fagomino ir amino rūgščių tyrimas grikių sėklose skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos ...

66 Pages·2017·2.27 MB·Lithuanian

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

MONIKA GIRDVAINYTĖ

FAGOMINO IR AMINO RŪGŠČIŲ TYRIMAS GRIKIŲ
SĖKLOSE SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ
SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:
Prof. Dr. V. Jakštas

KAUNAS, 2017
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

:
TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanas:
Data:

FAGOMINO IR AMINO RŪGŠČIŲ TYRIMAS GRIKIŲ
SĖKLOSE SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ
SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:
Prof. Dr. V. Jakštas
Data

Recenzentas Darbą atliko:
Magistrantė
Data Monika Girdvainytė
2017.05.25

KAUNAS, 2017
3
TURINYS
SANTRAUKA .................................................................................................................................... 4
SUMMARY ........................................................................................................................................ 5
SANTRUMPOS .................................................................................................................................. 6
ĮVADAS ............................................................................................................................................. 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................. 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ..................................................................................................... 9
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai .......................... 9
1.2. Sėjamųjų grikių paplitimas .................................................................................................... 9
1.3. Sėjamųjų grikių kultivavimas .............................................................................................. 10
1.4. Fitocheminė sėjamųjų grikių sėklų sudėtis ........................................................................... 10
1.5. Biologinis sėjamųjų grikių sėklų poveikis ............................................................................ 11
1.6. Azotą turinčių biologinių junginių apžvalga ........................................................................ 13
1.6.1. Iminocukrūs ir fagominas ............................................................................................. 13
1.6.2. Iminocukrų klasifikacija ............................................................................................... 14
1.6.3. Iminocukrų kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga ..................................... 15
1.6.4. Amino rūgštys .............................................................................................................. 18
1.6.5. Amino rūgščių klasifikacija .......................................................................................... 20
1.6.6. Amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės analizės metodų apžvalga................................ 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ....................................................................................... 24
2.1. Tyrimo objektas .................................................................................................................. 24
2.2. Naudota aparatūra ............................................................................................................... 24
2.3. Naudoti reagentai ................................................................................................................ 25
2.4. Ekstraktų ruošimo metodika ................................................................................................ 25
2.5. Standartų paruošimas........................................................................................................... 25
2.6. Amino rūgščių ir iminocukrų kokybinė ir kiekybinė analizė sėjamųjų grikių sėklose ........... 26
2.7. Duomenų statistinis įvertinimas ........................................................................................... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .......................................................................................... 29
3.1. Kokybinis fagomino nustatymas sėjamųjų grikių sėklose.................................................... 29
3.2. Kiekybinis fagomino ir AR nustatymas sėjamųjų grikių sėklose .......................................... 29
4. IŠVADOS .................................................................................................................................. 56
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS .......................................................................................... 57
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...................................................................................................... 58
7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO REZULTATŲ MOKSLINĖ SKLAIDA ......................... 65
8. PRIEDAI .................................................................................................................................... 66
4
SANTRAUKA
M. Girdvainytės magistro baigiamasis darbas „Fagomino ir amino rūgščių tyrimas grikių
sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu“, mokslinis vadovas prof. dr. V.
Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Farmakognozijos katedra,
Kaunas.
Tyrimo tikslas: Atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos
– masių spektrometrijos metodu.
Uždaviniai: 1) Ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios
žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m. užaugintų penkiolikos sėjamųjų grikių veislių sėklose; 2) Skysčių
chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti fagomino varijavimą grikių veislių, augintų
skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose; 3) Skysčių chromatografijos – masių
spektrometrijos metodu nustatyti amino rūgščių kiekybinę sudėtį ir jos varijavimą grikių veislių, augintų
skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose.
Tyrimo objektas: Lietuvoje ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų
penkiolikos sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklos.
Tyrimo metodai: Grikių sėklose esančių azotą turinčių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė
atlikta skysčių chromatografijos – masių spektometrijos metodu.
Išvados: 1) Visų tirtų grikių veislių sėklose skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos
metodu identifikuotas iminocukrų grupės junginys – fagominas. Taip pat visuose tirtuose mėginiuose
identifikuota penkiolika amino rūgščių (l-alaninas, d-serinas, valinas, glicinas, l-argininas, metioninas,
l-prolinas, l-lizinas, l-treoninas, fenilalaninas, aspartamo rūgštis, leucinas, l-tirozinas, izoleucinas,
glutamo rūgštis); 2) Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyta, kad didesni
fagomino kiekiai grikių sėklose sukaupiami grikius auginanat intensyvios žemdirbystės būdu, o
daugiausiai fagomino kaupiančios veislės – „Panda“ ir „Kora“; 3) Didžiausi l-alanino, glicino, l-
arginino, l-lizino ir izoleucino kiekiai nustatyti grikių, augintų intensyvios žemdirbystės būdu, sėklose.
Ddidžiausi paminėtų amino rūgščių kiekiai nustatyti „Volma“ veislės mėginiuose. Vienintelė amino
rūgštis, kurios daugiau nustatyta grikius auginant ekologiškai yra l-tirozinas. L- tirozino daugiausiai
nustatyta „Smuglianka“ veislėje. Analizuojant nustatytus d-serino, valino, metionino, l-prolino, l-
treonino, fenilalanino, aspartamo rūgšties, leucino ir glutamo rūgšties kiekius, nebuvo nustatyta
priklausomybė tarp tiriamos medžiagos kiekio ir taikytos žemdirbystės sistemos.
5
SUMMARY
Master thesis of M. Girdvainytė “Evaluation of fagomine and amino acids in common
buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) seeds“; scientific supervisor prof. dr. V. Jakštas;
Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy,
Kaunas.
The aim: To determine qualitive and quantitave composition of fagomine and amino acids in seeds
of fifteen common buckwhat (Fagopyrum esculentum Moench) varieties grown under organic and
conventional farming conditions.
Tasks: 1) To determine qualitive composition of fagomine and amino acids in seeds of fifteen
common buckwheat varieties grown under organic and conventional farming conditions in 2014/2015;
2) To quantitate amounts of fagomine in seeds of different common buckwheat varieties grown under
organic and conventional farming conditions in 2014/2015 using liquid chromatography-mass
spectrometry; 3) To quantitate amounts of amino acids and to determine it‘s variation in seeds of
different common buckwheat varieties grown under organic and conventional farming conditions in
2014/2015 using liquid chromatography-mass spectrometry.
Reserach object: Seeds of fifteen common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)
varieties grown under organic and conventional farming conditions.
Methods: Liquid chromatography-mass spectrometry was used for the qualitative and
quantitative analysis of fagomine and amino acids in common buckwheat seeds.
Conclusions: 1) Iminosugar fagomine and fifteen amino acids (l-alanine, d-serine, valine,
glycine, l-arginine, methionine, l-proline, l-lysine, l-threonine, phenylalanine, aspartic acid, leucine, l-
tyrosine, isoleucine, glutamic acid) were identifiend in seeds of all common buckwheat varieties by
using liquid chromatography-mass spectrometry method; 2) Liquid chromatography-mass spectrometry
analysis showed that highest amount of fagomine was determined in seeds of „Panda“ and „Kora“
varieties grown under conventional farming conditions; 3) Liquid chromatography-mass spectrometry
analysis showed that highest amount of l-alanine, glycine, l-arginine, l-lysine and isoleucine were
determined in seeds of „Volma“ variety grown under conventional farming conditions. Only l-tyrosine
showed better results uder organic farming conditions, highest amount of l-tyrosine was determined in
seeds of „Smuglianka“ variety. Quantitave analysis of d-serine, valine, methionine, l-proline, l-
threonine, phenylalanine, aspartic acid, leucine and glutamic acid showed no dependency between the
amount of theese amino acids in buckwheat seed and farming conditions that were applied.
6
SANTRUMPOS
AR – amino rūgštis
CD – cukrinis diabetas
DC – dujų chromatografija
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
NAR – nepakeičiama amino rūgštis
S.m. – sausa masė
SC-MS – skysčių chromatografija – masių spektrometrija
VAB – veislė „Anita Belaruskaja“
VAN – veislė „Anika“
VBD-1 – veislė „Belaruskij deteminant-1“
VBD-2 – veislė „Belaruskij deteminant-2“
VBN – veislė „VB Nojai“
VBV – veislė „VB Vokiai“
VČN – veislė „Čanita“
VKO – veislė „Kora“
VKV – veislė „Kvietka“
VMA – veislė „Mara“
VPA – veislė „Panda“
VSM – veislė „Smuglianka“
VVO – veislė „Volma“
VŽA – veislė „Žaleika“
VŽN – veislė „Žniajarka“
7
ĮVADAS
Vis didėjant susidomėjimui augalinėmis žaliavomis bei galimu jų panaudojimu maisto ir
farmacijos pramonėje ligų prevencijai ar gydymui, atliekami tyrimai, kuriais siekiama nustatyti
augaluose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių sudėtį, jų kiekio priklausomybę nuo aplinkos sąlygų
bei panaudojimo galimybes.
Sėjamųjų grikių augalinė žaliava (sėklos) kaupia azotą turinčius junginius – iminocukrus ir
amino rūgštis. Iminocukrūs – tai hidroksilinti piperidino, pirimidino, indolizidino, pirolizidino ir
nortropano dariniai [1]. Dėl glikozidazę slopinančio poveikio iminocukrūs laikomi potencialiais vaistais
vėžio ir virusinių infekcijų gydymui, o atsparumo insulinui rizikos mažinimas ir antsvorio kontrolė gali
padėti gydyti diabetą [2, 3]. Pirmasis išskirtas šios grupės junginys – fagominas (pirmą kartą buvo
išskirtas iš grikių sėklų 1974 m.) [4]. Maistinė grikių vertė daugiausiai susijusi su jų sudėtyje randamais
baltymais, kurie yra svarbi bio makromolekulių, atsakingų už įvairias fiziologines funkcijas, grupė [5].
Mitybos požiūriu, svarbiausias grikių aspektas – jų sudėtyje esančios nepakeičiamos AR (NAR),
kadangi jos turi anglies skeletą, kurio žmogaus organizmas susintetinti negali, dėl to šių medžiagų
gavimas kartu su maisto produktais yra daug svarbesnis, nei nepakeičiamų AR [6]. Sėjamasis grikis
(Fagopyrum esculentum Moench) – tai vienmetis, 15 – 80 cm aukščio rūgtinių šeimos augalas [7], kuris
gali būti auginamas tiek ekologinės, tiek intensyvios žemdirbystės sąlygomis. Iki šiol nėra sukaupta
pakankamai mokslinių žinių apie fagomino bei amino rūgščių kiekybines variacijas skirtingų grikių
veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sistemomis, sėklose, todėl tikslinga įvertinti šių junginių
pasiskisrtymą ir atlikti perspektyviausių veislių atranką. Gauti tyrimų rezultatai leis nustatyti grikių
kultivavimui tinkamiausią žemdirbystės sistemą ir veisles, kurios išsiskirtų savo biologine sudėtimi,
įvertinti potencialų jų panaudojimą vaistų ar maisto papildų, savo sudėtyje turinčių grikių ekstraktų,
gamybai.
Fagomino ir amino r. turinčių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti pasirinktas masių
spektrometrijos – skysčių chromatografijos metodas. Analičių skirstymui pagal jų hidrofiliškumą
pasirinkta taikyti hidrofilinių sąveikų skysčių chromatografinę (HILIC) kolonėlę, taikomas gradientinės
eliucijos metodas, mobilioji fazė sudaryta iš amonio acetato vandeninio tirpalo (tirpiklis A) ir
acetonitrilo (tirpiklis B).
Darbo tikslas: atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos
– masių spektrometrijos metodu.
8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: atrankiai ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties
įvairavimą sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) veislių sėklose skysčių chromatografijos
– masių spektrometrijos metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti fagomino ir amino rūgščių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios žemdirbystės
sąlygomis 2014/2015 m. užaugintų penkiolikos sėjamųjų grikių veislių sėklose;
2. Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti fagomino varijavimą grikių
veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015 m., sėklose;
3. Skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyti amino rūgščių kiekybinę
sudėtį ir jos varijavimą grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis 2014/2015
m., sėklose.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai
Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) – tai rūgtinių šeimos augalas, kurio aukštis
maždaug 20 – 60 cm. Tai vienametis, liepos – spalio mėnesiais žydintis augalas. Jo apyžiedžio spalvos
varijuoja nuo baltos iki rožinės, apyžiedis 2 – 3 mm ilgio, žiedai balti, susitelkę stangriose galvutėse.
Lapai ieštiški arba strėliški. [7]
Grikių stiebas – maždaug 20 – 60 cm aukščio, šakotas, gali išleisti 10 – 12 šakų. Lapai platūs,
širdiški su dviem prielapiais, šaknis liemeninė, gali užaugti iki 80 – 100 cm ilgio, šakota. Stiebo ir šakų
viršūnėse yra žiedynai. Ant vieno augalo gali būti iki dviejų tūkstančių žiedų, nors didžioji dalis jų lieka
bevaisiai. Pagal žiedų spalvą grikius galima skirti į dvi grupes: rausvus arba gelsvai žalsvus žiedus
turintys grikiai. Šių augalų žiedai nevienodi: vieni turi žiedus, kurių kuokeliai yra aukšti, o piestelės –
trumpos, kitų augalų kuokeliai žemi, o piestelės ilgos (aukštos). Kad grikiai būtų apvaisinti, žiedadulkės
turi patekti nuo žiedų, turinčių aukštus kuokelius, ant žiedų su trumpais kuokeliais. Apvaisinimui padeda
vabzdžiai, ypač bitės. Vaisius – trišonis grūdas, kurio spalva varijuoja nuo rusvos iki rudos. Grūdų dydis
taip pat nevienodas, 1000 grūdų gali sverti nuo 15 iki 30 gramų [8].

1.2. Sėjamųjų grikių paplitimas
Grikiai laikomi viena jauniausių augalinių kultūrų, Senovės Egiptiečiai grikių dar nepažinojo.
Ši kultūra yra kilusi iš Azijos, šiuo metu daugiausiai auginami šiauriniamie pusrutulyje, nors auga
visame pasaulyje. Jie buvo ypač svarbūs kaip maisto šaltinis sausringuose ir šaltuose regionuose. Šiuo
metu Rusija yra didžiausia grikių augintoja, Kinija užima antrą vietą, joje yra maždaug 10,2 milijonų
akrų auginamo ploto, o išauginama produkcija svyruoja nuo 0,6 iki 0,95 milijonų tonų. Lietuvoje grikių
sėjama palyginus nedaug, daugiausiai ten, kur dirvos lengvos, ne tokios derlingos – Varėnos, Alytaus,
Trakų ir kituose rajonuose. [8, 9]
10
1.3. Sėjamųjų grikių kultivavimas
Grikiai auga ir mažai derlingose žemėse, nes turi, nors ir negausias, tačiau ilgas ir stiprias
šaknis, kurios gali imti maistą iš sunkiai pasiekiamų šaltinių. Šis augalas auga palyginus greitai, eant
geroms sąlygoms žydėti pradeda praėjus 25 – 30 dienų nuo sėjos. Vegetacinis periodas trumpas (70 –
85 dienos). Grikių dygimas prasideda esant 7 – 8 ˚C temperatūrai, tačiau esant tokiai temperatūrai
dygimas labai lėtas, o daigai labai susiplnėja, todėl optimaliausia 12 – 17 ˚C temperatūra. Grikiai taip
pat jautrūs šalnoms, net nedidelė šalna (1 - 1,5˚C žemiau nulio) jau gali jiems pakenkti, o karščiai
(daugiau kaip 25˚C) sulaiko augimą, ypač nektaro gamybą, dėl to esant dideliems karščiams grikių
nelanko bitės ir jų neapvaisina. Grikiai išgarina daug vandens, kadangi turi didelius lapus ir negausias
šaknis, todėl kad jos galėtų augalą aprūpinti pakankamu kiekiu drėgmės, dirvoje šios turi būti gana daug.
Palankiausi grikių augimui yra šilti ir lietingi metai. Grikiai gali augti smėlinėse dirvose ar nusausintuose
durpynuose, kadangi turi didelį pakantumą rūgščioms dirvoms. Dirvose, kurios turi daug azoto
(durpinėse dirvose) grikiai užauga labai dideli, gausiai sulapoja, tačiau turi mažai žiedų, o grūdų – dar
mažiau. Tačiau dirvas patręšus fosforo ir kalio trąšomis, galima užauginti didelius derlius [8].

1.4. Fitocheminė sėjamųjų grikių sėklų sudėtis
Daugiausiai sėjamųjų grikių sėklos yra vartojamos kaip maistinė žaliava – miltų, košių,
sausainių, alaus ir daugybės kitų produktų gamybai [10, 11]. Apžvelgus atliktus sėjamųjų grikių sėklų
fitocheminių tyrimų rezultatus, nustatyta, kad sėklose yra gausus krakmolo bei kitų junginių, tokių kaip
baltymai, antioksidantai, mikroelementai ir maistinės skaidulos [12, 13]. Pilnagrūdžiuose grikiuose yra
krakmolo, riebalų, lipidų, tirpių angliavandenių, maistinių skaidulų ir kitų medžiagų: flavanoidų (rutino,
orientino, kvercetino, viteksino), vitaminų (B1, B2, B3, B5, B6, C), vitamino E (R-tokoferolio),
inozitolių (D-chiro-inozitolio), fagopirinų, kurie gali sukelti fotosensibilizaciją, ir kt. [13–15], kurios
įvairiai pasiskirsto skirtingose grūdo dalyse [16]. Grikių sėklose randama maždaug 10 – 18% baltymų
[17, 18], kurie turi reikšmingą maistinę vertę, kadangi juos gali vartoti ir glitimo netoleruojantys žmonės
[10]. Baltymų kiekis grikių sėklose ir miltuose yra panašus ar nežymiai didesnis nei kviečių grūduose ir
miltuose, tačiau ženkliai didesnis nei kitose grūdinėse kultūrose (ryžiuose, kukurūzuose). Lyginant su
kviečiais, grikiuose randamas panašus arba didesnis visų AR, išskyrus glutamino ir prolino, kiekis [19].
Grikių baltymuose, lyginanat su kitomis grūdinėmis kultūromis, aptinkami didesni lizino ir arginino
kiekiai, juose visų amino rūgščių, išskyrus glutamo rūgštį ir proliną, yra daugiau negu kviečiuose [16].
Grikių sėklose taip pat randama iminocukrų (D-fagomino, 1-deoksinojirimicino), dauguma jų paprastai