Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen mit dem manuell-optischen Bildanalysensystem M.O.P AM 02 der Firma Kontron PDF
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FORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN Nr. 2902/Fachgruppe Medizin Herausgegeben vom Minister fur Wissenschaft und Forschung Prof. Dr. Hermann Themann Dr. Martin Fleischer Dr. Klaus Stahl RUdiger MeH3 Lehrstuhl fUr Medizinische Cytobiologie der UniversiHit Munster Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen mit dem manuell-optischen Bildanalysensystem M. O. P. AM 02 der Firma Kontron Westdeutscher Verlag 1979 AUTORENVERZEICHNIS Dr. Martin Fleischer RUdiger MeiO Prof. Dr. Hermann Themann Lehrstuhl fUr Medizinische Cytobiologie der Universitat MUnster Leiter: Prof. Dr. Hermann Themann Dr. Klaus Stahl Medizinische Klinik und Poliklinik der Universitat MUnster Direktor: Prof. Dr. Ulrich Gerlach CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek Feinstrukturell-morphometrische untersuchungen mit dem manuell-o tischen Bildanal sens stem MOP AM 02 null zwei der Firma Kontron Hermann Themann ••• - Opladen : Westdeutscher Verlag, 1979. (Forschungsberichte des Landes Nordrhein Westfalen ; Nr. 2902 : Fachgruppe Medizin) ISBN 978-3-531-02902-3 ISBN 978-3-322-87837-3 (cHook) DOl 10.1007/978-3-322-87837-3 NE: Themann, Hermann [Mitarb.] © 1979 by Westdeutscher Verlag GmbH. Opladen Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag ISBN 978-3-531-02902-3 - III - INHALT 1. EINLEITUNG 2. METHODEN 2 2. 1 Bestimmung von Volumen-, Oberfl!chen- und 2 Anzahldichten 2.2 Anzahl-, L!ngen- und Fl!chenmessungen 4 2.3 Apparative Ausstattung und mathematische 7 Verarbeitung der anfallenden Daten 3. ANWENDUNGSBEISPIELE 8 3.1 Tierexperimentelles Material 8 3. 1 • 1 Morphometrische Untersuchung der Galaktosamin 8 hepatitis an Rattenlebern 3.1.2 Feinstrukturelle Ver!nderungen der Rattenleber 10 unterschiedlich alter Tiere nach Applikation polychlorierter Biphenyle (PCB) 3. 1 .3 Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen 12 von Lebern bei Ratten unterschiedlichen Alters nach Applikation von technischem Pentachlorphe nol (PCP) 3.1.4 Der Effekt von Polyenylphosphatidylcholin auf 16 die cholestatische Rattenleber 3. 1 .5 Der EinfluBder Essentiellen Phospholipide 17 "Essentiale" und "N 106" auf den Zellkern der M!useleber 3.1.6 Die ultrastrukturellen Auswirkungen chronischer 19 Alkoholzufuhr auf die Leberzelle des Goldham sters 3. 1 .7 Die ultrastrukturellen Auswirkungen chronischer 22 Alkoholzufuhr auf die Skelettmuskelzelle des Goldhamsters 3.2 Menschliches Untersuchungsgut 24 3.2.1 Morphometrische Untersuchungen an menschlichem 24 Herzmuskelgewebe des linken Ventrikels bei Mi tralinsuffizienz 3.2.2 Toxisch-nutritiver Leberschaden: alkoholische 24 Hepatopathie. Feinstrukturell-morphometrische Untersuchungen an menschlichen Leberbiopsien - IV - 3.2.3 Morphometrische Untersuchungen am Endoplasma- 25 tischen Retikulum der Lebern m!nnlicher Alko holiker 3.2.4 Quantitative feinstrukturelle Befunde an 27 menschlichen Thrombocyten nach Langzeiteinna~~e oraler Kontrazeptiva 4. SCHLUSSBETRACHTUNG 30 5. LITERATUR 31 6. TABELLEN UND DIAGRAMME 37 - 1 - 1. EINLEITUNG Morphometrisch-stereologische Verfahren haben seit Mitte der 60er Jahre mehr und mehr Anwendung gefunden bei der ultrastrukturellen Analyse biologisch-medizinischer Objek teo Besonders der Schweizer Arbeitsgruppe urn WEIBEL kommt das Verdienst zu, aus der Minera10gie und Geologie bekannte Verfahren ftir diesen Bereich nutzbar gemacht zu haben (s. WEIBEL, 1969). Dabei werden Anzahl-, Oberflachen- und Volurnenbestirnmungen an Zellen und intrazellularen Strukturen verschiedener Orga ne durchgeftihrt. Ziel dieser Verfahren sind reproduzierbare und objektivierbare Aussagen, die an Hand dieser drei MeB groBen tiber die untersuchten Objekte gewonnen werden konnen. Ein bestimmter Funktionsstatus ist durch eine ganze Reihe von Parametern charakterisiert. So ist etwa eine "normale" Leber klinisch, biochemisch, makroskopisch und histologisch erfaBt. Ihre Organstruktur und Zellmorphe prasentiert sich auch im elektronenmikroskopischen Bild in einer bestimmten, dazu korrelierenden Weise: Ze11zuordnung, Zellkontakte, Interzellularraurn, ZellgroBe und -form sowie Anordnung, Gro Be und Anzahl von Zellorganellen spiegeln - mit einer gewis sen Schwankungsbreite - den Funktionszustand "Normalitat" wider. In analoger Weise sind funktionelle Alterationen oft mit Veranderungen des elektronenmikroskopischen Erschei nungsbildes vergesellschaftet. Eine Reihe von Noxen ftihrt z.B. bei Einwirkung auf die Leber zu typischen Scnadigungs mustern: Veranderungen am glatten und rauhwandigen endoplas matischen Retikulurn, vermehrte lysosomale Inklusionen, Mito chondrienlasionen, Vermehrung von Microbodies und Fettein schltissen usw. Eine quantitative Erfassung morphol6gischer Veranderungen erlaubt detailliertere Vergleiche mit den Ergebnissen physio logisch/klinischer und biochemischer Untersuchungen und ge winnt auch von daher ihre Bedeutung und Rechtfertigung. - 2 - 2. METHODEN 2.1 Bestimmung von V01umen-, Oberflachen und Anzahldichten Stereologische untersuchungen wollen quantitative Aussagen Uber eine Struktur in einem komplexen dreidimensionalen Bezugsraum machen. So sind z.B. die Anzahl der Mitochondrien pro ml Hepatocyten, die Oberflache der glatt en Membranen pro cm3 Cytoplasma oder der Volumenanteil von FetteinschlUssen am ml Hepatocyten bzw. am ml Fettspeicherzelle interessie rende MeBgroBen. Zuganglich sind bei elektronenmikroskopi schen untersuchungen nur die jeweils zweidimensionalen Pro jektionen dieser MeBgroBen. Es ist z.B. umittelbar einsich tig, daB man aus einem Schnittbild allein und den runden oder auch elliptischen Anschnittsflachen einiger weniger Mi tochondrien nicht auf das Volumen dieser Organellen schlie Ben kann. Dasselbe gilt natUrlich auch fUr die Oberflachen und Anzahldichte sowie fUr beliebige andere Zellkomponenten. FUr ein hinreichend groBes Kollektiv von Anschnitten einer Struktur auf zufallig orientierten Schnittebenen durch das zu untersuchende Material existieren aber mathematisch for mulierbare Zusammenhange: So fand der franzosische Geologe DELESSE schon 1847, daB die Volumendichte (Vvi) einer Komponente i gleich ist dem Fla chenanteil an der Einheitsflache, den diese Komponenten im ebenen Anschnitt einnimmt: SALTYKOV konnte 1958 nachweisen, daB die Oberflachendichte SVi einer Komponente i in der dreidimensionalen Testraum einheit proportional ist zu der mittleren Gesamtlange des Umfangs aller Profile dieser Komponente in der Einheitsfla che: - 3 - Die Anzahldichte NVi pro Einheitsvolumen laBt sich nicht auf einfache Weise mit der Anzahl angeschnittener Profile NAi auf der gewahlten Einheitstestflache korrelieren. Un ter einer Reihe von Voraussetzungen lassen sich jedoch Gleichungen ableiten, die zu gute n und nahezu tibereinstim menden Ergebnissen ftihren. Die Schnittdicke des Praparates sollte klein sein gegentiber dem kleinsten Durchmesser der untersuchten Population~ Forrn- und GroBenverteilung der zu zahlenden Objekte solI ten bekannt sein. Die gebrauchlichste Gleichung, die den Zusarnrnenhang zwischen Anzahldichte in dem Einheitsraum und in der Einheitsflache beschreibt, wurde von WEIBEL und GOMEZ (1962) angegeben: K B Kist vom Quotienten des dritten und ersten Moments der Gro- 3 Benverteilung der Komponente i abhangig (K = D3 : D1~)' B ist ein forrnabhangiger Faktor, der vom Achsenverhaltnis der Anschnittsflachen der Komponente i abhangt. Weitere Glei chungen zur Anzahlbestimrnung in der Volumeneinheit des Refe renzsystems, ihre Praktikabilitat und Validitat, sind zusam menfassend dargestellt und verglichen worden von MAYHEW (1972) • Mit VVi = AAi, . =! SVi rr BAi, 3 K NAi NVi B ----:l VVi2 sind die wichtigsten quantitativenRelationen zwischen den Mittelwerten von MeBgroBen im Einheitsvolumen und ihren zwei dimensionalen Projektionen auf die (Schnitt-)Ebene angegeben. Es muB betont werden, daB ihre Gtiltigkeit an Voraussetzungen - 4 - geknlipft ist, die zusammenfassend aufgelistet werden sollen: 1. Die zu untersuchenden Komponenten mlissen homogen im Re ferenzraum verteilt sein. 1st diese Voraussetzung nicht erflillt, muB zumindest folgendes gel ten: 1.1 Die Schnittflihrung 5011 zufallig orientiert sein. 2. Die einzelnen Gewebskomponenten mlissen in ausreichender Zahl vorhanden und einwandfrei zu identifizieren sein. 3. Die Schnittdicke 5011 im Idealfall unendlich dlinn sein. Sie muB auf jeden Fall klein sein gegenliber dem klein sten Durchmesser der untersuchten Objektmenge (entspre chende Korrektur nach HOLMES, 1921). Flir die Praxis be deutet das, daB sie eine moglichst konstante Dicke von etwa 50 nm haben 5011. 4. Form-und GroBenverteilung der jeweils betrachteten Kom ponenten 5011 ten bekannt sein. 5. Die Gewebsentnahme, die Fixation, die Einbettung und die Schnittanfertigung mlissen strukturerhaltend durchgeflihrt werden (5. auch WEIBEL, 1969; REITH, 1977; ROHR et al., 1976). Die drei genannten Gleichungen sind in unterschied licher Art und Weise robust gegen Abweichungen von diesen Voraussetzungen. 2.2 Anzahl-, Langen- und Flachenmessungen in der Ebene Die in der zweidimensionalen Schnittebene durchzuflihrenden MeBvorgange bestehen aus Anzahl-, Langen- und Flachenmessun gen. Eine Anzahlmessung als reiner Abzahlvorgang ist problemlos und schnell durchzuflihren. Zur Erleichterung von Langen- und Flachenmessungen wurde auf - 5 - alte und besonders in der Morphometrie zu fruchtbarer An wendung gekommene Prinzipien zurtickgegriffen, die diese Messungen zu Punktzahlverfahren vereinfachen. Grundlage zur Langenbestimmung von Profilumfangen untersuch ter Komponenten in einer Anschnittsflache bildet das Buffon sche Nadelprinzip (1777). Es beantwortet die Frage, mit wel cher Wahrscheinlichkeit Peine zufallig geworfene Nadel der Lange 1 eine Linienschar aus aquidistanten, im Abstand d be findlichen Linien schneidet. Buffon gab die Losung dieses Problems an mit: P 7~r· l d SMITH und GUTTMAN (1953) sowie SALTYKOV (1958) haben auf der Basis des Buffonschen Nadelprinzips zeigen konnen, daB die Lange einer Struktur, bezogen auf die Einheitsflache - die sogenannte "Langendichte" - geschatzt werden kann, indem man ein Liniengitter tiber die Anschnittsflache legt und die An zahl der Schnittpunkte der zu messenden Kurve mit den Test linien auszahlt. Ist IL die Anzahl der Schnittpunkte pro Einheitslange der Testlinien, so erhalt man folgende Bezie hung: y. 2 Ein Verfahren, das die mtihevolle planimetrische Messung einer Flache ersetzt, geht auf die Methode von ROSIWAL (1898) zu rUck: Der Flachenanteil einer Komponente in einer Testflache - AAi - wird durch den Langenanteil geschatzt, den zufallig auf der Testflache plazierte gerade Testlinien einer Gesamt lange L innerhalb der betrachteten Komponente einnehmen. Be zeichnet man diesen Langenanteil mit LL' so erhalt man die = Gleichung AAi LL. Die Schatzung des zu bestimmenden Flachen anteils ist dabei urn so besser, je dichter die Testlinien plaziert sind. - 6 - GLAGOLEFF (1933) reduzierte den Vorgang der Flachenmessung auf reines Punktz~hlen, indem er ein regelm~Biges Punktgit ter tiber die zu messende Flache legte und die Anzahl der Punkte innerhalb der F1ache (Pp) bestimmte. Er fand heraus. daB das Verhaltnis von zu messender Flache zur Gesamttest flache gleich ist dem Quotienten aus der "Trefferanzahl" und der die Testflache tiberdeckenden Gesamtpunktzahl: Die dargestellten Punktzahlverfahren sind eigentlich Stich proben im statistischen Sinne. Entsprechend solI ten sie den Anforderungen einer strengen Zufalligkeit gentigen. Das be deutet insbesondere. daB die zur Vernwendung kommenden Test linienscharen und Gitterpunktnetze eine zufallige Orient ie rung zu den zu untersuchenden Strukturen auf der jewei1igen Testflache einnehmen mtissen •. Biologisch-medizinische Objekte besitzen meist eine inharente Periodizitat bestimmter Sub strukturen (parallele Anordnung von Myofibrillen bei der Skelettmuskulatur. typische Schichtung der Epidermis usw.). Es muB dann darauf geachtet werden, daB die Testsysteme. die eine hochgradige Anisotropie aufweisen - wie das oft verwen dete Testliniennetz mit seinen aquidistanten. parallelen Ge raden oder das bei der Volumenbestimmung gebrauchte regelma Big aufgebaute Gitterpunktraster - keine Interferenz mit der Periodik der Komponentenaggregate zeigen.
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