Ferramentas para a identificação molecular de Salmonella em alimentos em laboratórios de pequeno a médio porte

2020·0.97 MB·

by  Santos, Flávia Bülow Dos

F.B. dos Santos, R.L. Maia, R.G. Ribaya, P. H. M. Calixto

Ferramentas para a identificação molecular de Salmonella em alimentos
em laboratórios de pequeno a médio porte: uma breve revisão

Flávia Bülow dos Santos¹, Rosinete de Lima Maia¹, Rute Gonzalez Ribaya¹,
Paulo Henrique Matayoshi Calixto²*

¹Curso técnico em Biotecnologia, IFSC
² Instituto Federal de Santa Catarina
*Biomédico, Mestre e Doutor em Medicina Tropical e Infectologia

Resumo Salmonella é um patógeno, não raramente encontrado em alimentos de todas as
origens. Existem aproximadamente 3.000 sorotipos reconhecidos dessa espécie, o que
dificulta e muito seu diagnóstico e classificação assertiva. A classificação dos isolados de
Salmonella é essencial para a vigilância epidemiológica. Contudo, devido às dificuldades de
logística e de operação, o diagnóstico correto desses espécimes é comprometido, sendo que
em alguns casos, sequer são realizados. Para superar essas limitações, foram elencadas
técnicas moleculares para o diagnóstico e classificação de Salmonella que podem ser
desenvolvidas em laboratórios de pequeno a médio porte, devido a necessidade de poucos
equipamentos para a sua realização. Essas técnicas incluem a eletroforese em campo pulsado,
análise do RNA ribossômico, análise do polimorfismo do DNA amplificado aleatoriamente,
análise do polimorfismo do DNA amplificado aleatoriamente, amplificação de elementos
repetitivos e polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição do produto de PCR.

Palavras-chave: Salmonella, diagnóstico molecular, sorotipagem.

Tools for molecular identification of Salmonella in food in small to
medium-sized laboratories: a short review

Abstract Salmonella is a pathogen, not infrequently found in foods of all origins. There are
approximately 3,000 recognized serotypes of this species, which makes diagnosis and
assertive classification very difficult. The classification of Salmonella isolates is essential for
epidemiological surveillance. However, due to logistical and operational difficulties, the
correct diagnosis of these specimens is compromised, and in some cases, they are not even
performed. To overcome these limitations, molecular techniques for the diagnosis and
classification of Salmonella were listed, which can be developed in small to medium-sized
laboratories, due to the need for little equipment to perform them. These techniques include
pulsed-field gel electrophoresis, ribosomal RNA analysis, randomly amplified DNA
polymorphism analysis, randomly amplified DNA polymorphism analysis, amplification of
repetitive elements and restriction fragment length polymorphism of the PCR product.

Keywords: Salmonella, molecular diagnosis, serotyping.

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Introdução Diferentes matrizes alimentares podem
apresentar dificuldades para a recuperação
Espécies do gênero Salmonella são eficiente de bactérias e o subsequente
um dos principais agentes causadores de isolamento de DNA para a detecção
doenças transmitidas por alimentos, sendo molecular. Outras complicações podem
considerada uma ameaça à saúde pública, surgir quando há uma transferência de
não apenas no Brasil, mas em todo o antimicrobianos, normalmente utilizados
planeta (ABEBE et al., 2020). A infecção na criação de animais, na profilaxia das
humana pela Salmonella recebe o nome de unidades de produção ou na conservação,
salmonelose humana. Além de humanos, a para os diluentes e meios de recuperação
salmonelose pode ocorrer em outros de alimentos ou amostras de alimentos
mamíferos. Essa infecção apresenta alta tratados. Isso pode levar a uma falsa
taxa de morbidade e, caso não tratada, é diminuição potencial no número de células
potencialmente fatal. A incidência de bacterianas viáveis e uma subestimação no
casos de salmonelose já foi atribuída a nível de contaminação na amostra original
diversos produtos alimentícios, tais como (ABBO et al., 1993). Da mesma forma,
animais, aves e produtos frescos alcançar uma amostragem representativa
(OLAIMAT et al., 2020). Nesse sentido a de alimentos a granel, como grãos, pode
ocorrência de Salmonella em produtos despender um grande esforço, pois a
cárneos, alimentos secos e outros produtos distribuição da Salmonella é pouco
alimentícios representam um grande frequente e sua distribuição não é
desafio para a avaliação de risco, do ponto homogênea nesses alimentos. Nesse
de vista da saúde pública (ENG et al., sentido, a superação desses gargalos
2015). A contaminação de alimentos por continua sendo um dos principais
Salmonella pode ocorrer em qualquer propulsores para o desenvolvimento e
etapa da produção do alimento, incluindo aprimoramento dos métodos de detecção
durante a alimentação do animal (JONES, de Salmonella (RAHMAN et al., 2019).
2011). Consequentemente, um sem
Dada a importância para a saúde número de avanços foram realizados no
pública e a necessidade de diminuir a que ser refere aos métodos de detecção
exposição à Salmonella, existe um molecular. O advento e a aplicação do
interesse contínuo e crescente para o Next generation sequencing (NGS) no
desenvolvimento de métodos de Whole-genome sequencing (WGS) mudou
identificação e detecção que não apenas drasticamente a abordagem para a
sejam rápidos, mas também tenham identificação de cepas específicas de
resolução de detecção aprimorada. A Salmonella, bem como para a detecção e
importância da diferenciação entre os tipagem de sorotipos. Numerosas análises
quase 3.000 sorotipos de Salmonella, além abrangentes e mais focadas nos últimos
da necessidade contínua de reduzir os anos foram publicadas sobre diferentes
tempos de detecção, tornou-se um dos aspectos da Salmonella e outros métodos
principais objetos de estudos da de detecção de patógenos de origem
Microbiologia, à medida que a incidência alimentar, incluindo métodos que
da salmonelose se mantém elevada envolvem ou não o cultivo, e também
(SARGEANT, et al., 2020). abordagens imunológicas e moleculares
Apesar dos grandes avanços que (ZHANG et al., 2019; VAN DEN BERG,
proporcionaram o desenvolvimento de et al., 2019). Nesse sentido, esta revisão
melhores métodos de detecção e tem por objetivo indicar os principais
identificação de Salmonella, outras métodos moleculares para a detecção e
questões metodológicas associadas à identificação de espécies de Salmonella
caracterização podem ser desafiadoras. em alimentos.
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de identificação molecular (KOZYREVA
Eletroforese em campo pulsado et al., 2016).

Devido ao grande tamanho do Análise do RNA ribossômico
cromossomo bacteriano, bem como sua
propriedade circular, a separação do A identificação de Salmonella por
material genético é mais eficientemente intermédio da análise do RNA ribossômico
realizada através da eletroforese em campo (rRNA) apresenta elevados índices de
pulsado (ECP). Diferente da eletroforese sensibilidade e especificidade. Essa análise
convencional, onde a corrente passa recebe o nome de ribotipagem e se baseia
unidirecional e continuamente entre os no polimorfismo do comprimento do
polos, na ECP, a corrente elétrica é emitida fragmento de restrição (RFLP). A
isoladamente em três direções, tornando a ribotipagem é capaz de agrupar diferentes
separação de grandes moléculas de DNA perfis de restrição, chamado ribotipos, que
mais eficiente (DUDEK et al., 2019). A podem corresponder a sorotipos
ECP é útil para a identificação de cepas de específicos. A ribotipagem convencional
Salmonella por fingerprint, ideal para envolve a clivagem do DNA genômico
situações de surtos alimentares, sendo uma bacteriano com uma enzima de restrição,
técnica extremamente barata para realizar tendo os sítios de clivagem conservados
(ZOU et al., 2012). dentro e fora do operon rRNA; essa etapa
Numerosos estudos indicam a alta é seguida pela hibridização de fragmentos
capacidade discriminatória da ECP no de DNA genômico separados
rastreamento de fontes de infecção por eletroforeticamente com uma sonda de
diferentes sorotipos de Salmonella. operon ribossomal (MENDONÇA et al.,
Contudo, a ECP apresenta algumas 2011).
desvantagens. A principal, é que a Mesmo apresentando diversos
preparação das amostras para a passos para sua execução, a
eletroforese é um processo demorado e reprodutibilidade da ribotipagem foi
trabalhoso. Uma outra desvantagem é que demonstrada em diversos estudos e
a sensibilidade da análise varia com o apontada como alta. Via de regra, a
sorotipo analisado (ZAKARIA et al., ribotipagem gera poucas bandas de DNA,
2020). entre 5 a 12 bandas, separadas por
Além das questões apresentadas, a eletroforese convencional, facilitando a
reprodutibilidade das análises de ECP é análise dos padrões de RFLP. Por outro
mantida através da padronização rigorosa lado, se apenas um número reduzido de
dos protocolos de execução. Uma das bandas de RFLP for analisado, o poder de
formas de assegurar o controle da discriminação e, consequentemente, o de
qualidade é a comparação interlaboratorial identificação de sorotipos, será reduzido,
dos padrões de ECP. Essa padronização foi conduzindo a erros de diagnóstico. Essa
facilitada pela criação de uma rede de questão se torna ainda mais sensível para
resultados, coordenado pelo Centers for aqueles isolados que apresentam sorotipos
Disease Control and Prevention (CDC), intimamente relacionados (EMELE et al.,
um órgão americano, que reúne e 2019).
compartilha informações sobre os mais
diversos perfis de Salmonella em ECP. Análise do polimorfismo do DNA
Apesar de ter sido considerado o padrão amplificado aleatoriamente
ouro, no que se refere à identificação de
Salmonella, esse tipo de análise tem sido A análise do polimorfismo do
considerado cada vez mais obsoleto, em DNA amplificado aleatoriamente (RAPD-
virtude da padronização de outras técnicas PCR) se baseia na amplificação aleatória
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de DNA do genoma bacteriano. A e polifiléticos. Além disso, embora a
amplificação ocorre através da utilização reprodutibilidade fosse um limitante em
de iniciadores de aproximadamente 10 alguns estudos, o uso de kits comerciais
oligômeros, que se associam ao DNA melhorou consideravelmente a
bacteriano em condições de baixa reprodutibilidade (RAFATIZOMORODI
estringência. O poder discriminatório deste et al., 2017).
método é diretamente afetado pela escolha
dos iniciadores e as condições da PCR, o Polimorfismo do comprimento do
que é considerado um complicador na fragmento de restrição do produto de
reprodutibilidade (FERRI et al., 2016). PCR
É importante ressaltar que mesmo
pequenas mudanças nos reagentes ou nas O polimorfismo de comprimento
condições de reação podem resultar em de fragmento de restrição de PCR (PCR-
diferenças significativas nos padrões de RFLP) se baseia na distribuição dos perfis
bandas produzidos. Assim a identificação de bandas obtidos através da digestão, por
do sorotipo de Salmonella envolvido em enzimas de restrição, de produtos de PCR,
surtos ou na contaminação de alimentos, se também denominados com amplicon. Para
torna extremamente difícil, podendo gerar utilizar o PCR-RFLP como método de
resultados inconclusivos (SHEKHAWAT identificação dos diversos sorotipos de
et al., 2019). Salmonella, primeiramente se deve isolar
uma sequência polimórfica, através do
Amplificação de elementos repetitivos sequenciamento de DNA. Essa sequência
polimórfica, após digestões simples ou
A PCR de elemento repetitivo combinadas, deve ser capaz de diferenciar
(RepPCR) amplifica fragmentos de DNA isolados até o nível de subespécie
genômico utilizando iniciadores, cuja (MATIASOVIC et al., 2020).
sequência-alvo são repetições específicas O fragmento-alvo, que apresenta os
de cada espécie de Salmonela ou de cada melhores resultados na identificação dos
sorotipo. Para a sorotipagem Salmonella, sorotipos de Salmonella, são os genes fliC
três conjuntos de sequências repetitivas e fljB, responsáveis pelos antígenos
presentes no genoma têm sido utilizadas, flagelares de fase 1 e 2, respectivamente
são elas: i) REP, sequência palindrômica (ACHAKZAI et al, 2017). Além da correta
extragênica repetitiva; ii) ERIC, consenso escolha do fragmento-alvo, é importante
intergênico repetitivo enterobacteriano; reforçar que o poder discriminatório e de
BOX, uma sequência repetitiva da região identificação também depende da escolha
promotora (KAKABADZE et al., 2018). da enzima de restrição, bem como da
Essas sequências permitem discriminação, otimização da reação de digestão
pois são geneticamente estáveis e variam (MURGIA et al., 2016).
com relação à localização cromossômica e Embora o método do PCR-RFLP
número de cópias entre as cepas. seja tecnicamente simples, seu
Semelhante à análise do polimorfismo do desempenho e poder diagnóstico depende
DNA amplificado aleatoriamente, de uma variação, em dada região
reprodutibilidade é um dos principais nós genômica, muito pequena. Dessa forma,
dessa técnica (ALI-SHIROOD, et al., essas condições podem afetar
2016). rigorosamente o poder de identificação e
Como ocorre em outros métodos de causar dificuldades de interpretação dos
tipagem molecular que são baseados em dados produzidos (ALBARNAZ et al.,
perfis de padrão de bandas em gel de 2007).
agarose, a RepPCR encontrou dificuldade
com a identificação de subtipos homólogos
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Conclusão ALI-SHIROODI, Abbas et al. Genotyping
of Salmonella enterica serovar Enteritidis,
Um sem número de pesquisadores isolated from human and animal by REP-
utilizaram ferramentas moleculares para PCR. 2016.
identificar e/ou classificar espécies de
DUDEK, Bartłomiej et al. Comparison of
Salmonella. Contudo, a complexidade e a
the phylogenetic analysis of PFGE profiles
diversidade dos sorotipos de Salmonella
and the characteristic of virulence genes in
tornaram esta questão é um desafio
clinical and reptile associated Salmonella
notável. As tentativas até o momento têm
strains. BMC veterinary research, v. 15,
focado na identificação dos sorotipos mais
n. 1, p. 312, 2019
comuns associados à salmonelose humana.
As ferramentas, aqui descritas, irão ENG, Shu-Kee et al. Salmonella: a review
auxiliar os laboratórios na identificação e on pathogenesis, epidemiology and
padronização dos testes de Salmonella. Por antibiotic resistance. Frontiers in Life
fim, essas informações auxiliarão Science, v. 8, n. 3, p. 284-293, 2015.
laboratórios de pequeno a médio na
FERRI, Francielli Mello et al.
identificação e classificação de espécimes
AVALIAÇÃO DA IDENTIFICAÇÃO DE
de Salmonella, em especial, aqueles que
SALMONELLA ENTERITIDIS DA
não possuem uma estrutura operacional
CADEIA PRODUTIVA DE AVES COM
sofisticada, incluindo sequenciadores de
BASE NA ANÁLISE DE
DNA, disponíveis para tais análises.
POLIMORFISMO DE DNA POR RAPD.

Anuário Pesquisa e Extensão Unoesc

Videira, v. 1, p. e12444-e12444, 2016.
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