gen haritalama çalışmalarına giriş: otozomal dominant herediter sferositoz'da bağlantı analizi

81 Pages·2009·0.86 MB·Turkish

T.C.
SELÇUK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GEN HARİTALAMA ÇALIŞMALARINA GİRİŞ:
OTOZOMAL DOMİNANT HEREDİTER
SFEROSİTOZ’DA BAĞLANTI ANALİZİ

PELİN TAŞDEMİR
DOKTORA TEZİ

TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
TIBBİ GENETİK BİLİM DALI

TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. S. SENNUR DEMİREL

KONYA-2009

1
T.C.
SELÇUK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GEN HARİTALAMA ÇALIŞMALARINA GİRİŞ:
OTOZOMAL DOMİNANT HEREDİTER
SFEROSİTOZ’DA BAĞLANTI ANALİZİ

PELİN TAŞDEMİR
DOKTORA TEZİ

TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
TIBBİ GENETİK BİLİM DALI

TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. S. SENNUR DEMİREL

YARDIMCI TEZ DANIŞMANI
Doç. Dr. NURTEN AKARSU

Bu araştırma Selçuk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü
tarafından 06102006 proje numarası ile desteklenmiştir.

KONYA-2009
2
ÖNSÖZ
Tüm doktora eğitimim sırasında bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan
bölümümüz öğretim üyeleri Prof. Dr. Aynur ACAR, Yard. Doç. Dr. Gül
DURAKBAŞI DURSUN, Yard. Doç. Dr. Ayşe Gül ZAMANİ ve danışmanım
Prof. Dr. Sennur DEMİREL’e ve her zaman destek veren Prof. Dr Ferhan
PAYDAK’a,
Tez aşamasında bana kucak açan, yardım ve ilgisini esirgemeyen ve
sürekli olarak beni motive eden sayın hocam Prof. Dr. Nurten AKARSU’ya
Aile ile ilişkileri sağlama konusunda yardımcı olan Pediatrik Hematoloji
ABD öğretim üyesi Doç.Dr. Canan ALBAYRAK’a,
Araştırma sırasında bizi destekleyen Selçuk Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü’ne,
Eğitim ve tez aşamasında bana desteklerini ve sevgilerini esirgemeyen
annem, babam, sevgili eşim Çağatay, kızım Deniz ve oğlum Ata TAŞDEMİR’e,
Teşekkürü bir borç bilirim.

3
İÇİNDEKİLER
Sayfa No:
1.GİRİŞ…………………………………………………………….……….. 1
1.1. Tarihçe…………………………………………….…………….…….... 3
1.2. Eritrosit membranı……………………………….…………….…….…. 4
1.2.1. Spektrin proteini………………..……………….…….....……........6
1.2.2. Ankrin proteini………………..……....………………….…….......7
1.2.3. Band 3 proteini………………..……................................................7
1.2.4. Protein 4.2……………………..…………....………………..…......8
1.3. Herediter Sferositoz……………………………………………….…......9
1.4. Kalıtım Kalıbının Belirlenmesi……………………………………….....12
1.4.1. Kromozom kalıtımı … ………....………….………………..…......13
1.4.2. Tek gen kalıtımı …………………....……….……………..…........13
1.4.3. Kompleks kalıtım …………………....…….………….…….....…..14
1.5. Mutasyon ve Polimorfizm Kavramları……………………..…….….......15
1.5.1. Kısa DNA baz tekrarları....................................................................16
1.5.2. Uzun DNA baz tekrarları ………………………....…...…….......... 16
1.5.3. DNA’nın tek bir bazındaki değişiklikler .…....………....…….........17
1.5.4. DNA’yı kesen enzimlerin oluşturduğu uzunluk polimorfizmleri.....17
1.6. Genom Haritalaması ...........…………………………………………......17
1.6.1. Fiziksel haritalar ……………………………………....……...........18
1.6.2. Genetik haritalar ……………………………………....……...........18
1.7. Gen Haritalama Yöntemleri………………………………...……….......23
1.7.1. Parametrik metodlar…………………………………...……...........23
4
1.7.2. Non-parametrik metodlar……………………………...…..….........23
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. GEREÇ………………………………………………………….…….... ..26
2.1.1. Klinik değerlendirme ……….......………………………………...... 26
2.1.2. Pedigrinin oluşturulması ……….......…………………………..........27
2.1.3. Çözeltiler…………………………….......……………………….......29
2.1.3.1. DNA izolasyon tamponları ……….………………………......29
2.1.3.2. Agaroz jel elektroforez tamponları .………………………......29
2.1.3.3. Poliakrilamid jel elektroforez tamponları….……………........ 30
2.1.3.4. Gümüş boyama çözeltileri…………………………….............32
2.2. YÖNTEM…………………………………………………………...........33
2.2.1. Periferik kan örneklerinin Alımı.........................................................33
2.2.2. Periferik kandan DNA izolasyonu ……………………….................33
2.2.3. PZR amplifikasyonu ……..................................................................34
2.2.3.1. Amplifikasyon ürünlerinin agaroz jelde kontrol edilmesi ......41
2.2.4. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ………………........….........42
2.2.5. Gümüş nitratla boyama ve jellerin fotoğraflanması............................44
2.2.6. Genotipleme........................................................................................45
2.2.7. Haplotipleme ………………………………………..........................47
2.2.8. İstatistiksel analizler………………………………………................48
3. BULGULAR……………………………………………………………….50
4. TARTIŞMA ……………………………………………………………….62
5. SONUÇ VE ÖNERİLER………………………………………………….67
6. ÖZET ………………………………………………………………………69
7. SUMMARY ……………………………………………………………….70
5
8. KAYNAKLAR ……………………………………………………………71
9. ÖZGEÇMİŞ ………………………………………………………………74
10. EKLER ………………………………………………………………….

6
SİMGELER VE KISALTMALAR
DNA : Deoksiribonükleik asit
dNTP: Deoksiribonükleotid trifosfat
EDTA: Ethilendiamintetraasetik asit
EtBr: Etidyum bromid
FISH: Floresan in situ hibridizasyon
HE : Herediter eliptositoz
HPP : Herediter piropoilositoz
HS : Herediter sferositoz
LOD : Logaritm of Odds Ratio
µgr: mikrogram
µl: mikrolitre
µM: mikromolar
PZR: Polimeraz zincir reaksiyonu
RNA : Ribonükleik asit
SDS: Sodyum dodesil sülfat
SDS-PAGE : Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi
SDT : Sibship test for disequilibrium (kardeşler arası dengesiz kalıtım)
STRP : Short tandem repeat polymorphism (kısa seri tekrarları polimorfizmi)
TBE: Tris/borat/EDTA tamponu
TDT : Transmission disequilibrium test (kalıtımda dengesiz aktarım)
Tris: Tris (hidroksimetil) aminometan

7
TABLOLAR
Tablo 1.1. Eritrosit membranında yer alan majör proteinler, genlerinin
bulunduğu kromozom bölgeleri ve kalıtım özellikleri
Tablo 1.2. Herediter Sferositozun bazı klinik ve genetik özellikleri
Tablo 1.3. Membran protein defektlerinin görülme yüzdeleri
Tablo 1.4. Eritrosit membran proteinlerini oluşturan genlerin özellikleri
Tablo 1.5. Genetik haritalama yöntemleri
Tablo 2.1. ANK1, SPTB, SPTA1, SLC4A1 genlerinin amplifikasyonunda
kullanılan polimorfik belirleyiciler ve sekansları
Tablo 2.2. DNA göstergelerinin kromozom üzerindeki varsayılan pozisyonları
Tablo 2.3. LINKAGE programında kullanılan veriler
Tablo 3.1. Herediter Sferositoz ile aday bölgelerden seçilen genetik
belirleyiciler için LOD skor tablosu

8
ŞEKİLLER
Şekil 1.1. Eritrosit membranında yer alan proteinler.
Şekil 1.2. Rekombinasyon olgusu.
Şekil 2.1. Ailenin pedigrisi.
Şekil 2.2. SPTA1 geni ve bu gene yakın yerleşimli polimorfik göstergelerin
http://www.ensembl.org sitesinden elde edilen verilere göre 1 numaralı
kromozom üzerindeki yerleşimleri.
Şekil 2.3. ANK1 geni ve bu gene yakın yerleşimli polimorfik göstergelerin
http://www.ensembl.org sitesinden elde edilen verilere göre 8 numaralı
kromozom üzerindeki yerleşimleri.
Şekil 2.4. SPTB geni ve bu gene yakın yerleşimli polimorfik göstergelerin
http://www.ensembl.org sitesinden elde edilen verilere göre 14 numaralı
kromozom üzerindeki yerleşimleri.
Şekil 2.5. SLC4A1 geni ve bu gene yakın yerleşimli polimorfik göstergelerin
http://www.ensembl.org sitesinden elde edilen verilere göre 17 numaralı
kromozom üzerindeki yerleşimleri.
Şekil 2.6. 14 numaralı kromozoma ait denatüren poliakrilamid jel fotoğrafı
Şekil 3.1. 1 numaralı kromozoma ait haplotip analizi.
Şekil 3.2. 8 numaralı kromozoma ait haplotip analizi.
Şekil 3.3. 14 numaralı kromozoma ait haplotip analizi.
Şekil 3.4. 17 numaralı kromozoma ait haplotip analizi.
Şekil 3.5. 1 numaralı kromozomdan seçilen iki genetik belirleyicinin çok noktalı
analiz grafiği
Şekil 3.6. 14 numaralı kromozomdan seçilen iki genetik belirleyicinin çok
noktalı analiz grafiği
Şekil 3.7. 17 numaralı kromozomdan seçilen iki genetik belirleyicinin çok
noktalı analiz grafiği
9
1. GİRİŞ
Herediter sferositoz (HS), membran proteinlerinin defektleri sonucu
eritrositlerin morfolojik olarak bikonkav ve santral solukluğu olan disk
şeklinden, santral solukluğu olmayan küre şekline dönüşmeleri ile hemolize
eğilimin artması sonucu gelişmektedir. Klinik olarak değişik derecede anemi,
sarılık ve splenomegali ile seyreden genetik olarak hem dominant hem de resesif
kalıtımla ilişkili heterojen bir hastalıktır.
HS, Kuzey Avrupa ülkelerinde beyaz ırkta görülen en yaygın hemolitik
anemidir. İnsidansı Kuzey Avrupa ülkelerinde 1/2000, Amerika Birleşik
Devletlerinde 1/5000 olarak saptanmıştır. Olguların % 75’i otozomal dominant
kalıtım kalıbıyla seyrederken, %10-25 vakada ise aile öyküsüne
rastlanmamaktadır. Bu vakaların yaklaşık yarısı otozomal resesif kalıtılırken,
diğer yarısı spontan mutasyon veya azalmış penetrasyon ile açıklanmaktadır
(Timur 2001).
HS’de saptanan primer biyokimyasal defekt, eritrosit membranındaki
proteinlerdedir. Eritrosit iskeletini oluşturan bu proteinler, eritrositlerin şeklini
ve elastik yapısını korumaktadır. Ayrıca eritrositlerin anormal morfolojisi ve
kısa yaşam süresi, eritrosit iskeletini oluşturan komponentlerden birinin
defektine veya disfonksiyonuna bağlı olabilir. Yapılan çalışmalarda eritrosit
membran proteinlerini oluşturan genlerde mutasyonlar tespit edilmiştir.
Bunlardan major etkili olanlar α ve β spektrin, ankyrin, band 3 ve protein 4.1
dir (Iolascon ve ark 1998)..
Gen haritalama, kromozom lokalizasyonu bilinmeyen genlerin
lokalizasyonlarının saptanması işlemidir. Bu işlem, olasılık modellerini
kullanarak bir genin bulunduğu kromozom bölgesini saptamaya dayanır. Gen
haritalama yöntemlerinden biri olan bağlantı analizi HS’de aday gen aranması
çalışmalarında başarıyla kullanılmıştır(Akarsu 2002).
İnsan Genom Projesi (HGP) seçilmiş model organizmaların ve insan
genomunun tanımlanması için başlatılan bir bilim projesidir. 1986 yılında
Amerika’da başlatılan insan genom projesi daha sonra İngiltere, Japonya,
Almanya, Fransa ve Çin’in katılımıyla uluslararası bir çalışmaya dönüşmüştür.
10