Espectrometria de massa aplicada ao estudo da reacção de Maillard

437 Pages·2007·5.24 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
Departamento de Química e Bioquímica
Espectrometria de massa aplicada ao
estudo da reacção de Maillard
Marco António Gomes Saraiva
Doutoramento em Química
(Química analítica – Espectrometria de massa)
Lisboa, 2007
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
Departamento de Química e Bioquímica
Espectrometria de massa aplicada ao
estudo da reacção de Maillard
O trabalho de investigação, de que se ocupa a presente dissertação, foi
realizado no laboratório de espectrometria de massa & cromatografia – II,
da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, sob a orientação da
Professora Doutora Maria Helena Ferreira da Silva Florêncio e co-
orientação do Professor Doutor Carlos Manuel Ferreira de Sousa Borges.
Marco António Gomes Saraiva
Doutoramento em Química
(Química analítica – Espectrometria de massa)
Lisboa, 2007
Agradecimentos
Agradecimentos.
Na realização deste trabalho muitas foram as pessoas, e “não pessoas”, que
contribuiram, directa ou indirectamente, para o seu bom curso.
Primeiramente, gostaria de agradecer à Universidade de Lisboa e à Faculdade de
Ciências da Universidade de Lisboa pelo acolhimento do trabalho de Doutoramento que
resultou na elaboração da presente dissertação. Agradeço ainda à Fundação para a
Ciência e a Tecnologia do Ministério da Ciência e do Ensino Superior pelo
financiamento.
O trabalho, de que se ocupa a presente dissertação, foi realizado no Departamento de
Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, sob a
orientação da Professora Doutora Helena Florêncio e co-orientação do Professor Doutor
Carlos Borges. Relativamente à pessoa da Professora Helena Florêncio, tenho a
agradecer profundamente o seu entusiasmo e o seu interesse no trabalho desenvolvido,
bem como a sua persistência e dinamismo, que também muito contribuiram para o meu
crescimento profissional. Em adição, expresso a minha franca gratidão pela
compreensão da Professora Helena Florêncio, pelo seu suporte e apoio, e até mesmo
pela sua palavra amiga. O meu muito obrigado. Na pessoa do Professor Carlos Borges,
gostaria de agradecer pelo seu auxílio na parte de execução experimental e nas questões
de operacionalidade do instrumento de massas. Não posso deixar de agradecer a sua boa
disposição, o seu suporte e preocupação.
Tenho a agradecer ao Doutor Carlos Cordeiro e à Professora Doutora Ana Ponces Freire
pela sugestão do tema do trabalho de investigação e pela orientação e auxílio prestados
nas primeiras experiências laboratoriais. Gostaria de agradecer o muito bom
acolhimento do grupo de enzimologia, e pelos momentos divertidos que se
proporcionaram no grupo. Tenho forçosamente de agradecer os ensinamentos do Doutor
Carlos, que se compreedem a diversos níveis, desde na execução experimental a
critérios mais alargados. Ao Ricardo e à Marta Silva, agradeço muito o seu apoio e
palavra amiga. Que tudo vos corra sempre pelo melhor! Desde já agradeço, também, ao
Luís e ao Hugo, também elementos do grupo de enzimologia.
i
Agradecimentos
O meu agradecimento recai também sobre a Professora Doutora Susana Santos, pela sua
disponibilidade, prontidão, e pelo auxílio prestado, na execução de algumas
experiências na sua área de especialidade.
No grupo de espectrometria de massa ambiental e biológica, gostaria de agradecer à
Professora Doutora Tereza Fernandez pela sua seriedade e boa disposição, e por alguns
acontecimentos relatados sobre o seu precurso académico, que, pelo menos, a mim, me
animavam bastante. Um agradecimento à Professora Doutora Filomena Duarte.
Às pessoas da salinha, que são muitas, quero expressar o meu agradecimento sobre o
seu contributo para o meu crescimento como pessoa. Gostaria de agradecer também o
auxílio prestado e pelos momentos divertidos que passamos juntos.
Queria agradecer ao Luís Moreira pela sua amizade e ao grupo de estrutura e
reactividade química, à Carmo pelas conversas várias e pelos momentos de franca
diversão. Um agradecimento particular à América, pela sua simpatia.
Agradeço ainda a outras pessoas que me ajudaram neste precurso, dentro e fora da
Faculdade, e que foram várias. Dra. Alexandre e Guiomar, muito obrigado! À amizade
da Eduarda e do Jorge. Um agradecimento muito especial à Ana Sílvia e ao Carlos, pela
sua amizade e hospitalidade.
Resta-me, embora não menos importante, agradecer à minha família mais estrita. À
minha mãe agradeço, uma vez que as palavras não servem para estes momentos. Um
agradecimento ao meu irmão.
ii
Resumo
Resumo.
A reacção de Maillard tem a sua bem reconhecida importância no campo da
química alimentar e, mais recentemente, in vivo. Os grupos amina de aminoácidos,
como a lisina e a arginina, têm um destaque particular ao nível da reacção de Maillard,
dada a sua importante reactividade. Apesar da referida reacção respeitar às modificações
dos grupos amina de aminoácidos com os açúcares redutores, tem-se verificado que, no
decurso da reacção, se formam espécies dicarbonílicas, mais reactivas que os açúcares
de partida, isto ao nível de quase todas as etapas da referida reacção. Tendo atenção que
os compostos (cid:1)-dicarbonilo são extremamente reactivos e francamente versáteis na sua
reactividade com os grupos amina de aminoácidos, optou-se neste trabalho de
investigação por se estudar as reacções dos aminoácidos modificados, acetil-lisina e
acetil-arginina, e formas derivadas destes compostos, como a guanidina e a
aminoguanidina, com um conjunto de (cid:1)-dicarbonilos aldeídicos e dicetónicos. Tendo
em consideração que a espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS)
é uma técnica extremamente vantajosa para o estudo de processos reactivos em solução,
em particular para matrizes de compostos relativamente simples, recorreu-se a esta
técnica e à espectrometria de massa tandem para a identificação e caracterização das
espécies moleculares intervenientes nas reacções dos compostos amina com os (cid:1)-
dicarbonilos selecionados. Na base da metodogia adoptada foi investigado o processo
de formação de iões na fase gasosa, segundo as condições usadas em ESI-MS, e
também foram estudados alguns detalhes do mecanismo de ionização por electrospray,
em particular no que respeita ao comportamento observado em alguns dos componentes
das misturas reaccionais em questão. Ao nível das misturas reaccionais, os produtos de
reacção identificados com base na análise ESI e alguma informação relativa às suas
reacções de formação permitiram concluir que os resultados são francamente
concordantes com os da literatura, em particular para os sistemas reaccionais mais
investigados. Neste trabalho, em geral, reuniu-se um importante conjunto de informação
mecanística para as reacções em questão, com o estabelecimento de algumas
considerações para os processos de glicação relacionados. Nestes últimos processos e
nos estudados neste projecto, a reacção de Maillard encontra-se francamente mais bem
compreendida, e com um destaque particular no contexto actual da reacção de Maillard
in vivo.
iii
Abstract
Abstract.
The importance of the Maillard reaction, in the food chemistry area, and, more
recently, in vivo, has long been recognized. The amino groups of amino acids, such as
those in lysine and arginine, play a particular role in the Maillard reaction due to their
enhanced reactivity. Although the Maillard reaction is formerly known as the reaction
of amino acids amino groups with reducing sugars, it has been noted that dicarbonylic
species are formed in the course of the reaction, and they are also more reactive than the
starting reducing sugars. In fact, these mentioned dicarbonylic species are known to be
formed in every stage of the Maillard reaction. Considering that (cid:1)-dicarbonyl
compounds are extremely reactive and versatile species in their reaction with amino
acids amino groups, in this dissertation the reactions of the blocked amino acids, acetyl-
lysine and acetyl-arginine, and derivatives, such as guanidine and aminoguanidine, with
selected aldehydic and diketonic (cid:1)-dicarbonyls, were investigated. Since electrospray
ionization mass spectrometry (ESI-MS) is becoming a suitable tool for studying
chemical processes in solution, especially those that do not offer great complexity, this
technique, together with tandem mass spectrometry were used, to identify and
characterize intervenient molecular species in the reactions of amino compounds with
the selected (cid:1)-dicarbonyls. Within the methodology used, the conversion process of
solution ions into gas phase isolated ionized entities, under ESI-MS conditions, was
investigated, and details from the electrospray mechanism were also studied, with
respect to the observed behaviour of some components of the reactions mixtures in
question. In reaction mixtures investigations, the identified reaction products, under
ESI-MS, and some information concerning their formation, led to conclude that the
results here obtained are in good agreement with literature ones, for the reaction systems
more investigated, especially. In the overall, in the present study, a significant amount
of mechanistic information was obtained for the reaction systems in question. This
information also allowed taking some considerations for related glycation processes,
since these processes and the ones investigated here are certainly better understood, in
terms of the Maillard reaction chemistry, having also a particular role in the actual
context of the Maillard reaction in vivo.
iv
Palavras-chave/Keywords
Palavras-chave/Keywords.
Palavras-chave:
Reacção de Maillard; aminoácidos básicos e derivados; (cid:1)-dicarbonilos; espectrometria
de massa de ionização por electrospray; espectrometria de massa tandem; glicação.
Keywords:
Maillard reaction; basic amino acids and derivatives; (cid:1)-dicarbonyls; electrospray
ionization mass spectrometry; tandem mass spectrometry; glycation.
v

Índice
Índice.
Agradecimentos. i
Resumo. iii
Abstract. iv
Palavras-chave/Keywords. v
Índice. vii
Símbolos e abreviaturas. xv
Capítulo I
1. Introdução geral. 1
1.1. Importância da reacção de Maillard? 2
1.2. Porquê recorrer a técnicas de espectrometria de massa para o estudo
da reacção de Maillard? 5
1.3. Objectivo e estrutura da dissertação. 7
1.4. Bibliografia. 10
Capítulo II
2. Reacção de Maillard. 13
2.1. Introdução. 13
2.2. Reacção de Maillard na química alimentar. 17
2.3. Reacção de Maillard in vivo. 21
2.3.1. Química e vias reaccionais envolvidas na formação de produtos
finais da glicação avançada (AGEs). 24
2.3.1.1. Produto Amadori. 29
2.3.1.2. Autoxidação da glucose. 30
2.3.1.3. Via reaccional poliólica. 30
2.3.1.4. Produtos finais da glicação avançada (AGEs). 31
2.3.1.5. Formação de AGEs via açúcares redutores. 32
2.3.1.5.1. O artefacto FFI. 32
2.3.1.5.2. Pirralina e formas associadas. 34
2.3.1.5.3. Pentodisina. 37
2.3.1.5.4. CML e CEL. 40
vii
Índice
2.3.1.5.5. Crosslines e vesperlisinas. 46
2.3.1.5.6. Glucosepano, pentosinano, DOGDIC e DOPDIC.
Reinvestigação do AGE pentosidina. 48
2.3.1.5.7. GOLA e GALA. Reinvestigação do AGE CML. 53
2.3.1.5.8. Desaminação oxidativa. Reacção de Strecker in vivo. 56
2.3.1.6. Formação de AGEs via trioses, α-dicarbonilos e outros
compostos carbonílicos de baixa massa molecular. 60
2.3.1.6.1. Hidroimidazolona e 5-metilimidazolona, derivadas
para o metilglioxal. 60
2.3.1.6.2. MOLD e GOLD. 62
2.3.1.6.3. Argpirimidina. 66
2.3.1.6.4. Tetrahidropirimidina (THP) e reinvestigação do
composto 5-metilimidazolona. 69
2.3.1.6.5. Reinvestigação de AGEs: αNFC-1, βNFC-1 e γNFC-1. 71
2.3.1.6.6. CMA. 73
2.3.1.6.7. Reinvestigação de AGEs: Dihidroxiimidazolidina,
hidroimidazolona e CMA, derivados para o glioxal. 74
2.3.1.6.8. Triosidinas. 76
2.3.1.6.9. Dihidropiridina. 81
2.3.1.6.10. Outros cross-links. Relevância do produto Amadori
no cross-linking. 82
2.3.2. Controlo e inibição da reacção de Maillard in vivo. 84
2.3.3. Métodos analíticos para identificação, caracterização e
localização de produtos da reacção de Maillard in vivo. 85
2.4. Conclusões. 88
2.5. Bibliografia. 92
Capítulo III
3. Espectrometria de massa. 103
3.1. Introdução. 103
3.2. Fonte de ionização. 105
3.2.1. Fonte de electrospray. 106
3.2.1.1. Características operacionais da fonte de electrospray. 110
viii