Genetic and Proteomic Basis of Abiotic Stress Responses in Barley

123 Pages·2012·5.22 MB·English

by  Jarod Rollins

Genetic and Proteomic Basis of Abiotic Stress
Responses in Barley (Hordeum vulgare)

Inaugural‐Dissertation 
Zur 
Erlangung des Doktorgrades 
der Mathematisch‐Naturwissenschaftlichen Fakultät 
der Universität zu Köln

vorgelegt von 
JAROD ROLLINS 
aus Waterville, Maine 
Vereinigte Staaten von Amerika 

Köln, 2012

Die vorliegende Arbeit wurde am Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung in Köln
in der Abteilung für Entwicklungsbiologie der Pflanzen (Direktor: Prof. Dr. G. Coupland)
angefertigt.  

Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Martin Hülskamp

Berichterstatter: Prof. Dr. George Coupland
Prof. Dr. Ute Höcker

Prüfungsdatum : Oktober 11th 2012

Abstract  
Drought and heat stress are the two leading abiotic stresses that limit crop productivity. Understanding 
the range of responses that a model crop like barley can exhibit in different environments to avoid or 
tolerate stress will be crucial in unraveling the basis of abiotic stress resistance. The objectives of the 
present study were to identify i) morphological and physiological traits associated with abiotic stress 
resistance, ii) genetic loci linked to agronomic performance traits under drought, and iii) proteins 
differentially regulated in response to heat and drought stress.  
A barley recombinant inbred line population derived from a cross between the Syrian landrace 
Arta and the Australian cultivar Keel was grown in a greenhouse under well watered conditions and 
subjected to drought treatment that began at anthesis and persisted until maturity. Using genotyping 
data from over 700 genetic markers, a multi‐environmental quantitative trait loci (QTL) analysis of 
morphological and physiological traits was performed. For the proteomic analysis, Arta and Keel were 
grown in a growth chamber under well watered conditions and subjected to drought, high temperature, 
or a combination of both treatments starting at anthesis. The leaf proteome of Arta and Keel were 
visualized and changes in protein spot abundance due to the stress treatments were quantified using 
difference gel electrophoresis (DIGE). Mass spectrometry was used to identify protein spots excised from 
the gels.  
The drought treatment was characterized by morphological plasticity and stability on the 
physiological and proteomic level. In contrast, the heat treatment caused perturbations on the 
physiological and proteomic level which were more prominent than the morphological responses that 
occurred. The QTL analysis revealed nineteen loci for traits associated with agronomic and physiological 
performance under drought. The proteomic analysis identified 99 protein spots differentially regulated in 
response to the heat treatment, 14 of which were regulated in a genotype specific manner. Differentially 
regulated proteins with potential roles in the observed morphological and physiological changes under 
heat stress included photosynthetic proteins Rusbisco activase B and chlorophyll a‐b binding proteins in 
addition to the glycolytic enzymes fructose‐bisphosphate aldolase and glyceraldehyde‐3‐phosphate 
dehydrogenase. Of the stress responsive traits, significant differences in plant height, spike fertility, and 
photosynthetic performance were detected between Arta and Keel. Altogether, the detection of genetic 
variation in traits responsive to abiotic stress and in protein abundance represent unique stress adaption 
mechanisms which can be exploited in future crop breeding efforts.

Zusammenfassung 
Trockenheit und Hitze sind die zwei führenden abiotischen Stressfaktoren, die sich limitierend 
auf den Ernteertrag auswirken. Ein Verständnis davon welche umfangreichen Reaktionen eine 
Modelpflanze wie Gerste – wenn unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt – aufweisen kann, 
um Stressfaktoren zu umgehen, beziehungsweise zu tolerieren, wäre entscheidend bei der Aufklärung 
abiotischer tressresistenz. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von i) 
morphologische und physiologische Reaktionen auf Stress durch Hitze und Trockenheit, ii) genetischen 
Loci, welche mit agronomischen Merkmalen bezüglich der Ertragsleistung unter trockenen Bedingungen, 
verbunden sind und iii) Proteinen, die als Reaktion auf Hitze und Trockenheit unterschiedlich reguliert 
werden. 
Eine durch rekombinante Zucht erzeugte Gerstensorte, die eine Kreuzung aus der syrischen 
Landgerste Arta und der australischen Sorte Keel ist, wurde in einem Gewächshaus unter guten 
Bewässerungsbedingungen gewachsen, und anschließend einer Trockenheitsbehandlung, beginnend mit 
der Anthesis und die bis zur Reife anhielt, unterzogen. Unter Verwendung von genotypischen Daten von 
über 700 genetischen Markern wurde eine Multi‐umweltbedingte‐Merkmal‐Loci Analyse (engl.: multi‐
environmental quantitative trait loci (QTL)) morphologischer und physiologischer Merkmale 
durchgeführt. Für die proteomische Analyse wurden die parentalen Linien Arta und Keel in einem 
Gewächshaus unter guten Bewässerungsbedingungen gewachsen und mit der Anthesis startend 
folgenden Bedingungen ausgesetzt: Trockenheit, erhöhten Temperaturen, oder einer Kombination 
dieser beiden Bedingungen. Das Blattproteom von Arta und Keel wurde visualisiert, und mittles 2D‐
Gelelektrophorese (engl.: difference gel electrophoresis (DIGE)) wurde eine Änderung in der Menge an 
Proteinflecken (protein spots) aufgrund der Stressbehandlungen quantifiziert. Für die Identifizierung der 
aus den Gelen herausgeschnittenen Proteinflecken wurde Massenspektronomie genutzt. 
Die Trockenheitsbehandlung war durch morphologische Plastizität und einer Beständigkeit auf 
physiologischer und proteomischer Ebene charakterisiert. Im Gegensatz dazu hatte eine 
Hitzebehandlung einen markanteren Störeinfluss auf die Pflanzenphysiologie und Proteinanreicherung 
als auf die Morphologie. Die QTL Analysen ließen 19 Loci erkennen für Merkmale, die mit einer 
agronomischen und physiologischen Leistung in Zusammenhang stehen. Durch die Proteomanalyse der 
parentalen Linien ließen sich 99 Proteine (Proteinflecken) identifizieren, die als Reaktion auf die 
Hitzebehandlung unterschiedlich reguliert wurden, 14 davon wurden in Abhängigkeit des Genotyps 
unterschiedlich reguliert. Der Großteil dieser unterschiedlich regulierten Proteine spielt eine Rolle im 
Stoffwechsel und der Photosynthese. Unterschiedlich regulierte Proteine mit möglichen Funktionen
verantwortlich für die beobachteten morphologischen und physiologischen Veränderungen als Reaktion 
auf Hitzebehandlung, schließen photosynthetische Proteine Rusbisco Aktivase B, Chlorophyll a‐b 
bindende Proteine, als auch Glykolytische Enzyme wie Fructosebiphosphataldolase und Glyceraldehyd‐3‐
Phosphatdehydrogenase ein. Einige Merkmale, die Stressabhängig zu sein scheinen, wie z.B. 
Pflanzengröße, Fertilität der Ähren und die photosynthetische Leistung, haben sich zwischen den zwei 
Genotypen unter Stressbehandlung deutlich unterschieden. Zusammenfassend erlaubt eine Erkennung 
der genetischen Variationen dieser stressabhängigen Merkmale sowie der Häufigkeit an Proteinen, dass 
diese Eigenschaften für spätere Züchtungen ausgenutzt werden.
Table of contents 
Chapter One ‐ QTL Analysis of Agronomic Traits in Barley Under Water Limited Conditions ...................... 1 
Introduction ............................................................................................................................................... 1 
Barley is a model crop with worldwide agricultural importance .......................................................... 1 
Molecular responses to drought ........................................................................................................... 2 
Quantitative trait loci for drought resistance ....................................................................................... 4 
Development dependent responses to drought ................................................................................... 5 
Materials and methods ............................................................................................................................. 6 
Experimental overview .......................................................................................................................... 6 
Plant material ........................................................................................................................................ 6 
Drought treatment ................................................................................................................................ 7 
Physiological measurements ................................................................................................................. 8 
Morphological and agronomic measurements ..................................................................................... 8 
Statistical analysis .................................................................................................................................. 9 
Linkage mapping .................................................................................................................................... 9 
Quantitative trait loci analysis ............................................................................................................. 10 
Results ..................................................................................................................................................... 10 
Robustness of barley physiology despite drought .............................................................................. 10 
Reduction in grain yield and yield components due to drought stress .............................................. 12 
Evaluation of agronomic traits under drought stress ......................................................................... 15 
Phenotypic variation of traits due to genotype and drought conditions ............................................ 16 
Genetic correlations of traits to yield under control and drought conditions .................................... 17 
QTL for agronomic traits ..................................................................................................................... 18 
Discussion ................................................................................................................................................ 23 
Reduction of growth and yield in the absence of physiological stress ............................................... 23 
Genotype specific environmental responses ...................................................................................... 24 
Clustering of QTL ................................................................................................................................. 25 
Confirmed and novel QTL .................................................................................................................... 26 
Conclusion ............................................................................................................................................... 28
Chapter Two ‐ Leaf Proteome Analysis of Barley Subjected to Drought and Heat Stress .......................... 30 
Introduction ............................................................................................................................................. 30 
Molecular responses to abiotic stress ................................................................................................. 31 
Quantitative proteomics ..................................................................................................................... 32 
Materials and Methods ........................................................................................................................... 34 
Experimental overview ........................................................................................................................ 34 
Plant material ...................................................................................................................................... 34 
Drought and heat treatments ............................................................................................................. 34 
Physiological measurements ............................................................................................................... 35 
Morphological and agronomic measurements ................................................................................... 36 
Protein extraction ................................................................................................................................ 37 
Fluorescent labeling of proteins .......................................................................................................... 37 
Two dimensional gel electrophoresis .................................................................................................. 38 
Colloidal Coomassie Brilliant Blue staining ......................................................................................... 39 
Gel image analysis ............................................................................................................................... 39 
Protein identification ........................................................................................................................... 39 
Annotation of identified proteins with gene ontology terms ............................................................. 40 
Singular Enrichment Analysis .............................................................................................................. 41 
Statistical analysis ................................................................................................................................ 41 
Results ..................................................................................................................................................... 42 
Single and combined effects of drought and heat treatments on physiological traits over time ...... 42 
Single and combined effects of drought and heat stress on morphological traits ............................. 47 
Phenotypic variation of traits due to main and interacting effects of the genotype and treatments 53 
Phenotypic correlation of traits to grain yield under control and high temperature treatments ...... 55 
Mapping and characterization of the barley leaf proteome ............................................................... 56 
Quantification of differentially expressed proteins ............................................................................ 57 
Differential regulation of proteins in response to heat treatments ................................................... 60 
Differential protein expression due to genotype ................................................................................ 63 
Interacting effects of genotype and heat on protein abundance ....................................................... 65 
Discussion ................................................................................................................................................ 67 
Morphological traits were more plastic under drought than under high temperature ..................... 67