Formstabile Peptidepitope für die personalisierte Diagnostik der rheumatoiden Arthritis

380 Pages·2017·31.12 MB·German

by  Andreas Schrimpf

Formstabile Peptidepitope für die
personalisierte Diagnostik der
rheumatoiden Arthritis

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)

dem
Fachbereich Chemie
der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von
ANDREAS SCHRIMPF, M.SC.
aus Fulda

Marburg/Lahn 2018

Vom Fachbereich Chemie
der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: 26.01.2018

Erstgutachter: Prof. Dr. Armin Geyer
Zweitgutachter: Prof. Dr. Eric Meggers

Tag der mündlichen Prüfung: 09.03.2018
Hochschulkennziffer: 1180
Der experimentelle Teil dieser Arbeit entstand in der Zeit von Oktober 2014 bis Oktober 2017
am Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg.

Mein besonderer Dank gilt
Prof. Dr. Armin Geyer
für die große wissenschaftliche Freiheit und die Unterstützung und Hilfestellung bei der
Bearbeitung dieser vielseitigen und komplexen Thematik.
Kurzzusammenfassung
Die molekularen Grundlagen der Autoimmunität wurden mit Hilfe von Filaggrin-abgeleiteten
-hairpin-Peptiden erforscht. Als Modellerkrankung diente die rheumatoide Arthritis (RA), in
deren Krankheitsverlauf sich eine Vielzahl von Autoantikörpersubtypen ausbildet. Es wurden
Antworten auf die Frage gefunden, welche Eigenschaften Peptide besitzen müssen, um
überhaupt als Epitope erkannt zu werden und somit die vorgenannten Subtypen zu binden und
letztendlich zu unterscheiden. Die mittels Festphasensynthese hergestellten Peptidepitope
eignen sich gleichzeitig als diagnostische Werkzeuge für die frühzeitige serologische
Erkennung von RA. Ihr konformationeller Raum wurde systematisch durch korrelierte
Einführung von -hairpin-Designelementen (hydrophober Cluster, D-Aminosäuren, Disulfide,
Deletionen etc.) variiert und mittels NMR-Spektroskopie in Lösung detailliert analysiert. Die
daraus hervorgehenden, ungewöhnlichen Peptidstrukturen wurden in ELISA-Tests auf ihre
biologische Aktivität gegenüber kommerziell erhältlichen RA-Autoantikörpern untersucht. Auf
dieser Basis wurde eine Vorauswahl getroffen, um ein Set von zueinander komplementären
Peptidantigenen (sowohl in Bezug auf ihre Konformation als auch auf ihre Antikörperaffinität)
in weiterführenden Assays gegen Blutseren zu verwenden. Für jeden Patienten wurde so ein
Barcode an gemessenen Absorptionen im ELISA erhalten, die je nach Kombination an
absoluten und relativen Affinitäten der verwendeten Antigene zur (indirekten) Identifikation
von Autoantikörper-Profilen führen. Diese ersten Tests liefern einen wichtigen Beitrag zu einer
personalisierten Diagnostik der RA, wobei die angewendeten Methodiken auf andere
Autoimmunerkrankungen und deren Epitop-Paratop-Paare übertragbar sind.
Durch Deletion von Aminosäurepaaren der -hairpin-Peptide wurden nicht nur hochaktive
dimere Epitope erhalten, sondern es konnten auch Aussagen über die Periodizität dieser
Sekundärstruktur gewonnen werden. Dabei wurde regioselektiv ein disulfidreiches (jede dritte
Aminosäure des 12er-hairpins ist ein Cystein), antiparalleles hinge-Dimer (engl. hinge:
Scharnier) mit vier Disulfidbrücken synthetisiert, das ohne den aufwendigen Einsatz von
orthogonalen Schutzgruppen zuverlässig Homodimere ausbildet. Diese Peptidsequenz konnte
in einem bottom up-Ansatz als Dimerisierungsdomäne in Proteine und Antikörper (letztere
enthalten in ihrer natürlichen Form parallele hinge-Regionen) mittels rekombinanter Methoden
eingebracht werden.
Diese Arbeit liefert also entscheidende Beiträge zur Synthese und Strukturaufklärung von -
hairpin-Epitopen, zu deren systematischer Variation sowie deren Einsatz in der personalisierten
Autoimmundiagnostik. Darüber hinaus wurden auf diese Weise verlässlich faltende
Dimerisierungsdomänen für das de novo-Design von Proteinen erstellt.
Abstract
The molecular basis of autoimmunity was researched by utilising filaggrin derived -hairpin
peptides. Rheumatoid arthritis (RA) served as a role model. During its disease course, a wide
variety of autoantibody subtypes emerges. In this context, answers to the question have been
found, what actually makes a peptide an epitope, that is able to bind the aforementioned
subtypes and ultimately distinguish them. Such peptide epitopes were synthesised via solid
phase peptide synthesis and could be used as diagnostic tools for the early identification of
rheumatoid arthritis (RA). Their conformational space was systematically varied by the
correlated introduction of -hairpin design elements (hydrophobic cluster, D-amino acids,
disulfides, deletions etc.) and investigated in detail by NMR spectroscopy. The peptides’
diverse, unusual conformations and dynamics were then correlated with their biological activity
against commercially available RA autoantibodies in ELISA tests. Based on these, a
preselection of mutually complementary peptide antigens (regarding their conformation as well
as their antibody affinities) were utilised in consecutive assays against blood sera. A barcode
of measured absorptions in ELISA was thus obtained for every RA patient, which led to
(indirect) identification of autoantibody profiles depending on the combinations of absolute and
relative intensities among the employed antigens. These first tests deliver an important
contribution towards a personalised RA diagnosis. At the same time, all applied methodologies
can be transferred to other autoimmune diseases and their associated paratope-epitope-pairs.
The deletion of amino acid pairs from the -hairpin peptides did not only lead to highly affine
epitopes, but also to valuable insights into the periodicity of this secondary structure. In this
context, a disulfide-rich (every third amino acid of the 12mer hairpin constitutes a cysteine),
antiparallel hinge peptide could be synthesised without elaborate protecting group chemistry.
In a seminal bottom up approach, this biomolecule served as dimerisation domain in proteins
and antibodies (the latter contain a parallel hinge region in their native state) by means of
recombinatorial methods.
This thesis provides a decisive contribution to the design, preparation and structural
characterisation of -hairpin peptide epitopes, their systematic and broadly applicable synthetic
variation as well as their utilisation in autoimmune diagnostics. Beyond that, a reliably folding
dimerisation domain has been created for the de novo design of proteins.
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

• Andreas Schrimpf, Armin Geyer:

Two opposing D-amino acids give zigzag hairpin epitopes an additional kink to create
antibody-selective peptide antigens.

ChemBioChem 2016, 17, 2129–2132.
DOI: 10.1002/cbic.201600479

• Andreas Schrimpf, Armin Geyer

Constricted peptidic epitopes for the personalised diagnosis of rheumatoid arthritis

in Proceedings of the 34th European Peptide Symposium, European Peptide Society,
Leipzig 2016, S. 117.

• Andreas Schrimpf, Uwe Linne, Armin Geyer:

Eight at one stroke - a synthetic tetra-disulfide peptide epitope

Organic and Biomolecular Chemistry 2017, 15, 2512-2521.
DOI: 10.1039/c6ob02746f
Was dem Schwarm nicht nützt, das nützt auch der einzelnen Biene nicht.
MARCUS AURELIUS
Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ........................................................................................................................... 1
1.1 Peptidepitope ................................................................................................................ 2
1.2 Hairpins als Peptidepitope - Design und Stabilität ...................................................... 4
1.2.1 Die intrinsische Dynamik von -hairpin-Peptiden .............................................. 8
1.3 Autoimmunepitope - Fremd und Selbst ....................................................................... 9
1.3.1 Synthetische Peptidepitope als diagnostische Werkzeuge ................................. 10
1.4 Die Pathogenese der rheumatoiden Arthritis ............................................................. 12
1.4.1 Die serologische Diagnostik der rheumatoiden Arthritis ................................... 15
1.5 D-Aminosäuren in Peptiden - Die Erweiterung des Alphabets .................................. 18
1.6 Disulfidreiche Peptide ................................................................................................ 22
1.6.1 Synthesemethoden für disulfidreiche Peptide .................................................... 24
1.6.2 Disulfidreiche Dimere ........................................................................................ 27
1.7 Antikörper und ihre Dynamik .................................................................................... 29
1.7.1 Die Antikörper-hinge-Region ............................................................................ 32
1.8 Multiple Antigenpeptide ............................................................................................ 33
1.9 Scanmethoden für Peptide.......................................................................................... 35
1.10 Strukturaufklärung von Peptiden mittels NMR-Spektroskopie ................................. 36
2. Aufgabenstellung ............................................................................................................. 41
3. Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 45
3.1 Wann ist ein Peptid ein Epitop? ................................................................................. 45
3.2 Synthese der Peptidepitope ........................................................................................ 46
3.3 Formstabilität - Methodik der Strukturaufklärung ..................................................... 47
3.3.1 Seitenkettenrotamere .......................................................................................... 53
3.3.2 Die Tryptophan-Seitenkette im hydrophoben Cluster ....................................... 58

I
Inhaltsverzeichnis

3.4 ELISA-Tests und deren Optimierung ........................................................................ 59
3.4.1 Arginin oder Citrullin? Die Validität der ELISA-Tests ..................................... 63
3.5 Paarweise korrelierte D-Aminosäuren ........................................................................ 64
3.5.1 Detaillierte Konformationsanalyse der Mono- und Doppel-D-Peptide .............. 69
3.5.2 Biologische Aktivität und antikörperselektive Antigene ................................... 75
3.5.3 Weitere Doppel-D-Peptide - Doppel-D-Scan ...................................................... 76
3.5.4 Ein all-D-Peptidepitop ........................................................................................ 78
3.6 Modulkombination: D-Aminosäuren und Disulfide ................................................... 79
3.6.1 Konformationsanalyse der Bidisulfid-Epitope ................................................... 84
3.6.2 ELISA-Tests der Bidisulfide .............................................................................. 88
3.7 Epitopgröße und hairpin-Periodizität ........................................................................ 89
3.8 Acht auf einen Streich - Disulfidreiche Epitop-Dimere und -Monomere .................. 94
3.8.1 Konformationelle Analyse der Monomere und Dimere ..................................... 97
3.8.2 Ionenmobilitätsspektrometrie ........................................................................... 107
3.8.3 Temperaturabhängige CD-Spektroskopie des Tetradisulfid-Dimers ............... 108
3.8.4 Heterodimere - Korrelierte Bewegungen ......................................................... 109
3.8.5 Die Komplexität einer fehlgeschlagenen Cystein-Oxidation ........................... 111
3.8.6 N- und C-terminale Variation des dimeren Tetradisulfid-Motivs .................... 112
3.8.7 Variation des turns im 12er-hairpin ................................................................. 115
3.9 Das Tetradisulfid als Dimerisierungsdomäne in Proteinstrukturen ......................... 117
3.9.1 LEH-Dimere ..................................................................................................... 118
3.9.2 Eine antiparallele hinge-Region in Antikörpern .............................................. 122
3.10 Die Rolle des Tryptophans im hydrophoben Cluster ............................................... 124
3.10.1 Fluoreszenzspektroskopie ................................................................................ 127
3.11 Filaggrin-Foldon-Epitopchimären: Eine funktionelle Rekonstruktion .................... 129
3.12 Die Nachbarn des Citrullin ...................................................................................... 137
3.13 Turn-Geometrie ........................................................................................................ 140

II