et les petits ARN nucléaires des

489 Pages·2009·28.13 MB·French

AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de
soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la
communauté universitaire élargie.

Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci
implique une obligation de citation et de référencement lors de
l’utilisation de ce document.

D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite
encourt une poursuite pénale.

Contact : [email protected]

LIENS

Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4
Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10
http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
S.C.D. "' UJ·tP, Nt~Nev 1
BiBLIOTHÈQUE DES SCIENCES
Hue du Jardin Botanique
.1'}!;600 VILLERS-LES-NANCY
Faculté des Sciences
UFR Sciences et Techniques Biologiques
Ecole Doctorale Biologie et Santé
Laboratoire de Maturation des ARN et Enzymologie Moléculaire
Thèse
Présentée pour l'obtention du titre de
Docteur de l'Université Henri Poincaré, Nancy 1
Biologie Structurale Moléculaire et Cellulaire
Par Séverine MASSENET
Identification des résidus pseudouridines dans les ARN
ribosomiques d'Archaea et les petits ARN nucléaires des
spliceosomes majeurs et mineurs, recherche et
caractérisation de pseudouridine-synthases chez
Saccharomyces cerevisiae.
Soutenance publique prévue le 23 décembre 1999 devant la commission d'examen:
Membres du Jury:
Président:
M. B. Decaris Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy
Rapporteurs:
Mme J. Banroques Chargée de Recherche CNRS, Gif-sur-Yvette
M. R. Giegé Directeur de Recherche CNRS, Strasbourg
Examinateur:
M. H. Grosjean Directeur de Recherche CNRS, Gif-sur-Yvette
Directeur de thèse:
Mme C. Branlant Directeur de Recherche CNRS, Nancy
Yi mes parents
"f'- "
". ,-,.!.'"
Je tiens à e:rprimer ma gratitutU. à Monsieur Ce Professeur yuy 'Bran[ant pour m'avoir accuei{[ie aans son
ra60ratoire et permis tU. réariser ce travail.
J'ai à cœur a'e:rprimer ma reconnaissance à Maaame Christiane 'Bran[ant qui a airigé ce travai[ et qui m'a
permis ae aécouvrir Ce monae passionnant aes JI.2?..<J{ Par ses conseifs continus, sa rigueur et son
enthousiasme, die a su me guwer sans rerâche jusque aans [a récfaction ae ce mémoire. Je Cui suis très
reconnaissante ae [a formation scientifique qu'e{[e m'a aonnée, ainsi que tU. [a possi6ifité qu'e[{e m'a offerte
ae présenter mon travai[ aans ae nomGreu?( congrès nationau?( et internationau7(;
Je suis très sensiMe à ['honneur que me font Maaame Josette 'Banroques et Monsieur 'RJcharci yiegé,
ci'accepter ci'être rapporteurs cie ce mémoire. Je remercie aussi vivement Monsieur J{enri yrosjean et
Monsieur 'Bernarci 'Decaris ci'avoir accepté cie juger cette thèse.
Je tiens à remercier spéciafement J{enri yrosjean pour sa co[raGoration qui a été essentie[{e au Gon
ciérouCement tU. mon travail, pour m'avoir permis tU. travai[{er à p[usieurs reprises aans son [aGoratoire et
pour [es nom6reu?( échanges scientifiques et amicau?( que nous avons eus.
Je remercie égarement Yuri Motorin qui a Geaucoup contriGué à ['avancement cie ce travaiL Ses conseifs, [ors
cie [a récfaction cie ce manuscrit, m'ont égaCement été très précieu7(;
Mes remerciements vont égafement à r:r{orence et à :;{uGert qui ont renciu, par [eur genti{{esse, mes séjours à
yif-sur-yvette très agréaMes.
Mes pensées vont tout particu[ièrement "au?(filCes ciu GO?( 3" pour Ceur aitfe tout au [ong cie ce travail, [eur
gaieté et ra cha[~ureuse am6iance qu'e{{es ont su créer: .9l.nnie, Sanarine, 'Véronique et Yrançoise. Mes
remerciements vont égarement à !saGe{{e, ra petite aernière, qui a apporté un regara neuf sur [e sujet et qui
m'a Geaucoup soutenue aussi Gien scientifiquement que mora[ement.
Je remercie sincèrement 'Véronique S. et 'J{çLtfia[ie y. pour feur Gonne humeur, feur encouragement et [eur
précieu?( concours rors ae [a récfaction ae ce manuscrit.
Je remercie égarement .9l.gnès et .9l.nnie pour Ceurs conseifs avisés sur [a partie épissage et 'J\(jco[as 'Brosse pour
son aic!e concernant [a réaction chimique cie ['anifine.
%es remerciements vont égarement à tous [es memGres ciu [a60ratoire pour {'amGiance agréa6[e cie travai[
qu'ifs ont su créer et p[us particu{ièrement à Jack;; qui m'a gentiment évité [es a{{ers et retours à [a
GiMiotlièque [ors cie [a réâaction cie ce manuscrit.
Je remercie tout spécia[ement 'Valérie (et Jllain), Sanarine et 'Vincent pour [eur amitié et [eur aic!e. Leur
soutien au raGoratoire et nos moments ci'évasion [e temps a'un weei(:enci ou ci'une semaine m'ont été très
précieu7(; Mes pensées vont particu[ièrement à 'Vincent pour Ce chemin que nous avons parcouru ensem6[e
riepuis Ce '1YEJi'L, pour sa compréfiension et son soutien moral aans Ces moments âifficiles.
Je tiens sincèrement à remercier ma sœur et sa petite familCe pour Ceur présence à mes côtés et [es moments rie
âétente qu'ifs m'ont apportés tout au Cong rie ces années. Mes remerciements vont également à tous mes amis
qui ont su me supporter sans reCâcfie et particu[ièrement à ;llnna6e{{e qui, Gien qu 'doignée
géograpfiiquement, m'a apporté un soutien continu.
'Enfin, mes pensées vont tout spécia[ement à mes parents que je remercie sincèrement â'avoir âepuis toujours
été à mes côtés, â'avoir toujours cru en moi et âe m'avoir soutenue sans conâition âans mes projets. Sans [eur
présence, ce travai[ n'aurait jamais vu Ce jour.
" c: '1, .~ f: -"-,,;
ABREVIATIONS ET ANGLICISME
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
ARN : acide ribonucléique
ARNm : acide ribonucléique messager
ARNr : acide ribonucléique ribosomique
ARNt : acide ribonucléique de transfert
ATP : adénosine 5' triphosphate
oC : degré celsius
Ci : curie
CMCT : l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl) carbodiimide métha-p-toluène
cpm : coups par minute
Da, KDa : dalton, kilodalton
db : double brin
ddNTP : didésoxyribonucléotide triphosphate
DNase : désoxyribonucléase
DMS : diméthylsulfate
dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate
DIT : dithiothréitol
EDTA : éthylène diamine tétraacétate
h : heure
intron U2-dépendant : intron épissé par les spliceosomes U2-dépendants
intron U12-dépendant: intron épissé par les spliceosomes U12-dépendants
Kb : kilobase
min : minute
nt : nucléotide
pb : paire de base
PEG : polyéthylène glycol
pGAL : promoteur galactose dépendant
pré-ARNm : précurseur de l'ARN messager
pré-ARNr : précurseur de l'ARN ribosomique
pré-ARNt : précurseur de l'ARN de transfert
qsp : quantité suffisante pour
R : purine
RNasine : inhibiteur des ribonucléases
RT : reverse transcriptase
S : Svedberg
sb - : simple brin
structure 2D : structure secondaire
structure 3D : structure tertiaire
RN ase : ribonucléase
U : unité enzymatique
'fi : pseudouridine
y : pyrimidine
Anglicisme: certains termes n'ont pas de traduction française, ou leur traduction est d'usage peu
courant. Ces termes ont été gardés en anglais.
BMV : brome mosaïc virus
ETS : extemal transcribed sequence
hnRNP : particule ribonucléoprotéique nucléaire hétérogène (Heterologous Nuclear
Ribonucleoprotein Particules)
ORF : phase ouverte de lecture (Open Reading Frame)
PCR : amplification en chaine par une polymérase (polymerase chain reaction)
snoRNA : petit ARN nucléolaire (Small nucleolar RNA)
snRNA : petit ARN nucléaire (Small nuclear RNA)
snoRNP : particule ribonucléoprotéique contenant un ou des petits ARN nucléolaires (Small
nucleolar ribonucleoprotein particule)
snRNP : particule ribonucléoprotéique contenant un ou des petits ARN nucléaires (Small
nuclear Ribonucleoprotein Particule)
spliceosome : complexe nucléaire ribonucléoprotéique dans lequel ont lieu les réactions d'épissage
spliceosome U2-dépendant : spliceosome nécessitant le snRNA U2 afin de catalyser la réaction
d'épissage
spliceosome U12-dépendant: spliceosome nécessitant le snRNA UI2 afin de catalyser la réaction
d'épissage
TYMV : turnip yellow mosaic virus
Sommaire
: .. '1 (1 '-, ~., r "' ,-, '\ ,"~,"'/l c:l
'i
Avant-propos
Introduction
Partie 1: L'épissage des introns des ARN pré-messagers nucléaires ............ 3
AI Généralités: l'épissage, plusieurs mécanismes pour une même fonction ................. 4
BI Les ARN impliqués dans l'épissage spliceosomal...................................................... 6
1. Les ARN pré-messagers: introns et bordures exoniques ................................................ 6
1. 1. La séquence en 5'.. .......... ........... ................ ........ ..... ..... ............ ...... .... ..... .......... 7
1. 2. Les boîtes de branchement................................................................................ 8
1. 3. Le site d'épissage en 3' ...................................................................................... 10
2. Les UsnRNA ................................................................................................................. 11
2. 1. Un motif commun aux UsnRNA: le site Sm .................................................... 13
2.2. Les motifs spécifiques à chaque UsnRNA ....................................................... 13
2. 2. 1. Les snRNA U1 et U11 13
a) L'interaction entre le snRNA U1 ou U11 et le site 5' d'épissage 13
b) Les régions d'interaction des protéines spécifiques au snRNA U1 15
2.2.2. Les snRNA U2 et U12 16
a) L'interaction entre le snRNA U2 ou U12 et la boîte de branchement 16
b) La structure primaire et secondaire des snRNA U2 et U12 17
c) Les régions d'interaction des protéines spécifiques du snRNA U2 18
2.2.3. Le snRNA U5 19
a) Les différents variants du snRNA U5 19
b) L'interaction du snRNA U5 avec les deux exons 19
c) Interaction du snRNA U5 avec les protéines de la tri-snRNP [U4/U6.U5]
20
2. 2.4. Les snRNA U4 et U6 et les snRNA U4atac et U6atac 21
a) Les séquences primaires et secondaires des snRNA U4, U4atac, U6 et
U6atac 21
b) Les duplex d'ARN U4/U6 et U4atac/U6atac 21
c) L'interaction des snRNA U6 et U6atac avec le site 5' d'épissage 23
d) L'interaction du duplex d'ARN U4/U6 avec les protéines qui lui sont
associées 24
CI Les UsnRNP .................................................................................................................... 24
1. Bi_ogenèse des UsnRNP ................................................................................................. 25
2. Les protéines communes ................................................................................................ 26
2. 1. Les protéines Sm .............................................................................................. 26
2. 1. 1. Nature et conservation phylogénétique 26
2. 1. 2. Les protéines Sm sont essentielles pour la constitution des spliceosomes
actifs 27
2. 1. 3. La formation des pré-particules 27
2. 1. 4. Reconnaissance entre protéines Sm et site Sm 28
2. 1.5. Les protéines "Sm like" 29
2. 2. Le complexe SMNISIP1 .................................................................................. 29
3. Maturation des extrémités 3' des UsnRNA et formation de la pré-particule .................. .30
4. Les protéines spécifiques à chaque U snRNP ................................................................. 31
4. 1. Les domaines fonctionnels des protéines spécifiques à chaque UsnRNP ......... 31
4.2. La snRNP U1 ................................................................................................... 33
4. 3. La snRNP U2 ................................................................................................... 34
4. 4. La snRNP U6 ................................................................................................... 35
4. 5. La snRNP U4/U6 ............................................................................................. 35
4. 6. La snRNP U5 ................................................................................................... 35
4. 7. La tri-snRNP [U4/U6.U5] ............................................................................... 37
5. Les protéines des UsnRNP des spliceosomes U12-dépendants ..................................... 38
DI Les complexes spliceosomaux et les interactions ARN-ARN mises en jeu
lors de l'assemblage et de l'action du spliceosome ........................................................... 38
1. Le complexe H ou hnRNP ............................................................................................. 39
1. 1. La composition en protéines ............................................................................. 39
1. 2. Reconnaissance des exons et des introns ......................................................... .40
2. Le complexe d'engagement. ............................................................................................ 41
3. Les pré-spliceosomes (complexe A chez les mammifères ou B chez S. cerevisiae) ....... .43
4. Le complexe B (nomenclature vertébrés) ........................................................................ 44
4. 1. Les interactions U2/U6 et Ul2/U6atac ............................................................. 45
4. 2. Les transitions U4/U6:=}U2/U6 et U4atac/U6atac:=}U2/U6atac ...................... .47
4. 3. Les transitions Ul/site 5':=}U6/site 5' et Ull/site 5':=}U6atac/site 5' ................. 48
4. 4. La formation du premier complexe actif est un mécanisme concerté,
faisant intervenir à la fois les UsnRNA et les protéines des UsnRNP ..................... .48
5. Le complexe C: le spliceosome (nomenclature vertébrés) ............................................... 49
6. Les interactions ARN-ARN au sein des complexes spliceosomaux actifs ...................... 52
7. Les régulations de l'épissage et rôles des protéines SR .................................................. 53
El Le point de vue phylogénétique. .................................................................................... 55
1. Un ancêtre commun aux introns des ARN pré-messagers nucléaires et aux
introns de groupe II? .......................................................................................................... 55
2. Modèle proposé pour la génération de deux systèmes distincts d'épissage des
ARN pré-messagers nucléaires .......................................................................................... 57
Partie 2: Les résidus pseudouridines portés par les ARN:
localisation, biosynthèse et rôles ................................................................................ 59
AI Généralités ....................................................................................................................... 60
BI Localisation des résidus '1' et des autres nucléotides modifiés dans les ARN:
un premier pas vers la connaissance de leur fonction ..................................................... 61
1. Localisation dans les ARNt ............................................................................................ 61
2. Localisation dans les ARNr ............................................................................................ 62
3. Localisation dans les UsnRNA ...................................................................................... 63
CI Les 'l'-synthases .............................................................................................................. 64
1. Identification des 'l'-synthases ....................................................................................... 64
2. Mécanisme d'action des 'l'-synthases ............................................................................. 65
3. Spécificité de reconnaissance des 'l'-synthases .............................................................. 67
3. 1. La spécificité de reconnaissance des ARN par les 'l'-synthases ne
_ nécessitant pas de guides de modification ................................................................. 68
3. 1. 1. Les différentes classes d'enzymes 68
3. 1. 2. Reconnaissance d'une séquence ou d'une structure? 69
a) Cas des ARNr:'I'-synthases dIE. coli 69
b) Cas des ARNt et UsnRNA:'I'-synthases procaryotes et eucaryotes.
Comparaison avec les autres enzymes de modification des ARNt 70
3.2. Les snoRNA guides nucléolaires des 'l'-synthases modifiant les ARNr
eucaryotes ................................................................................................................. 72
3.2.1. Les snoRNP à boîtes HlACA 73
a) Structure et mode d'action des snoRNA HIA CA 73
b) Les protéines des snoRNP HlACA 74
3. 2. 2. Les snoRNP à boîtes CID 76
a) Structure et mode d'action des snoRNA CID 76
b) Les protéines des snoRNP CID 76
3. 2. 3. Y a-t-il des ARN guides pour la modification d'autres ARN que les
ARNr eucaryotes 77