Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Erfassung von Pyrrolizidinalkaloiden in Honig und ...

189 Pages·2009·1.04 MB·English

Entwicklung und Anwendung von Methoden zur
Erfassung von Pyrrolizidinalkaloiden
in Honig und Pollen

Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von
Michael Kempf
aus Wörth am Main

Würzburg 2009
Eingereicht am: ……………………………
bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie

1. Gutachter: ..……………………………………
2. Gutachter: ……………………………………..
der Dissertation

1. Prüfer: … …………………………………….
2. Prüfer: ….…………………………………….
3. Prüfer: ….....………………………………….
des öffentlichen Promotionskolloquiums

Tag des öffentlichen Promotionskolloquiums: ……………………….

Doktorurkunde ausgehändigt am: ……………………….
Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand von Juni 2004 bis Januar 2009 am Lehrstuhl für
Lebensmittelchemie der Universität Würzburg unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Peter
Schreier in Zusammenarbeit mit dem Institut für Pharmazeutische Biologie der
Technischen Universität Braunschweig, Herrn Dr. Till Beuerle.

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Peter Schreier, für die
Überlassung des Themas, die wissenschaftliche Betreuung und seiner stets regen
Anteilnahme an meinen Projekten sowie seinem mir in allen Belangen entgegengebrach-
ten Vertrauen und die mir bei meinen Arbeiten gewährten Freiräume. Die zahlreichen
Gespräche und vertrauensvoll übertragenen Aufgaben haben mich in meiner beruflichen
sowie persönlichen Entwicklung nachhaltig geprägt. Nicht zuletzt erfüllt es mich mit Stolz,
als letzter Betreuer des „GC-Labors“ eine äußerst erfolgreiche, über 25 Jahre andauernde
Ära zu beenden. Für dieses stets offene und vertrauensvolle Verhältnis in allen Bereichen
der Zusammenarbeit sei Ihnen noch einmal herzlichst gedankt.

Weiterer, besonderer Dank gebührt Herrn Dr. Till Beuerle für unzählige Diskussionen,
lange Telefonate, die konstruktive Kritik beim Erstellen von Publikationen und dieser
Arbeit, sowie für zahlreiche Ideen ohne die diese Arbeit nie so erfolgreich verlaufen wäre.
Dein Engagement für diese Arbeit war/ist aller Ehren wert. In diesem Zusammenhang sei
auch Herrn Prof. Dr. Thomas Hartmann vom Institut für Pharmazeutische Biologie der TU
Braunschweig für Anregungen sowie Korrekturen bei der Vorbereitung der Anträge und
Publikationen gedankt.

Dem Bienenistitut Celle, hier vor allem Frau Katharina und Herrn Werner von der Ohe, sei
gedankt für die Durchführung der mikroskopischen Pollenanalysen.

Für ihre engagierte und erfolgreiche Mitarbeit in Rahmen von Fortgeschrittenen-Praktika
danke ich Herrn Markus Bonk, Frau Ebru Ates, Frau Daniela Trost, Frau Martina Denner,
Frau Manuela Bühringer, Herrn Lukas Schmidt, Frau Iris Haßlauer, Frau Sandra Heil,
Frau Katrin Hempfling, Herrn Maximillian Wittig sowie Frau Kirsten Schönfeld.

Bei allen Mitarbeitern des Arbeitskreises bedanke ich mich für die ausgesprochen gute
Zusammenarbeit, die stets gute Arbeitsatmosphäre sowie die entgegengebrachte Hilfsbe-
reitschaft.

Besonderer Dank geht an die Herren Dr. Wolfgang Hümmer, Matthias Ackermann,
Michael Menzel und auch Maximilian Wittig für etliche „forschungspoli-
tische“ Kartenrunden und sonstige Unternehmungen, die für gute Laune gesorgt und
erheblich zum Arbeitsklima beigetragen haben. Nicht missen möchte ich die oft
kontroversen aber immer netten, fachlichen und sonstigen Diskussionen. Nicht vergessen
werden darf in diesem Zusammenhang meine langjährige Studien- und
Promotionskollegin Dr. Kathrin Kahle. Kathrin, hier jetzt aufzuzählen, wofür ich Dir
„zurückdanken“ sollte, angefangen bei Spüldiensten im Grundstudium, wäre sinnlos. Ich
denke, wir haben das am Ende ganz ordentlich hinbekommen.

Danken möchte ich auch Dr. Christina Preston sowie der langjährigen Laborantin
Theresia Feuerbach für die ausgesprochen gute Zusammenarbeit in
„unserer“ Aromenabteilung.

Für die Aufnahmen der NMR-Spektren und Hilfe bei deren Auswertungen bedanke ich
mich bei Herrn Martin König und der NMR-Crew der TU Braunschweig.
Ein herzliches Dankeschön geht auch an die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG),
Bonn, die im Rahmen der Projekte Nr. SCHR 211/22-1/23-1 und BE 3200/1-1/3-1 diese
Arbeit finanziell gefördert hat.

Weiterer Dank geht an das Werkstatt-Team und den technischen Betrieb mit Schorsch,
Matthias, Karl, Fritz, Thomas, Andi und Pierre. Ihr ward immer zur Stelle, wenn´s mal
gebrannt hat.

Der abschließende, eigentlich an erste Stelle gehörende Dank gebührt meinen Eltern, die
mir mein Studium erst ermöglicht haben, meiner Schwester, meinem Patenonkel und
nicht zuletzt meiner wunderbaren Frau Daniela. Vielen Dank, dass Ihr immer an mich
geglaubt und mein Arbeiten in einer Weise unterstützt und gefördert habt die ihres-
gleichen sucht. Euer stetiges Interesse an meiner Arbeit hat mich nicht zuletzt immer
wieder aufs Neue motiviert. Dir liebe Daniela, danke ich für Deine liebevolle Unterstützung
während der Promotionszeit und auch in allen anderen Bereichen des Lebens. Egal, ob
mal kurz irgendwo Proben besorgt werden mussten, oder am Samstag/Sonntag mal
wieder die GC-MS ausgefallen war, Du warst immer zur Stelle, um mich tatkräftig zu
unterstützen. Dein unermüdlicher Beistand beim Erstellen dieser Arbeit, sowie Dein
kritischer und konstruktiver Blick von außen haben sehr zum Gelingen beigetragen.
FÜR DANIELA,
MEINE ELTERN

„WIR MÜSSEN UNBEDINGT RAUM FÜR ZWEIFEL LASSEN, SONST GIBT ES KEINEN
FORTSCHRITT, KEIN DAZULERNEN. MAN KANN NICHTS NEUES HERAUSFINDEN, WENN MAN
NICHT VORHER EINE FRAGE STELLT. UND UM ZU FRAGEN, BEDARF ES DES ZWEIFELNS.“

Richard P. Feynman (*1918, †1988),
US-amerikanischer Physiker und Nobelpreisträger des Jahres 1965

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Veröffentlichungen................................................................................................V
Erläuterungen.....................................................................................................VIII
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................IX
Zusammenfassung.............................................................................................XIII
Summary............................................................................................................XVI
1 Einleitung und Zielsetzung........................................................................1
2 Kenntnisstand.............................................................................................3
2.1 Pyrrolizidinalkaloide..............................................................................................3
2.1.1 Vorkommen und Klassifizierung...........................................................................3
2.1.2 Biosynthese..........................................................................................................7
2.1.3 Toxizität.................................................................................................................9
2.1.3.1 Allgemeines..........................................................................................................9
2.1.3.2 Resorption und Bioaktivierung der Pyrrolizidinalkaloide.....................................10
2.1.3.3 Akute Toxizität....................................................................................................12
2.1.3.4 Chronische Toxizität...........................................................................................14
2.1.3.5 Genotoxizität.......................................................................................................14
2.1.3.6 Entgiftung der Pyrrolizidinalkaloide.....................................................................15
2.1.4 Analytik von Pyrrolizidinalkaloiden......................................................................17
2.1.4.1 Probenaufarbeitung............................................................................................17
2.1.4.2 Gaschromatographie..........................................................................................18
2.1.4.3 Hochleistungsflüssigchromatographie................................................................19
2.1.4.4 Weitere Methoden...............................................................................................20
2.1.5 Gesetzliche Regulierungen und Stellungnahmen...............................................22
2.1.6 Exposition mit Pyrrolizidinalkaloiden...................................................................24
2.1.6.1 Phytopharmaka und Kräuterpräparate................................................................24
2.1.6.2 Pyrrolizidinalkaloide in Lebensmitteln.................................................................25
2.1.6.3 Pyrrolizidinalkaloide in Honig und Pollen............................................................27
2.2 Honig als Lebensmittel........................................................................................32
2.2.1 Definition.............................................................................................................32
2.2.2 Gewinnung, Inhaltsstoffe und Verwendung........................................................33
2.2.3 Marktsituation......................................................................................................35
2.3 Pollen als Lebensmittel.......................................................................................39
II Inhaltsverzeichnis

3 Ergebnisse und Diskussion.....................................................................42
3.1 Entwicklung von analytischen Methoden zur Bestimmung von Pyrrolizidin-
alkaloiden...........................................................................................................42
3.1.1 Referenzmaterialien...........................................................................................42
3.1.2 Entwicklung einer Extraktions- und Anreicherungsmethode zur Bestimmung
von Pyrrolizidinalkaloiden in Honigen.................................................................43
3.1.2.1 Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE).........................................................................43
3.1.2.2 Festphasenextraktion (SPE)...............................................................................44
3.1.2.3 Methodenoptimierung zur Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse (SIVA).............49
3.1.2.4 Identifizierung und Quantifizierung.....................................................................52
3.1.2.4.1 Standardisierung mittels Heliotrin.......................................................................52
3.1.2.4.2 Standardisierung mittels di-Butyroyl-[9,9-2H ]-Retronecin..................................55
2
3.1.3 Methodenerweiterung zur Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in
Pollenprodukten..................................................................................................56
3.1.4 Methodenanpassung zur Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in honig-
haltigen Lebensmitteln........................................................................................57
3.2 Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in Honigen............................................59
3.2.1 Handelshonige....................................................................................................59
3.2.2 Forschungshonige..............................................................................................70
3.2.2.1 Senecio-Honige..................................................................................................70
3.2.2.2 Echium-Honige...................................................................................................76
3.3 Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in Pollen...............................................81
3.3.1 Vergleich der Analysenmethoden für native Pollen und Pollenprodukte............81
3.3.2 Native Pollen......................................................................................................82
3.3.3 Pollenprodukte....................................................................................................86
3.4 Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in honighaltigen Lebensmitteln.............91
3.5 Filtrationsversuche.............................................................................................95
3.6 Betrachtung der Pyrrolizidinalkaloid-Gehalte in Honig in Bezug auf deren
botanische Herkunft............................................................................................99
4 Material und Methoden...........................................................................101
4.1 Material.............................................................................................................101
4.1.1 Chemikalien......................................................................................................101
4.1.2 Verbrauchsmaterialen......................................................................................101
4.1.3 Untersuchungsmaterial.....................................................................................101
4.1.3.1 Pflanzenmaterial zur Extraktion........................................................................101
4.1.3.2 Pflanzenmaterial zur Gewinnung von nativem Pollen......................................102
4.1.3.3 Handelsproben.................................................................................................102
Inhaltsverzeichnis III

4.1.3.3.1 Honige...............................................................................................................102
4.1.3.3.2 Pollen................................................................................................................102
4.1.3.3.3 Honighaltige Lebensmittel.................................................................................102
4.1.3.4 Forschungshonige............................................................................................102
4.1.3.4.1 Echium-Honige.................................................................................................103
4.1.3.4.2 Senecio-Honige................................................................................................103
4.1.3.4.3 Filtrationshonige................................................................................................103
4.1.3.5 native Pollen.....................................................................................................103
4.2 Geräte...............................................................................................................103
4.2.1 Kapillargaschromatographie (HRGC)...............................................................103
4.2.2 Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS).....................104
4.2.3 Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)...........................................................108
4.2.4 Durchlichtmikroskopie.......................................................................................109
4.2.5 Sonstige Geräte................................................................................................109
4.3 Pyrrolizidinalkaloid-Extrakt aus Senecio vernalis..............................................110
4.4 Allgemeine Arbeitsvorschriften.........................................................................111
4.4.1 Probenvorbereitung..........................................................................................111
4.4.1.1 Honige...............................................................................................................111
4.4.1.1.1 Standardisierung mit Heliotrin...........................................................................111
4.4.1.1.2 Standardisierung mit di-Butyroyl-[9,9-2H ]-Retronecin......................................111
2
4.4.1.2 Pollen................................................................................................................111
4.4.1.3 Honighaltige Lebensmittel.................................................................................112
4.4.1.3.1 Honig-Met.........................................................................................................112
4.4.1.3.2 Honigbonbons und Gummibären......................................................................112
4.4.1.3.3 Getränke...........................................................................................................113
4.4.1.3.4 Müsliriegel, Cerealien, Fruchtsoße und Baby-Brei-Pulver................................113
4.4.1.3.5 Nahrungsergänzungsmittel...............................................................................114
4.4.1.3.6 Fenchelhonige..................................................................................................114
4.4.2 Probenaufarbeitung..........................................................................................114
4.4.3 Identifizierung und Quantifizierung...................................................................115
4.4.3.1 Standardisierung mit Heliotrin...........................................................................115
4.4.3.2 Standardisierung mit di-Butyroyl-[9,9-2H ]-Retronecin......................................116
2
4.5 Mikroskopische Pollenanalyse..........................................................................116
4.6 native Pollen.....................................................................................................117
4.6.1 Gewinnung von nativen Pollen.........................................................................117
4.6.2 Probenaufarbeitung..........................................................................................117
4.6.3 Identifikation und Quantifizierung......................................................................118
IV Inhaltsverzeichnis

4.7 Filtrationsversuche...........................................................................................118
4.7.1 Versuchshonige................................................................................................118
4.7.2 Aufbau der Filtrationsapparatur........................................................................119
4.7.3 Filtration der Versuchshonige...........................................................................120
4.7.4 Probenaufarbeitung und Analyse.....................................................................120
4.8 Synthesen.........................................................................................................121
4.8.1 Pyrrolizidinalkaloid-N-Oxide aus Senecio vernalis Extrakt...............................121
4.8.1.1 N-Oxidierung der tertiären Pyrrolizidinalkaloide...............................................121
4.8.1.2 Aufreinigung mittels Säulenchromatographie...................................................121
4.8.1.3 Umkristallisation...............................................................................................121
4.8.2 Synthese von di-Butyroyl-[9,9-2H ]-Retronecin.................................................122
2
4.8.2.1 Umsetzung von Monocrotalin zu Retronecin....................................................122
4.8.2.2 Umsetzung von Retronecin zu Methyl-1,2-dehydro-7β-hydroxy-8α-pyrrolizidin-
1-carboxylat......................................................................................................123
4.8.2.3 Reduktion von Methyl-1,2-dehydro-7β-hydroxy-8α-pyrrolizidin-1-carboxylat zu
[9,9-2H ]-Retronecin..........................................................................................124
2
4.8.2.4 Veresterung von [9,9-2H ]-Retronecin zu di-Butyroyl-[9,9-2H ]-Retronecin......125
2 2
5 Strukturmatrix.........................................................................................127
6 Literatur...................................................................................................132
7 Anhang.....................................................................................................148