Genetische und physiologische Charakterisierung von Hanseniaspora uvarum

151 Pages·2016·6.7 MB·English

„Genetische und physiologische Charakterisierung von
Hanseniaspora uvarum“

Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

Universität Osnabrück
Fachbereich Biologie/Chemie
Abteilung Genetik

vorgelegt von
M. Sc. Anne-Kathrin Langenberg
Osnabrück, August 2016

Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Forschungsring des
Deutschen Weinbaus (FDW) finanziert.

Erstgutachter: Prof. Dr. Jürgen J. Heinisch
Zweitgutachter: Prof. Dr. Hans Merzendorfer

In h a lt sverz eich n i s

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................................. 5
1.1 Die Weinhefe Hanseniaspora uvarum ............................................................................ 6
1.2 Wesentliche Veränderungen in der genetischen Ausstattung von Hefen während ihrer
Evolution .......................................................................................................................... 7
1.3 Genetische Untersuchungen zu H. uvarum ................................................................... 11
1.4 Zuckerstoffwechsel ...................................................................................................... 11
1.4.1 Zuckeraufnahme ............................................................................................................ 13
1.4.2 Alkoholische Gärung ...................................................................................................... 14
1.5 Aromabildung im Wein ................................................................................................ 17
1.5.1 Ester ............................................................................................................................... 18
1.5.2 Höhere Alkohole ............................................................................................................ 18
1.5.3 Terpenoide .................................................................................................................... 19
1.5.4 Flüchtige Säuren ............................................................................................................ 19
1.5.5 Carbonylverbindungen .................................................................................................. 20
1.5.6 Flüchtige Schwefelverbindungen .................................................................................. 20
1.6 Zielsetzung .................................................................................................................. 21
2 Material und Methoden ...................................................................................................... 24
2.1 Material ...................................................................................................................... 24
2.1.1 Stämme von Hefen und Bakterien ................................................................................ 24
2.1.2 Oligonukleotide ............................................................................................................. 26
2.1.3 Kultivierung ................................................................................................................... 30
2.2 Methoden ................................................................................................................... 31
2.2.1 Isolierung von DNA ........................................................................................................ 31
2.2.2 Molekulargenetische Methoden ................................................................................... 32
2.2.3 Methoden zur Transformation in Hefe ......................................................................... 34
2.2.4 Mutagenisierung von H. uvarum mit Nocodazol und EMS ........................................... 36
2.2.5 Wachstumsversuche ..................................................................................................... 36
2.2.6 Proteinanalysen ............................................................................................................. 36
2.2.7 Gelelektrophoretische Karyotypisierung ...................................................................... 40
2.2.8 Southernanalyse ............................................................................................................ 41
3 Ergebnisse .......................................................................................................................... 45
3.1 Genetische Typisierung ................................................................................................ 46
In h a lt sverz eich n i s

3.1.1 Gelelektrophoretische Karyotypisierung ...................................................................... 46
3.1.2 Vergleich der Genomgrößen ......................................................................................... 48
3.1.3 Einsatz einer „Fingerprint“-Methode zur schnellen Stammidentifizierung .................. 50
3.2 Entschlüsselung des Genoms des H. uvarum-Typstamms .............................................. 53
3.2.1 Genomsequenz von H. uvarum – Sequenzierung und Assemblierung ........................ 53
3.2.2 Annotierung des Genoms von H. uvarum ..................................................................... 54
3.3 Aufbau des H. uvarum Genoms .................................................................................... 56
3.3.1 Der rRNA-Gen-Cluster ................................................................................................... 56
3.3.2 Analyse möglicher Telomersequenzen von H. uvarum ................................................. 59
3.3.3 Ansätze zur weiteren Assemblierung des Genoms von H. uvarum .............................. 60
3.4 Physiologische Untersuchungen ................................................................................... 72
3.4.1 Genetische und physiologische Analysen von Hexosetransporter-Orthologen in H.
uvarum .......................................................................................................................... 73
3.4.2 Identifizierung der für den Gärungsstoffwechsel kodierenden Gene in H. uvarum - ein
interspezifischer Sequenzvergleich ............................................................................... 76
3.4.3 Wachstum auf fermentierbaren und nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen ........ 79
3.4.4 Vergleichende Untersuchungen der spezifischen Aktivitäten von Glykolyseenzymen 80
3.4.5 Heterologe Expression der Phosphofruktokinase, Pyruvatkinase und
Alkoholdehydrogenase aus H. uvarum ......................................................................... 82
3.4.6 Nähere Charakterisierung der Phosphofruktokinase-Untereinheiten aus H. uvarum
mittels Westernblot-Analyse ......................................................................................... 84
3.5 Identifizierung aromaaktiver Enzyme in H. uvarum ....................................................... 85
3.6 Ansätze zur Etablierung eines Transformationssystems ................................................ 89
4 Diskussion .......................................................................................................................... 93
4.1 „Fingerprint“-Methode zur schnellen Stammidentifizierung ......................................... 94
4.2 Genomanalysen ........................................................................................................... 95
4.2.1 Chromosomen- und Genomgröße ................................................................................ 96
4.2.2 Verbesserung von Genomassemblierung und -annotierung ........................................ 98
4.3 Physiologische Untersuchungen .................................................................................. 100
4.3.1 Zuckeraufnahme .......................................................................................................... 100
4.3.2 Unterschiede des Gärungsstoffwechsels .................................................................... 101
4.3.3 Aromarelevante Gene in H. uvarum............................................................................ 103
4.3.4 Ansätze zur genetischen Manipulation ....................................................................... 106
4.4 Phylogenetische Einordnung von H. uvarum und Evolution des Genoms ...................... 107
In h a lt sverz eich n i s

4.5 Ausblick ..................................................................................................................... 110
5 Zusammenfassung ............................................................................................................. 113
6 Summary ........................................................................................................................... 115
7 Quellenverzeichnis ............................................................................................................. 117
8 Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................... 126
9 Anhang .............................................................................................................................. 130
10 Danksagung ....................................................................................................................... 144
11 Lebenslauf ......................................................................................................................... 145
12 Eidesstattliche Erklärung .................................................................................................... 147

EINLEITUNG
6 | E in leit u n g
1 Einleitung
Schon seit Jahrtausenden werden Hefen in der Herstellung von Wein, Bier und Brot eingesetzt
(Barnett 2003). Während der gebildete Alkohol die Basis von Getränken wie Bier und Wein darstellt,
aber auch im Mittelpunkt der Treibstoffherstellung (Bioethanol) steht, ist Kohlenstoffdioxid ein
wichtiger Bestandteil von Bier und von Hefeteigen. Hier ist die Wein-, Bier- und Bäckerhefe
Saccharomyces cerevisiae von großer Bedeutung. Sie wird als Reinzuchtkultur eingesetzt und erlaubt
aufgrund von jahrelanger Züchtung und Erfahrung eine sichere Gärführung und garantiert somit eine
gleichbleibende Qualität des Endprodukts. Ein zunehmender Trend in der Weinherstellung ist die
Nutzung der sogenannten Spontangärung, in der die endogenen Hefen von Trauben Teil des
Fermentationsprozesses sind und erheblichen Einfluss auf die Aromazusammensetzung des Weins
nehmen können. Auf diesem Wege können sensorisch vielfältigere Weine hergestellt werden als es
mit S. cerevisiae allein möglich wäre (Lambrechts & Pretorius 2000, Mendoza & Farías 2010,
Cordente et al. 2012).
1.1 Die Weinhefe Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora uvarum gehört zu der endogenen Hefeflora, die natürlicherweise auf Trauben, aber
auch auf Agaven, Sternfrüchten oder Äpfeln vorkommt (Romano & Marchese 1998, Arellano et al.
2008, De Arruda Moura Pietrowski et al. 2012). Die Populationen auf Trauben bestehen
hauptsächlich aus Nicht-Saccharomyceten der Gattungen Candida, Metschnikowia, Torulaspora,
Zygosaccharomyces und Hanseniaspora und variieren in ihrer zahlenmäßigen Zusammensetzung je
nach Rebsorte und Anbaugebiet. Doch die vorherrschende Spezies der gesamten Hefepopulation auf
Trauben mit 50 - 75 % stellt H. uvarum dar (Pretorius 2000, Zohre & Erten 2002, Medina et al. 2013,
Grangeteau et al. 2015, Tristezza et al. 2016). Diese Hefe behauptet sich in den ersten sechs Tagen
der sogenannten spontanen Weingärung und wird dann von der nur rar auf Trauben vertretenen
Spezies S. cerevisiae verdrängt, die den Fermentationsprozess des Weins übernimmt und nach etwa
28 Tagen abschließt (Zohre & Erten 2002, Grangeteau et al. 2015). Insbesondere in dieser ersten
Phase der Gärung werden viele Aromastoffe gebildet, die den Geruch und den Geschmack des
produzierten Weins entscheidend prägen. Abhängig von der Art und Zusammensetzung dieser
Verbindungen kann es zu erheblichen Qualitätsverlusten kommen. Die Bildung von Acetat ist hier auf
der negativen Seite einzuordnen - während S. cerevisiae nur geringe Mengen von etwa 0,2 g/l bildet,
werden in Ansätzen mit H. uvarum deutlich höhere Konzentrationen von bis zu 2,5 g/l erreicht (Zohre
& Erten 2002, De Benedictis et al. 2011). Dieser hohe Säureanteil stellt einen der Hauptgründe für die
generelle Einstufung von H. uvarum als schädlich für die Weinbereitung dar. Dennoch haben die
besonderen metabolischen Eigenschaften dieser Weinhefe, durch die ein deutlich komplexerer,