Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen mit lichtsensitivem Geschmackssystem zur

230 Pages·2012·25.62 MB·German

by  Kristina Loßow

Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke
Abteilung Molekulare Genetik
Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen
mit lichtsensitivem Geschmackssystem zur
Aufklärung der neuronalen Geschmackskodierung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
„doctor rerum naturalium“
Dr. rer. nat.
eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Potsdam
von Kristina Loßow
Potsdam 2011
Online veröffentlicht auf dem
Publikationsserver der Universität Potsdam:
URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2012/5805/
URN urn:nbn:de:kobv:517-opus-58059
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-58059
Das Auge isst mit.
!

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1
! 1.1 Anatomie des Geschmackssinns! ! ! ! ! ! ! 2
! 1.2 Neuronale Kodierung der Geschmacksinformationen!! ! ! ! 6
! !1.2.1 Projektionsgebiete von Geschmacksinformationen !! ! ! 6
! !1.2.2 Kodierung von Geschmacksinformationen ! ! ! ! ! 8
! !1.2.2.1 Kodierung von Geschmacksinformationen in der Peripherie ! ! 8
! !1.2.2.2 Kodierung von Geschmacksinformationen im zentralen Nervensystem ! 9
! !1.2.2.3 Kodierung von geschmacksstoffbegleitenden Informationen ! ! 11
! 1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und G-Proteine in visuellen und gustatorischen
! Signalkaskaden! ! ! ! ! ! ! ! ! 12
! !1.3.1 Gustatorische Signalkaskade ! ! ! ! ! ! 12
! !1.3.2 Visuelle Signalkaskade ! ! ! ! ! ! ! 18
! !1.3.3 G-Proteine in visuellen und gustatorischen Signalkaskaden !! ! 21
! 1.4 Zielstellung!! ! ! ! ! ! ! ! ! 23
2 Material! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 24
! 2.1 Chemikalien und Verbrauchsmittel! ! ! ! ! ! ! 24
! 2.2 Geschmacksstoffe! ! ! ! ! ! ! ! ! 24
! 2.3 Enzyme und Antikörper! ! ! ! ! ! ! ! 25
! !2.3.1 Enzyme ! ! ! ! ! ! ! ! ! 25
! !2.3.2 Antikörper !! ! ! ! ! ! ! ! 26
! 2.4 Kits!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 28
! 2.5 Plasmide! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 28
! 2.6 Oligonukleotide (Primer)! ! ! ! ! ! ! ! 29
! 2.7 Größenstandards! ! ! ! ! ! ! ! ! 30
! 2.8 Lösungen und Puffer! ! ! ! ! ! ! ! 30
! 2.9 Kulturmedien für Bakterien! ! ! ! ! ! ! ! 33
! 2.10 Bakterienstämme !! ! ! ! ! ! ! ! 34
! 2.11 Eukaryotische Zelllinien und Materialien für deren Kultivierung! ! ! 34
! 2.12 Embryonale Stammzellen und Materialien für deren Kultivierung! ! ! 35
! 2.13 Versuchstiere! ! ! ! ! ! ! ! ! 35
! !2.13.1 Xenopus laevis ! ! ! ! ! ! ! !35
! !2.13.2 Mus musculus ! ! ! ! ! ! ! ! 36
! 2.14 Geräte! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 36
! 2.15 Software! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 38
!
I
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
3 Methoden! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 39
! 3.1 Molekularbiologische Methoden! ! ! ! ! ! ! 39
! !3.1.1 Polymerase-Kettenreaktion ! ! ! ! ! ! 39
! !3.1.2 Agarosegelelektrophorese !! ! ! ! ! ! 40
! !3.1.2.1 Gele zur Trennung von DNA-Fragmenten ! ! ! !40
! !3.1.2.2 Gele zur Trennung von RNA-Fragmenten ! ! ! !40
! !3.1.3 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ! ! ! ! 41
! !3.1.4 Reinigung von DNA-Fragmenten mittels Glasfasersäule ! ! ! 41
! !3.1.5 Mikrodialyse ! ! ! ! ! ! ! ! 41
! !3.1.6 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen ! ! ! ! 41
! !3.1.7 Dephosphorylierung von linearisierter Plasmid-DNA ! ! ! 42
! !3.1.8 Auffüllen von 5ʼ-Überhängen nach Restriktionsspaltung ! ! ! 42
! !3.1.9 Phosphorylierung und Hybridisierung von DNA-Fragmenten ! !42
! !3.1.10 Ligation linearisierter Plasmid-DNA mit DNA-Fragmenten ! ! ! 43
! !3.1.10.1 Ligation mit T4-Ligase ! ! ! ! ! ! ! 43
! !3.1.10.2 TOPO-TA/blunt-Klonierung ! ! ! ! ! ! 43
! !3.1.11 Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion ! ! ! ! 43
! !3.1.12 Nukleinsäure-Fällung mit Ethanol !! ! ! ! ! 43
! !3.1.13 Transformation chemisch kompetenter E.coli-Zellen! ! ! 43
! !3.1.14 Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli! ! ! ! ! 44
! !3.1.15 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ! ! ! ! 44
! !3.1.16 Sequenzierung von DNA !! ! ! ! ! ! 44
! 3.2 Zellbiologische Arbeiten mit humanen Nierenzelllinien! ! ! ! 45
! !3.2.1 Kultivierung von HEK293T-Zellen ! ! ! ! ! ! 45
! !3.2.2 Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen ! ! ! ! 45
! !3.2.3 Nachweis der Expression transient transfizierter Bitterrezeptoren mittels
! ! Immuncytochemie !! ! ! ! ! ! ! 46
! !3.2.4 Funktionelle Charakterisierung von Bitterrezeptoren ! ! ! 47
! !3.2.4.1 Grundlage von Calcium-Imaging-Experimenten! ! ! ! 47
! !3.2.4.2 Calcium-Imaging-Experimente im Fluoreszenz-Plattenlesegerät! ! 48
! !3.2.4.3 Auswertung von Calcium-Imaging-Experimenten!! ! ! 49
! 3.3 Zellbiologische Arbeiten mit embryonalen Stammzellen! ! ! ! 50
! !3.3.1 Kultivierung von Stammzellen ! ! ! ! ! ! 50
! !3.3.2 Elekroporation von Stammzellen ! ! ! ! ! ! 51
! !3.3.3 Selektion von Stammzellen mit Geneticin ! ! ! ! ! 51
! !3.3.4 Vereinzelung von Stammzellklonen ! ! ! ! !52
! !3.3.5 Splitten von vereinzelten Stammzellklonen !! ! ! ! 52
! !3.3.6 Einfrieren von Stammzellklonen ! ! ! ! ! ! 52
II
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
! 3.4 Arbeiten mit embryonaler Stammzell-DNA! ! ! ! ! ! 53
! !3.4.1 Isolation und Fällung genomischer DNA aus Stammzellen ! ! ! 53
! !3.4.2 Southern Blot ! ! ! ! ! ! ! ! 53
! !3.4.2.1 Transfer von DNA auf Nylon +-Membranen! ! ! ! 53
! !3.4.2.2 Radioaktive Markierung von DNA-Sonden ! ! ! ! 53
! !3.4.2.3 Hybridisierung von Nylon +-Membranen mit radioaktiven DNA-Sonden! 54
! 3.5 Arbeiten mit Mäusen und murinem Gewebe! ! ! ! ! ! 55
! !3.5.1 Haltungs- und Zuchtbedingungen ! ! ! ! ! ! 55
! !3.5.2 Gewinnung genomischer DNA aus Schwanzbiopsien der Maus ! ! 55
! !3.5.3 Perfusion und Gewebepräparation !! ! ! ! ! 55
! !3.5.3.1 Kardiale Perfusion ! ! ! ! ! ! ! 55
! !3.5.3.2 Gewinnung von Geweben für RNA-Extraktionen ! ! ! ! 56
! !3.5.3.3 Gewinnung von Zungenepithel ! ! ! ! ! ! 56
! !3.5.3.4 Anfertigung von Gefrierschnitten !! ! ! ! ! 56
! !3.5.3.5 Anfertigung von Paraffinschnitten ! ! ! ! !57
! !3.5.4 Analysen der Genexpression auf mRNA-Ebene ! ! ! ! 57
! !3.5.4.1 RNA-Extraktion ! ! ! ! ! ! ! ! 57
! !3.5.4.2 cDNA-Synthese !! ! ! ! ! ! ! 57
! !3.5.4.3 In-situ-Hybridisierung ! ! ! ! ! ! ! 58
! !3.5.4.3.1 In-vitro-Transkription von cRNA-Sonden ! ! ! ! 58
! !3.5.4.3.2 Vorbehandlungen und Hybridisierung von Gefrierschnitten ! ! 59
! !3.5.4.3.3 Nachweis der DIG-Markierung in Gefrierschnitten ! ! ! 59
! !3.5.4.3.4 Vorbehandlung und Nachweis der DIG-Markierung in
! ! ! Gefrierschnitten mit Amplifikationsschritt ! ! ! ! 60
! !3.5.5 Hellfeld-Mikroskopie ! ! ! ! ! ! ! 60
! !3.5.6 Analysen der Genexpression auf Protein-Ebene ! ! ! ! 61
! !3.5.6.1 Immunhistochemie ! ! ! ! ! ! ! 61
! !3.5.6.2 Immunhistochemie mit Amplifikationsschritt ! ! ! ! 62
! !3.5.7 Konfokale Laserscan-Mikroskopie!! ! ! ! ! 62
! !3.5.8 Mirax Scansystem !! ! ! ! ! ! ! 63
! 3.6 Arbeiten mit Oozyten des Xenopus laevis! ! ! ! ! ! 63
! !3.6.1 Oozyten des Xenopus laevis ! ! ! ! ! ! 63
! !3.6.2 Oozytenpräparation ! ! ! ! ! ! ! 63
! !3.6.3 Enzymatische Defollikulierung von Oozyten ! ! ! ! 64
! !3.6.4 Generierung von cRNA zur Oozyteninjektion ! ! ! ! 64
! !3.6.5 Generierung von Poly(A)-RNA ! ! ! ! ! ! 65
! !3.6.7 cRNA- und Poly(A)-RNA-Injektion ! ! ! ! ! ! 65!
! !3.6.8 Durchführung der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Experimente !! 66
III
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 68
! 4.1 Bestimmung des Ligandenspektrums muriner Bitterrezeptoren! ! ! 68
! !4.1.1 Nachweis der Expression transient transfizierter Bitterrezeptoren ! ! 68
! !4.1.2 Funktionelle Charakterisierung von Bitterrezeptoren der Maus ! ! 70
! 4.2 Funktionelle Charakterisierung von Opsinen durch elektrophysiologische
! Messungen an Xenopus-laevis-Oozyten! ! ! ! ! ! 82
! !4.2.1 Funktionelle Charakterisierung von Opsinen in cRNA-injizierten
! ! Xenopus-laevis-Oozyten! ! ! ! ! ! ! 82
! !4.2.2 Funktionelle Charakterisierung von Opsinen in Poly(A)-injizierten
! ! Xenopus-laevis-Oozyten! ! ! ! ! ! ! 87
! !4.2.3 Charakterisierung der Lichtsensitivität von Opsinen im
! ! Xenopus-laevis-Modell! ! ! ! ! ! ! 89
! 4.3 Generierung von Mausmodellen mit modifiziertem Geschmacksrezeptorlocus!! 95
! !4.3.1 Mausmodell Tas1r1 Rho-IRES-hrGFP! ! ! ! ! ! 95
! !4.3.1.1 Targeting-Strategie für Tas1r1 Rho-IRES-hrGFP! ! ! ! 95
! !4.3.1.2. Generierung des Targeting-Konstruktes Tas1r1Rho-IRES-hrGFP ! ! 97
! !4.3.2 Mausmodell Tas1r2 Opsin mws! ! ! ! ! ! 99
! !4.3.2.1 Targeting-Strategie für Tas1r2 Opsin mws! ! ! ! ! 99
! !4.3.2.2 Generierung des Targeting-Konstruktes Tas1r2Opsin mws! ! ! 100
! !4.3.3 Mausmodell Tas2r114 Opsin sws! ! ! ! ! ! 103
! !4.3.3.1 Targeting-Strategie für Tas2r114 Opsin sws! ! ! ! ! 103
! !4.3.3.2 Generierung des Targeting-Konstruktes Tas2r114Opsin sws! ! ! 104
! !4.3.4 Homologe Rekombination der Targeting-Konstrukte in embryonalen
! ! Stammzellen ! ! ! ! ! ! ! ! 107
! !4.3.5 Generierung und Rückkreuzung von Chimären ! ! ! ! 108
! 4.4. Charakterisierung von Mausmodellen mit modifiziertem Geschmacksrezeptorslocus! 113
! !4.4.1 Charakterisierung des Tas1r1 Rho-IRES-hrGFP-Mausmodells! ! !113
! !4.4.1.1 PCR-Analysen von Geweben der Tas1r1 Rho-IRES-hrGFP-Maus im
! ! Vergleich zu Wildtyp-Tieren ! ! ! ! ! ! 113
! !4.4.1.2 In-situ-Hybridisierungen von Zungengewebe der
! ! Tas1r1 Rho-IRES-hrGFP-Nachkommen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren! ! 115
! !4.4.1.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Geschmackspapillen
! ! homozygoter Tas1r1Rho-IRES-hrGFP-Nachkommen! ! ! ! 117
! !4.4.2 Charakterisierung des Tas1r2Opsin mws-Mausmodells!! ! !120
! !4.4.2.1 PCR-Analysen von Geweben der Tas1r2 Opsin mws-Maus im
! ! Vergleich zu Wildtyp-Tieren ! ! ! ! ! ! 120!
! !4.4.2.2 In-situ-Hybridisierungen von Zungengewebe der
! ! Tas1r2Opsin mws-Nachkommen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren! ! 122
IV
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
! !4.4.2.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Geschmackspapillen
! ! homozygoter Tas1r2Opsin mws-Nachkommen! ! ! ! 124
! !4.4.3 Charakterisierung des Tas2r114Opsin sws-Mausmodells! ! ! 124
! !4.4.3.1 PCR-Analysen von Geweben der Tas2r114Opsin sws-Maus im
! ! Vergleich zu Wildtyp-Tieren ! ! ! ! ! ! 124
! !4.4.3.2 In-situ-Hybridisierungen von Zungengewebe der
! ! Tas2r114Opsin sws-Nachkommen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren! ! 126
! !4.4.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Geschmackspapillen
! ! homozygoter Tas2r114 Opsin sws-Nachkommen! ! ! ! 128
5 Diskussion! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 130
! 5.1 Funktionelle Charakterisierung von Bitterrezeptoren der Maus im Vergleich zu
! humanen Geschmacksrezeptoren! ! ! ! ! ! ! 130
! 5.2 Erzeugung und Charakterisierung von genetisch veränderten Mausmodellen
! mit lichtsensitivem Geschmackssystem! ! ! ! ! !140
! !5.2.1 Nachweis der funktionellen Interaktion von Opsinen mit Gustducin ! ! 141
! !5.2.2 Erzeugung der genetisch veränderten Mausmodelle! ! ! 145
! !5.2.2.1 Identifizierung eines homologen Rekombinationsereignis im
! ! Geschmacksrezeptorlocus ! ! ! ! ! ! 146
! !5.2.2.2 Nachweis der Entfernung der Selektionskassette!! ! ! 148
! !5.2.2.3 Untersuchung der Mausmodelle mit manipuliertem
! ! Geschmacksrezeptorlocus ! ! ! ! ! ! 149
! !5.2.2.4 Nachweis der Funktionalität des IRES-Elementes !! ! ! 153
! !5.2.3 Funktionelle Charakterisierung und Konsequenzen der Manipulation eines
! ! Geschmacksrezeptorlocus im genetisch veränderten Mausmodell ! ! 153
! !5.2.3.1 Funktionelle Konsequenzen des Opsin- Knockins!! ! ! 153
! ! 5.2.3.2 Funktionelle Konsequenzen des Geschmacksrezeptor-Knockouts!! 154
6 Zusammenfassung! ! ! ! ! ! ! ! ! 158
7 Literaturverzeichnis! ! ! ! ! ! ! ! ! 159
8 Anhang! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 181
! 8.1 Geschmacksstoffe! ! ! ! ! ! ! ! ! 181
! 8.2 Oligonukleotide! ! ! ! ! ! ! ! ! 185
! 8.3 In-situ-Sonden! ! ! ! ! ! ! ! ! 193
! 8.4 Vektorkonstrukte! ! ! ! ! ! ! ! ! 193
! !8.4.1 Bitterrezeptorplasmide ! ! ! ! ! ! ! 193
! !8.4.2 Targeting-Konstrukte ! ! ! ! ! ! ! 196
! 8.5 Funktionalität der In-situ-Sonden und Antikörper für Opsine! ! ! ! 202
! 8.6 Gewebeanalysen der Mausmodelle! ! ! ! ! ! ! 203
V
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Inhaltsverzeichnis
9 Danksagung! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 208
10 Eigenständigkeitserklärung! ! ! ! ! ! ! 210
VI