Etude de la régulation pharmacologique des canaux ioniques ASIC par des toxines animales

270 Pages·2016·29.14 MB·French

UNIVERSITE DE NICE-SOPHIA ANTIPOLIS – UFR Sciences
École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

T H E S E

Présentée pour obtenir le titre de

DOCTEUR en SCIENCES
de l’Université de Nice-Sophia Antipolis
Mention : « Interactions moléculaires et cellulaires »
Présentée et soutenue par :

Thomas BESSON

UMR 7275 CNRS / UNS - IPMC - Sophia Antipolis

Etude de la régulation pharmacologique des
canaux ioniques ASIC par des toxines
animales

Codirigée par le Dr Eric LINGUEGLIA et le Dr Miguel SALINAS

Soutenue le 12 décembre 2016 devant le jury, composé de :

Prof. Laurent COUNILLON Président de jury
Prof. Jan TYTGAT Rapporteur
Dr. Michel DE WAARD Rapporteur
Dr. Nicolas GILLES Examinateur
Dr. Miguel SALINAS Directeur de thèse
Dr. Eric LINGUEGLIA Directeur de thèse

Remerciement

Par ces quelques lignes, je tiens à exprimer mes remerciements aux personnes qui
m’ont permis d’arriver au bout de ma thèse.

Tout d’abord, Merci au docteur Eric Lingueglia, mon directeur de thèse, qui a su me
faire confiance et m’accorder beaucoup de liberté durant ces trois années. Peu de directeurs
d’équipes auraient autorisés leur étudiant à amener un serpent à l’institut ou encore à
démonter la moitié des équipements du laboratoire. Je vous suis reconnaissant de m’avoir
accordé votre confiance.

Lors de l’obtention de mon diplôme de Master, Je n’étais pas le meilleur des étudiants
ni semble-t-il, le plus facile à vivre. Je tiens donc tout particulièrement à remercier le docteur
Miguel Salinas, également mon directeur de thèse, d’avoir cru en moi en me demandant d’être
son étudiant en thèse. Il n’a jamais renoncé à m’encadrer et a su me faire partager sa
connaissance et sa passion pour la biologie structurale. Je lui adresse toute mon affection car il
a été et restera mon mentor pour de nombreuses années.
J’adresse également toute ma reconnaissance au docteur Sylvie Diochot pour partager
la même folie passion que moi, pour les animaux venimeux. Sa connaissance des toxines, sa
passion pour son travail et sa bonne humeur m’ont permis de vivre pleinement ce pour quoi
je me suis initialement inscrit à la faculté des sciences.
Bien sûr, ce travail de thèse n’aurait pu être mené à bien sans la disponibilité et
l’accueil chaleureux de l’ensemble des membres de l’équipe et tout particulièrement Valérie
pour sa disponibilité, son soutien et les multiples discussions culinaires et variées que nous
avons eues durant ces trois années.
J’adresse également toute mon affection à mes ami(e)s qui vont me manquer après mon départ
et je pense notamment à Seb Mo, Malika, Celine2, Jenny, Sandy, Sonia et Nath, ainsi que toutes
les personnes formidables que j’ai rencontrées par le biais de l’IPMC.

Il est aussi très important à mon sens, de remercier toutes les personnes dans l’ombre
qui m’ont permis de travailler sur ce projet mais aussi de soutenir ma thèse. Je remercie donc l
le CNRS et le Labex ICST de m’avoir financé durant ces trois années, l’IPMC de m’avoir
accueilli ainsi que l’université de Nice de m’avoir formé tout au long de ma scolarité. Sans
oublier bien sûr, l’ensemble des membres de mon jury de thèse d’avoir évalué ce travail et
permis son aboutissement.

Enfin, le plus important pour moi, je tiens à remercier l’ensemble des membres de ma Famille.
Mes parents, qui ont toujours cru en moi depuis ma naissance, ils m’ont donné et continuent à
me donner la force de réaliser mes rêves sans y mettre aucune limite, mais au contraire en y
apportant leur soutien et leur force morale. Ma sœur, qui compte énormément pour moi et qui
sait toujours se rendre disponible et chaleureuse envers moi. Mes grands-parents dont je suis
très fier et qui m’ont transmis énormément d’amour. Ma marraine, qui fut mon premier lien
avec la science et avec qui je partage cette passion dévorante et enfin Delphine, qui en plus de
supporter mon caractère et mes méthodes de rangements atypiques remplie de bonheur mon
quotidien.

2

Sommaire
Liste des abréviations ............................................................................................................5
Table des illustrations ............................................................................................................7
Introduction ...........................................................................................................................9
1. Histoire de la découverte des toxines animales et de l’utilisation des venins : .......................... 10
2.Rôle et fonction des venins : ..................................................................................................... 12
3.Les différentes classes et groupes d'animaux venimeux ou vénéneux (contenant du poison): ... 13
3.1 Les vertébrés venimeux : .................................................................................................................. 14
3.1.1 Généralités dans la classe des reptiles (Reptilia) : ........................................................................................ 14
3.1.2 Généralités dans la classe des poissons : ..................................................................................................... 14
3.1.3 Généralités dans la classe des mammifères (Mammalia) : ........................................................................... 15
3.2 Les vertébrés contenants du poison: ................................................................................................. 15
3.2.1 Généralités dans la classe des amphibiens (Amphibia) : ............................................................................... 15
3.2.2 Généralités dans la classe des oiseaux (Avia) : ............................................................................................. 16
3.3 Les venins des invertébrés : .............................................................................................................. 16
3.3.1 Généralités dans la classe des insectes:....................................................................................................... 16
3.3.2 Généralités dans le sous embranchement des Chélicérates: ........................................................................ 17
3.3.3 Généralités dans le sous-embranchement des myriapodes : ........................................................................ 17
3.3.4 Généralités dans le sous embranchement des crustacées : .......................................................................... 17
3.3.5 Généralités dans l’embranchement des cnidaires : ...................................................................................... 18
3.3.6 Généralités dans l’embranchement des Echinodermes:............................................................................... 18
3.3.7 Généralités dans l’embranchement des mollusques : .................................................................................. 18
3.3.8 Généralités dans l’embranchement des céphalopodes : .............................................................................. 19
4. Composition des venins : .......................................................................................................... 19
5. Effets nocifs des venins et poisons sur les organismes : ............................................................ 20
5.1 Effets neurotoxiques : ....................................................................................................................... 21
5.2 Effets hémotoxiques : ....................................................................................................................... 21
5.3 Effets cytotoxiques : ......................................................................................................................... 22
5.4 Effets sur le système immunitaire : ................................................................................................... 22
6. Effets bénéfiques de l’utilisation des toxines animales comme remèdes : ................................ 22
7. Découverte de nouvelles cibles pharmacologiques, les canaux ioniques : ................................. 23
8. Utilisation des toxines pour comprendre la douleur : ............................................................... 47
9. Les Canaux ASIC : ..................................................................................................................... 27
9.1 Fonctions biologiques des canaux ASIC : ............................................................................................ 27
9.1.1 Les canaux ASIC dans le système nerveux central: ....................................................................................... 27
9.1.2 Les canaux ASIC dans la douleur inflammatoire et la nociception : ............................................................... 28
9.1.3 Les canaux ASIC et la mécanosensibilité : .................................................................................................... 29
9.1.4 Les canaux ASIC dans l’homéostasie cardiovasculaire: ................................................................................. 30
9.2 Structure des canaux ASIC: ................................................................................................................ 31
9.2.1 Organisation structurale du canal : ............................................................................................................. 31
9.2.2 Les différents états des canaux ASIC: .......................................................................................................... 32
9.2.3 Pore des canaux ASIC : ............................................................................................................................... 32
9.2.4 Les senseurs de protons des canaux ASIC : .................................................................................................. 33
3

9.3 Propriétés pharmacologiques: .......................................................................................................... 34
9.3.1 Dépendance au pH : ................................................................................................................................... 67
9.3.2 Les modulateurs des canaux ASIC : ............................................................................................................. 35
Les ions: ........................................................................................................................................................ 35
Toxines animales: .......................................................................................................................................... 36
Autres substances naturelles : ....................................................................................................................... 38
Petites molécules : ........................................................................................................................................ 39
Autres molécules : ......................................................................................................................................... 40
Problématiques et méthodes de recherche ..........................................................................41
Première partie : Recherche de nouvelles toxines ciblant les canaux ASIC ..........................44
1. Le prélèvement de venin dans la nature : ................................................................................. 45
1.1 Article 1 : Conception d’un extracteur de venin à faible coût pour l’extraction électrique de venin
d’arthropodes et autres petits animaux. ......................................................................................... 45
1.1.1 Analyse des besoins: .................................................................................................................................. 46
1.1.2 Choix des matériaux et de l’ergonomie : ..................................................................................................... 46
1.1.3 Extraction du venin de Zoropsis spinimana : ................................................................................................ 47
1.1.4 Conclusion : ............................................................................................................................................... 47
ARTICLE 1: Low cost venom extractor based on Arduino® board for electrical venom extraction from arthropods
and other small animals ...................................................................................................................................... 49
1.2 Extraction de venin d’Anémone de mer : ........................................................................................... 53
1.2.1 Récolte et prélèvement des échantillons : ................................................................................................... 53
1.2.2 Extraction et purification : .......................................................................................................................... 54
1.2.3 Caractérisation biochimique du venin d’Actinia schmidti : ........................................................................... 54
1.2.4 Conclusion : ............................................................................................................................................... 55
2. Utilisation de venins commerciaux : ......................................................................................... 55
2.1 Le fractionnement du venin de Pandinius imperator semble affecter son activité inhibitrice sur les
canaux ASIC1a : ...................................................................................................................................... 56
2.2 Le fractionnement des venins d’Heterometrus mysorensis et d’Heterometrus laoticus révèle une
activité inhibitrice des premières fractions (non peptidiques) :................................................................ 56
2.3 L’inhibiteur de Zinc N,N,N’,N’–Tetrakis (2-pyridylmethyl) éthylènediamine bloque les effets inhibiteurs
des fractions 1 de Heterometrus mysorensis et Heterometrus laoticus : .................................................. 57
2.4 Conclusion : ................................................................................................................................... 113
Seconde partie : Etude du mécanisme d’ouverture des canaux ASIC et de leur régulation
par des toxines .....................................................................................................................59
1. Article 2 : Etude du site d’action et du mécanisme d’inhibition de la mambalgine-2 sur les
canaux ASIC1a : ............................................................................................................................ 60
1.1 Contexte de l’étude : ........................................................................................................................ 60
1.2 Résultats : ......................................................................................................................................... 61
ARTICLE 2 : Binding site and inhibitory mechanism of the mambalgin-2 pain-relieving peptide on acid-
sensing ion channel 1a............................................................................................................................ 64
2. Article 3: Identification des domaines fonctionnels de la Mambalgine-1 permettant l’inhibition
des canaux ASIC1a ....................................................................................................................... 71
2.1 Contexte de l’étude : ........................................................................................................................ 71
2.2 Résultats : ......................................................................................................................................... 72

4

ARTICLE 3: Mambalgin-1 pain-relieving peptide, stepwise solid-phase synthesis, crystal structure, and
functional domain for acid-sensing ion channel 1a inhibition .................................................................. 75
3. Article 4 : Une nouvelle approche basée sur la pharmacologie pour analyser le mécanisme
d’ouverture des canaux ASIC ........................................................................................................ 91
3.1 Contexte de l’étude : ........................................................................................................................ 91
3.2 Résultats : ......................................................................................................................................... 92
ARTICLE 4: A pharmacology-based approach to analyze the pH-dependent gating of Acid-Sensing Ion
Channels ................................................................................................................................................ 97
Conclusions générales et perspectives ............................................................................... 116
Annexes ............................................................................................................................. 120
1. Méthodes chirurgicales de prélèvement d’ovocytes de Xenopus laevis par Ovariectomie ...... 121
1.1 L’anesthésie : ................................................................................................................................. 121
1.2 Chirurgie : ...................................................................................................................................... 122
1.3 Réveil : ........................................................................................................................................... 123
2. Préparation et conservation des ovocytes de Xenopus laevis : ................................................ 123
Références bibliographiques .............................................................................................. 124

5