδι− ψυκτικό δοχείο εντός 24 έως 48 ωρών. κές περιβαλλοντικές συνθήκες είναι τα Atriplex hastata, 1.1.6. Είναι επιτακτικό όπως όλοι οι θετικοί μάρτυρες Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, του R. solanacearum και τα δείγματα κατεργάζονται Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus χωριστά, ώστε να αποφεύγεται η επιμόλυνση. Το ίδιο scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., ισχύει και για τις αντικειμενοφόρους της δοκιμής IF και Tussilago farfarra και Urtica dioica. για όλες τις δοκιμές. Σημείωση: Στο στάδιο αυτό μπορεί να γίνει μακροσκο− 1.2. Διενέργεια δοκιμών πική εξέταση για εσωτερικά συμπτώματα (χρώση του Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των αγγειώδους ιστού ή βακτηριακό εξίδρωμα). Αφήνουμε δοκιμών και των βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων στα παράμερα όλα τα τμήματα στελεχών που παρουσιά− σχετικά προσαρτήματα: ζουν συμπτώματα και τα εξετάζουμε ξεχωριστά (βλέπε Εκλεκτική απομόνωση (βλέπε ενότητα VI.A.4.) Δοκιμή IF (βλέπε ενότητα VI.A.5) ενότητα ΙΙ). Δοκιμές PCR (βλέπε ενότητα VI.A.6.) 2.1.2. Τα τμήματα στελεχών απολυμαίνονται για σύντο− Δοκιμή FISH (βλέπε ενότητα VI.A.7.) μο χρονικό διάστημα με αιθανόλη 70% και στεγνώνονται Δοκιμές ELISA (βλέπε ενότητα VI.A.8.) αμέσως με απορροφητικό χαρτί. Ακολούθως τα τμήματα Βιοδοκιμή (βλέπε ενότητα VI.A.9.) στελεχών υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις 2. Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυ− ακόλουθες διαδικασίες: είτε, τοποίηση του R. solanacearum σε δείγματα ασυμπτω− α) Τα τμήματα καλύπτονται με επαρκή όγκο (περίπου 40 ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα ματικών φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων φυτών ξε− 4) και αναταρράσσονται σε περιστροφικό αναδευτήρα νιστών (50−100 rpm) για 4 ώρες σε θερμοκρασία χαμηλότερη 2.1. Προετοιμασία του δείγματος των 24 °C ή για 16−24 ώρες στο ψυγείο ή Σημείωση: Για την ανίχνευση των λανθανόντων πληθυ− β) Υποβάλλονται σε κατεργασία αμέσως με σύνθλιψη σμών του R. solanacearum συνιστάται ο έλεγχος σύνθετων των τμημάτων εντός ανθεκτικού σάκκου διαβροχής (π.χ. δειγμάτων. Η διαδικασία είναι δυνατόν να εφαρμοσθεί κα− Stomacher ή Bioreba) με τον κατάλληλο όγκο ρυθμιστι− τάλληλα και για σύνθετα δείγματα με έως 200 τμήματα κού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4) χρησιμοποι− στελεχών. Εάν πραγματοποιούνται επισκοπήσεις, αυτές ώντας λαστιχένια ματσόλα ή τον κατάλληλο εξοπλισμό πρέπει να βασίζονται σε στατιστικά αντιπροσωπευτικό σύνθλιψης (π.χ. Homex). Στην περίπτωση που αυτό δεν δείγμα του πληθυσμού φυτών υπό εξέταση. είναι δυνατόν, τα τμήματα στελέχους αποθηκεύονται 2.1.1. Τα τμήματα στελεχών 1−2 cm συλλέγονται σε στο ψυγείο για χρονικό διάστημα 72 ωρών το μέγιστο κλειστό αποστειρωμένο περιέκτη σύμφωνα με τις ακό− ή σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 24 λουθες διαδικασίες δειγματοληψίας: ωρών το μέγιστο. Σπορόφυτα τομάτας φυτωρίου: Με ένα καθαρό και 2.1.3. Το υπερκείμενο υγρό μεταγγίζεται αφού κατα− απολυμασμένο μαχαίρι, αφαιρείται τμήμα 1 cm από τη καθίσει για 15 λεπτά. βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το έδαφος. 2.1.4. Περαιτέρω διαύγαση του εκχυλίσματος ή της Φυτά τομάτας που έχουν αναπτυχθεί στον αγρό ή συγκέντρωσης του βακτηριακού κλάσματος δεν απαι− σε θερμοκήπιο: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μα− χαίρι, απομακρύνουμε το χαμηλότερο πλευρικό βλαστό τείται συνήθως αλλά είναι δυνατόν να επιτευχθεί με από κάθε φυτό κόβοντας ακριβώς πάνω από το σημείο διήθηση ή/και φυγοκέντριση όπως περιγράφεται στην ένωσης με το κύριο στέλεχος. Απομακρύνουμε το χα− ενότητα III.1.1.3 – 1.1.5. μηλότερο τμήμα ενός εκατοστού από κάθε πλευρικό 2.1.5. Το αδιάλυτο ή συγκεντρωμένο εκχύλισμα δείγ− βλαστό. ματος χωρίζεται σε 2 ίσα μέρη. Το ήμισυ διατηρείται Άλλοι ξενιστές: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο σε 4−10 °C κατά τη διεξαγωγή της δοκιμής και το άλλο μαχαίρι ή κλαδευτική ψαλίδα, αφαιρείται τμήμα 1 cm μισό φυλάσσεται με 10−25% (v/v) αποστειρωμένη γλυ− από τη βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το κερίνη σε θερμοκρασία –16 έως –24°C (εβδομάδες) ή σε έδαφος. Στην περίπτωση του S. dulcamara ή άλλων θερμοκρασία –68 έως –86 C (μήνες) για την περίπτωση φυτών ξενιστών που αναπτύσσονται στο νερό, αφαι− που χρειασθεί η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών. ρούμε τμήματα (1−2 cm) από τα στελέχη ή στολόνια 2.2. Διενέργεια δοκιμών που βρίσκονται κάτω από το νερό και τα οποία έχουν Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των αναπτύξει ρίζες μέσα στο νερό. δοκιμών και των βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων στα Όταν πραγματοποιείται δειγματοληψία σε μια συγκε− σχετικά προσαρτήματα: κριμένη τοποθεσία, συνιστάται η εξέταση στατιστικά Εκλεκτική απομόνωση (βλέπε ενότητα VI.A.4.) αντιπροσωπευτικού δείγματος τουλάχιστον 10 φυτών Δοκιμή IF (βλέπε ενότητα VI.A.5) ανά σημείο δειγματοληψίας κάθε πιθανού ζιζάνιου – ξε− Δοκιμές PCR (βλέπε ενότητα VI.A.6.) νιστή. Η ανίχνευση του παθογόνου είναι περισσότερο Δοκιμή FISH (βλέπε ενότητα VI.A.7.) αξιόπιστη κατά τα τέλη της άνοιξης, το καλοκαίρι και το Δοκιμές ELISA (βλέπε ενότητα VI.A.8.) φθινόπωρο, αν και οι φυσικές μολύνσεις είναι δυνατόν Βιοδοκιμή (βλέπε ενότητα VI.A.9.) ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 3001 3002 ΕΦΗΜΕΡΙΣ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ (ΤΕΥΧΟΣ ΠΡΩΤΟ) 2. Μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. λέσματα μεγάλης αραιώσεως που ενδέχεται να κατα− solanacearum στο νερό στήσουν ασαφή την παρουσία του παθογόνου. Αρχή − Πρέπει να λαμβάνονται δείγματα επιφανειακών υδά− Το επικυρωμένο σχήμα ανίχνευσης που περιγράφε− των που βρίσκονται κοντά σε φυτά ξενιστές εάν τα εν ται στην ενότητα αυτή, εφαρμόζεται για την ανίχνευση λόγω φυτά υπάρχουν. του παθογόνου σε δείγματα επιφανειακών υδάτων και 2.1.1. Σε επιλεγμένα σημεία δειγματοληψίας, συλλέ− μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί για την εξέταση δειγ− γουμε δείγματα νερού γεμίζοντας αποστειρωμένους μάτων λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων σωλήνες ή φιάλες μίας χρήσεως, εάν είναι δυνατόν, υδάτων. Είναι σημαντικό, ωστόσο, να σημειωθεί ότι η σε βάθος κάτω των 30 cm και εντός αποστάσεως 2 αναμενόμενη ευαισθησία της ανίχνευσης θα ποικίλλει m από την όχθη. Όσον αφορά τα λύματα κατεργασί− ανάλογα με το υπόστρωμα. Η ευαισθησία της δοκιμής ας και ακάθαρτων υδάτων, συλλέγουμε δείγματα από απομόνωσης επηρεάζεται από τους πληθυσμούς των το σημείο εκροής των λυμάτων. Συνιστώνται μεγέθη ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων που είναι δειγμάτων έως 500 ml ανά σημείο δειγματοληψίας. Εάν συνήθως κατά πολύ περισσότεροι στα λύματα κατερ− προτιμώνται μικρότερα δείγματα, συνιστάται η λήψη γασίας πατάτας και ακάθαρτων υδάτων απ’ ό,τι στα δειγμάτων σε τουλάχιστον 3 περιπτώσεις ανά σημείο επιφανειακά ύδατα. Ενώ το σχήμα που ακολουθεί ανα− δειγματοληψίας, και κάθε δείγμα να αποτελείται από μένεται να ανιχνεύσει τόσο λίγα όσο 103 κύτταρα ανά 2 επαναληπτικά υπο−δείγματα τουλάχιστον των 30 ml. λίτρο σε επιφανειακά ύδατα, η ευαισθησία ανίχνευσης Για εντατική εργασία επισκόπησης, επιλέγουμε τουλά− σε λύματα κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων χιστον 3 σημεία δειγματοληψίας ανά 3 χλμ υδάτινου είναι πιθανόν να είναι κατά πολύ μικρότερη. Για το λόγο ρεύματος και εξασφαλίζουμε ότι διενεργείται δειγμα− αυτό, συνιστάται η εξέταση λυμάτων μετά από κάθε τοληψία και στους παραπόταμους που εισέρχονται στο εργασία καθαρισμού (π.χ. καθίζηση ή διήθηση) κατά την υδάτινο ρεύμα. οποία μειώνονται οι πληθυσμοί των σαπροφυτικών βα− 2.1.2. Τα δείγματα μεταφέρονται σε συνθήκες ψύχους κτηρίων. Οι περιορισμοί όσον αφορά την ευαισθησία του και σκότους (4−10 °C) και εξετάζονται εντός 24 ωρών. σχήματος δοκιμών πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά 2.1.3. Εάν είναι απαραίτητο, το βακτηριακό κλάσμα την αξιολόγηση της αξιοπιστίας οιωνδήποτε αρνητικών μπορεί να συγκεντρωθεί χρησιμοποιώντας μία από τις αποτελεσμάτων. Παρά το γεγονός ότι το εν λόγω σχήμα ακόλουθες μεθόδους: έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε εργασίες επισκόπη− α) Τα υπο−δείγματα των 30−50 ml φυγοκεντρούνται σης για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή απουσίας σε 10.000 g για 10 λεπτά (ή 7.000 g για 15 λεπτά) κατά του παθογόνου σε επιφανειακά ύδατα, οι περιορισμοί προτίμηση στους 4−10 °C, απορρίπτεται το υπερκείμενο που το συνοδεύουν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 1 ml ρυθμιστικού χρησιμοποιείται σε παρόμοιες επισκοπήσεις λυμάτων διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4). κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων. β) Διήθηση από μεμβράνη (ελάχιστο μέγεθος πόρων 2.1. Προετοιμασία του δείγματος 0,45 µm) ακολουθούμενη από πλύση του φίλτρου σε 5−10 Σημείωση: − Η ανίχνευση του R. solanacearum σε επιφανειακά ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος και παρακράτηση ύδατα είναι πιο αξιόπιστη κατά τα τέλη της άνοιξης, το των εκπλυμάτων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται για με− καλοκαίρι και το φθινόπωρο όταν η θερμοκρασία του γαλύτερους όγκους νερού που περιέχουν μικρότερους ύδατος υπερβαίνει τους 15 °C. αριθμούς σαπροφύτων. − Η επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία σε διαφορετι− Η συγκέντρωση δεν συνιστάται συνήθως για δείγματα κές χρονικές στιγμές κατά την προαναφερθείσα χρονική λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων περίοδο σε προσδιορισθέντα σημεία δειγματοληψίας θα καθώς αυξημένοι πληθυσμοί ανταγωνιστικών σαπροφυ− ενισχύσει την αξιοπιστία της ανίχνευσης μειώνοντας τις τικών βακτηρίων θα παρεμποδίζουν την ανίχνευση του επιδράσεις των κλιματικών μεταβολών. Ralstonia solanacearum. − Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις των 2.2. Διενέργεια δοκιμών ισχυρών βροχοπτώσεων και της γεωγραφίας των υδά− Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των τινων ρευμάτων έτσι ώστε να αποφεύγονται τα αποτε− δοκιμών στα σχετικά προσαρτήματα.