efecto del fotoperíodo...

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TESIS DOCTORAL
Efecto del fotoperíodo sobre la calidad seminal de
verracos destinados a inseminación artificial
M. Montserrat Rivera del Álamo
Juny 2003
AGRADECIMIENTOS

Hoy es una de esas noches en las que, como decían Celtas Cortos, el autobús del
sueño no me viene a visitar. Tengo el cuerpo baldado, mi nariz parece un grifo y la
cabeza está a punto de reventarme, pero soy incapaz de dormir. En este momento me
pasan por la cabeza estos últimos días y casi no puedo creerme que por fin haya
terminado. Ha sido un camino largo y, a veces, bastante duro, sobre todo al final. En
estos momentos, miro hacia atrás, a todo lo que ha sido mi vida durante estos últimos
años y lo que veo me hace reflexionar. No puedo evitar pensar en los momentos buenos
y en los no tan buenos (no voy a decir malos) y en lo que han supuesto a cada paso del
camino. Pienso en los momentos de alegría cuando encuentras algún resultado curioso.
En los momentos de histerismo cuando la impresora se dedica a hacerte la vida
imposible. En fin, tantas cosas que podría estar horas y horas.
Después de tanto tiempo, hoy he llegado a un punto y final en mi vida, pero
también a un punto y seguido (o eso quiero pensar). He cerrado una puerta que llevaba
abierta unos cuantos años, pero abro una nueva que no sé dónde me llevará. No tengo ni
idea de qué me traerá el mañana, pero estoy deseando que llegue para averiguarlo. Es en
este momento, al llegar al final del camino, cuando sientes la obligación moral de
acordarte de todos aquéllos que, de un modo u otro, han estado contigo, dándote apoyo,
consejo y, a veces, consuelo. Todas y cada una de esas personas han puesto su granito
de arena para que una montaña inmensa de datos se haya convertido en algo con sentido
“científico” (?????).
En primer lugar quiero dar las gracias a los “jefes”, Joan Enric y Teresa. Tengo
que darles las gracias por infinidad de cosas, pero lo que quizás deba agradecerles
primero es la santa paciencia que han tenido conmigo y con mi histerismo (ciertamente
no soy nerviosa, sino histérica). He aprendido mucho con ellos, tanto a nivel laboral
como a nivel personal. Han conseguido que llegara a culminar este trabajo incluso
cuando a veces he tenido ganas de tirarlo todo por la borda, y todo ello con muchas
dosis de buen humor (ha caído alguna que otra bronca, pero de aquéllas que no te
acuerdas al cabo de 10 minutos). He aprendido que un resultado negativo es siempre un
resultado y que “lo que no pué ser no pué ser, y además es imposible”. De todo corazón,
gracias por todo lo que me habéis dado.
Tampoco puedo olvidar a los demás compañeros del grupo “reproductor” (suena
un poco raro, pero qué la vamos a hacer). Tengo que dar las gracias a muchos de ellos
por infinidad de cosas. A Teresa Mogas, gracias por ser la primera en abrirme la puerta
del mundo de la ciencia. A Jordi Miró, por los momentos ecográficos y de palpación
rectal (de yeguas, por supuesto). A Armando por todas sus “cuestiones” estadísticas. A
Joan, por las soluciones informáticas cuando la puñetera impresora se niega a obedecer,
aún a riesgo de salir disparada por la ventana más próxima. A Xus, por darle al callo
también en este estudio. Al resto de becarios de la unidad, Jose Luis, Fanny, Antonio,
Claudia, Laura y Erika. Unos nos conocemos más y otros quizá menos, pero ahí
estamos todos en el mismo barco.
Al tito Alex, por darme todo tipo de soluciones, la 14, la 15, la 16 y también las
que van sin numerar, por esos ratos de cháchara (son pocos, eh!) y tus consejillos. Un
besote Alex.
Quiero dar las gracias también a todos esos amigos que, sin ser gente de ciencia,
han llenado mi vida con momentos imprescindibles para cualquier persona. A Eulàlia,
por todos esos ratos que hemos pasado desde que empezamos en la facultad, los viajes,
las fiestas, las borracheras (queda poco serio, pero no sería ético decir mentiras), las
alegrías, las lágrimas, en fin, todo aquello que hemos compartido y lo que
compartiremos. A Paula, por esas tazas de té eternas a medianoche y las conversaciones
filosóficas para intentar arreglar el mundo. A Ana, por nuestros paseos en bici los
domingos por la mañana con chafardeo incluido de todo lo que pasa en Lliçà y por
soportar mis rollos sentimentales. También quiero acordarme de aquellos amigos de
adolescencia, Rai, Ramón y Gus, con los que he compartido momentos inolvidables de
juergas, confesiones, sentimientos y rascucias (estoy quedando fatal!!! No parezco nada
seria). A todos vosotros, amigos, gracias por aguantar mis buenos y malos (esta vez sí)
momentos y por seguir a mi lado a pesar de todo (al final me voy a emocionar, sniff,
sniff). No puedo olvidarme de Anxo (Ángel según su DNI) por regalarme el cerdito.
Quiero dar las gracias también a mi “stand by” (hoy en día les llaman
compañeros sentimentales), Joan Andreu, por estar ahí y aguantar el chaparrón de mi
histerismo (insisto en que no soy nerviosa, sino totalmente histérica) cuando las cosas
no me salían bien, mis neuras hormonales y mi cabezonería (quizá debería añadir
también mi tozudez y mi mala leche. Viene todo de familia).
En último lugar, pero no por ello menos importante (no soy muy creyente, pero
alguien dijo que los últimos serán los primeros y así es para mí en este caso), quiero dar
las gracias a mi familia. En primer lugar a mis padres, gracias por haberme hecho tal
como soy, por vuestro apoyo siempre incondicional, por soportar mis desplantes y mis
malas contestaciones cuando tenía un día asqueroso, por creer que podía conseguirlo y,
sobretodo, gracias por sentiros tan orgullosos de mí. A mi hermana mediana, Isabel, por
acordarte de mí aunque estés a más de 3.000 km de distancia y por darme consejo
cuando lo he necesitado. Mirando lo que tú has conseguido me doy cuenta que después
de una caída, siempre hay que levantarse porque si te quedas en el suelo te pierdes lo
que está por llegar. A mi hermana pequeña, Esther, por aguantar, junto con mis padres,
mis neuras de los últimos meses, sobretodo las del domingo por la tarde cuando la
dichosa impresora sigue dando la murga y pienso en colgarme de la ducha con el
maldito cartucho de tinta que decide acabarse en ese preciso instante. Para acabar quiero
acordarme de mi tía Esperanza y mi tía Isabel. Gracias por sentiros tan orgullosas de mí
(un día no cabrán por la puerta de anchas que se ponen).
Discusión

DISCUSIÓN

Efecto de la luz natural sobre el semen fresco
La calidad seminal en el verraco puede verse afectada por numerosos factores.
Uno de ellos es el fotoperíodo. Sin embargo, este efecto, como ya se ha indicado, no
está claramente establecido. Diversos autores lo consideran uno de los factores con más
capacidad para alterar la función reproductora del verraco (Mauget, 1982; Claus y
Weiler, 1985a,b). Sin embargo, nuestros resultados indican lo contrario. Así, dentro del
análisis seminal sólo se observaron diferencias significativas en el porcentaje de
anomalías de cabeza en los meses de noviembre, diciembre y febrero. Estas variaciones
podrían no deberse al fotoperíodo en sí, puesto que todos los porcentajes de anomalías
morfológicas aumentan con el paso del tiempo. Si estos incrementos se debieran
exclusivamente al efecto de la luz, los meses de febrero inicial y el de febrero final
deberían presentar porcentajes similares de anomalías morfológicas, lo cual no ocurre.
Por lo tanto, podemos asumir que en realidad los cambios que sufre la luz a lo largo de
las estaciones no tienen ningún efecto apreciable sobre los porcentajes de viabilidad y
de anomalías morfológicas.
Una posible causa para el aumento temporal en los porcentajes de las anomalías
morfológicas podría ser el incremento de edad de los verracos. A este respecto, Bach et
al (1982) mostraron que el porcentaje de anomalías aumenta gradualmente con la edad
desde la pubertad en adelante, aunque, otros estudios afirman lo contrario (Greenberg y
Mahone, 1981). Dado que en nuestro estudio la edad inicial de los verracos fue de 10-
14 meses de edad, sería factible asumir que el aumento en los porcentajes de anomalías
morfológicas es debido más a la edad que al efecto del fotoperíodo. Además, con el
Discusión

tiempo, los animales se ven sometidos a más situaciones de estrés y problemas médicos
que pueden afectar la calidad seminal.
En referencia a la motilidad, solamente se observaron diferencias significativas
en el análisis de las subpoblaciones espermáticas. A este respecto, cabe indicar que
nuestro estudio mostró la existencia de cuatro subpoblaciones espermáticas. La
subpoblación uno se caracterizó por presentar un movimiento rápido y muy oscilante.
La subpoblación dos se caracterizó por presentar un movimiento lento de baja
oscilación. La subpoblación tres se caracterizó por presentar un movimiento lento y
oscilante. Por último, la subpoblación cuatro se caracterizó por un movimiento muy
rápido y muy oscilante. Estudios previos (Abaigar et al., 1999) mostraron la existencia
de tres, y no de cuatro, subpoblaciones espermáticas. Abaigar et al (1999) observaron
que, en su caso, la subpoblación uno mostró un movimiento rápido con una elevada
capacidad progresiva, la subpoblación dos mostró un movimiento también rápido pero
de poca capacidad progresiva y finalmente, la subpoblación tres presentó un
movimiento lento, correspondiendo, posiblemente, a células en estado de degeneración.
Las razones de la diferencia entre nuestros resultados y los de Abaigar et al pueden ser
varias: el número de machos utilizados, el número de espermatozoides analizados, el
tipo de análisis estadístico, el sistema de análisis de motilidad, la toma de muestras, la
raza de los verracos y el individuo. Así, el trabajo llevado a cabo por Abaigar et al
utilizó un total de cuatro machos, pertenecientes tres de ellos a la raza Large White y
uno a la raza Landrace. De cada uno de estos animales se realizó una única extracción
seminal. El número total de espermatozoides analizados fue de 3.208. La motilidad se
analizó con un Hobson Sperm Tracker utilizando una cámara Mackler. De todos los
parámetros analizados por el software sólo se estudiaron la VCL, la VSL, la BCF y la
ALH. El paquete estadístico utilizado fue el PATN. El análisis estadístico contempló, en
primer lugar, una clasificación no jerárquica de los valores espermáticos mediante un
algoritmo ALOC que asignó los espermatozoides en diferentes grupos según las
magnitudes descritas. A continuación se realizó una combinación jerárquica
conglomerativa secuencial que permitió reducir el número de grupos, en este caso
subpoblaciones espermáticas. Por último, se realizó un análisis de coordinados
principales para reducir el número de variables. Una vez obtenidas las variables a
estudiar, se realizaron análisis de la varianza (ANOVA) y χ2 para determinar las
diferencias estadísticas.
Discusión

En nuestro estudio, en cambio, se utilizaron un total de 30 verracos
pertenecientes a tres híbridos comerciales distintos. De cada uno de los animales se
obtuvieron 12 eyaculados, lo que hace un total de 360 eyaculados. El número total de
espermatozoides analizados fue 51.886. La motilidad se analizó mediante un Sperm
Class Analyzer con el tratamiento de las muestras descrito anteriormente en el apartado
de Material y Métodos. Las variables analizadas fueron la VAP, el WOB, la ALHmed,
la BCF, la HLO y la HBS. Las pruebas estadísticas realizadas fueron las mismas
llevadas a cabo por Abaigar y colaboradores, con la diferencia que las variables fueron
seleccionadas previamente a la determinación de las diferentes subpoblaciones
espermáticas mediante un análisis jerárquico de conglomerados por correlaciones
sucesivas.
Así, vemos que existen numerosos parámetros que difieren entre el trabajo de
Abaigar et al y el nuestro. Gran parte de estos parámetros afectan directamente al propio
análisis estadístico y, por tanto, a la existencia o no de diferencias significativas entre
los distintos grupos de estudio. Éstos son el número de verracos utilizados, el número de
espermatozoides analizados y el propio tipo de análisis estadístico. Por lo tanto, sería
necesario estandarizar los parámetros que afectan al estudio estadístico de la motilidad.
De este modo se conseguiría homogeneizar los resultados y permitiría la realización de
estudios comparativos entre distintos grupos de investigación. En la actualidad esto es
imposible de realizar debido a las distintas metodologías de análisis y da lugar a
resultados tan diferentes como lo mostrado.
Respecto al factor raza, está claramente establecido que ésta afecta de forma
directa las características reproductivas del verraco, tanto en la entrada en pubertad
(Bazer et al., 1988), como en las características del semen (Swierstra, 1973; Koh et al.,
1976; Conlon y Kennedy, 1978; Jonson et al., 1980; Kennedy y Wilkins, 1984). Del
mismo modo, también el efecto individuo aporta variaciones en las características
seminales. Todo ello hace que las variaciones en la estructura de subpoblaciones puedan
ser altas dependiendo de la raza y el individuo.
Otro factor probablemente de gran importancia es el manejo de las muestras de
semen. Las muestras seminales del estudio realizado por Abaigar et al se analizaron
después de 24 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. El semen estaba
diluido en Beltsville Thawing Solution (BTS). Este diluyente está compuesto por
dextrosa, citrato sódico deshidrogenado, bicarbonato sódico, tetraacetato etilendiamino
Discusión

disódico (EDTA) y cloruro potásico (Pursel y Johnson, 1975). Previamente al análisis,
los espermatozoides se trataron mediante la técnica de lavado con Percoll descrita por
Harrison et al (1993). Las muestras se incubaron a 39º C durante 10 minutos y a
continuación se realizó la toma de imágenes. En nuestro estudio, tal y como se ha
descrito en el apartado de Material y Métodos, el semen se analizó el mismo día de la
extracción. La temperatura de las muestras, una vez diluidas en SP, se mantuvo a 16º C
y la incubación se realizó a 37º C durante 10 minutos. Así, observamos tres factores que
pueden afectar las características del semen, como son el diluyente utilizado, el tiempo
transcurrido desde la extracción hasta el análisis y la temperatura a la que se
mantuvieron durante su conservación y a la que se realizó el análisis.
Dentro del análisis de las características de motilidad de las diferentes
subpoblaciones espermáticas, sólo se observaron diferencias significativas importantes
en los porcentajes de distribución de dichas subpoblaciones espermáticas. Las
subpoblaciones espermáticas parecen tener su origen en las variaciones del desarrollo de
los espermatozoides durante la espermatogénesis y espermiogénesis y al distinto estado
de maduración y edad a la que entran en el epidídimo (Abaigar et al, 1999). También se
ha observado que alteraciones en el semen pueden provocar que las subpoblaciones
espermáticas actúen de diferente modo entre ellas (Holt, 1996). Por lo tanto, la razón de
las variaciones en los porcentajes poblacionales podría basarse en actuaciones sobre
cualquiera de estos puntos.
Bajo nuestro punto de vista, una de las explicaciones sería que los cambios de
luz actuasen de algún modo a nivel de epidídimo. Es en esta estructura dónde los
espermatozoides finalizan su maduración. Por lo tanto sería lógico pensar que los
cambios observados en la motilidad puedan tener un origen epididimario y producirse
durante el proceso de maduración. La función epididimaria está afectada por numerosos
factores testiculares. Uno de los más importantes son los andrógenos (Danzo et al.,
1977; Fawcett y Joffer, 1979; Nicander et al., 1983; Robaire y Viger, 1995). Así,
estudios realizados con cultivos celulares de epitelio epidimario establecieron la
necesidad de la presencia de testosterona y dihidrotestosterona en los medios de cultivo
para mantener la función epitelial de los cultivos (Orgebin-Crist et al., 1975; Vázquez et
al., 1986). Sin duda, existen otros factores que regulan la síntesis y secreción de las
proteínas epididimarias, pero su efecto sobre el epidídimo es controvertido, ya que los
estudios se han realizado siempre en células en cultivo, lo que altera las relaciones
paracrinas entre epitelio, espermatozoides y conjuntivo que se establecen “in vivo”
Discusión

(Brooks, 1979; Brooks, 1983; Sujarit et al., 1990; Holland et al., 1992; Lan et al., 1998).
A pesar de los numerosos estudios realizados, aún no está establecido a ciencia cierta si
estas substancias influyen específicamente sobre el desarrollo de la motilidad
espermática o simplemente benefician de algún modo la viabilidad espermática (Moore
et al., 1998).
Los andrógenos se sintetizan mayoritariamente en las células de Leydig,
presentes en el tejido intersticial testicular. Parece lógico suponer que, puesto que la
función epididimaria depende de estos andrógenos, la luz afecte indirectamente al
epidídimo mediante una acción sobre las células de Leydig. Se ha de tener en cuenta a
este respecto que la secreción de andrógenos por parte de las células de Leydig está
regulada por el eje hipotálamo-hipófisis-testículo. El hipotálamo secreta hormona
liberadora de gónadotrofinas (GnRH) que actúa sobre la adenohipófisis. Ésta, a su vez,
libera LH que actúa sobre las células de Leydig, activando la síntesis y secreción de
testosterona por parte de estas células. La LH se une específicamente a la membrana de
las células de Leydig y activa el cAMP. Éste inicia la activación de proteinquinasas que
catalizan la fosforilación de proteínas intracelulares y la movilización de precursores de
esteroides, principalmente la conversión de colesterol en pregnenolona. A partir de la
pregnenolona se sintetizan el resto de esteroides implicados en la reproducción,
incluyendo la testosterona (Stabenfeldt y Edqvist, 1984).
La testosterona producida por las células de Leydig es liberada en los túbulos
seminíferos por difusión, simple o facilitada, y metabolizada en estrógenos y
dihidrotestosterona. Los estrógenos son liberados al torrente sanguíneo, mientras que la
dihidrotestosterona es liberada de nuevo a los túbulos seminíferos (Johnson y Everitt,
1984) Así, podríamos afirmar que cualquier situación que alterara alguna de las fases de
dicho eje podría llegar a afectar la secreción de andrógenos y, con ello, el proceso de
maduración de los espermatozoides.
De hecho, existe abundante bibliografía en diversas especies sobre el efecto de la
luz en las células de Leydig. Así, en especies estacionales de día corto, como el jabalí,
se ha observado que durante la época reproductiva la luz produce un incremento en la
frecuencia de secreción de la GnRH. Este incremento de GnRH produce a su vez un
incremento en la secreción de LH que, por lo tanto, originará una síntesis y secreción
más elevada de testosterona. Durante la temporada no reproductiva, la producción de
testosterona es inferior porque la frecuencia de secreción de LH es baja y las células de
Discusión

Leydig no responden tanto a la acción de la LH. Además, se ha observado que la
función epididimaria depende de la presencia de testosterona adluminal, puesto que la
falta de esta hormona provoca una degeneración del epidídimo (Stabenfeldt y Edqvist,
1984). Por lo tanto, sería lógico que cambios en los niveles de andrógenos epididimarios
se reflejaran de algún modo en la calidad espermática. De ser cierta esta hipótesis en el
caso del verraco, tendríamos que asumir que los cambios en los niveles de testosterona
en el epidídimo pueden ser los responsables de que los espermatozoides adquieran unas
características de motilidad u otras.
Sin embargo, los andrógenos no son el único factor importante en la regulación
epididimaria. Así, otra sustancia importante en esta regulación es la proteína de unión a
andrógenos (androgen binding protein, ABP). Esta proteína es secretada por las células
de Sertoli, siendo su síntesis y secreción reguladas por la acción de la FSH. La ABP se
une a la testosterona y la transporta hasta el epidídimo, regulando así la función de la
hormona (Stabenfeldt y Edqvist, 1984). No hemos encontrado en la bibliografía
estudios que determinen si los cambios lumínicos afectan o no la producción de ABP,
pero podría ser así. De esta manera los cambios observados podrían ser debidos a una
modificación de la síntesis y/o secreción de la ABP o de su capacidad para ligar y
transportar la testosterona hasta el epidídimo.
Sin embargo, los cambios en la motilidad espermática podrían deberse también a
una acción de la luz sobre la espermatogénesis del verraco, de tal manera que el
fotoperíodo podría inducir cambios estructurales sutiles que modificarán en última
instancia la motilidad. Así, la luz induce la secreción de melatonina en la glándula
pineal. Esta melatonina actúa, por un lado, sobre los melanóforos que son los
encargados de la coloración de la piel y, por otro, sobre los melanocitos. Éstos a su vez
regulan la secreción de la GnRH, lo que, como ya se ha indicado, afecta la secreción de
testosterona en las células de Leydig. La testosterona es importante no sólo para la
regulación de la función epididimaria y la aparición y mantenimiento de los caracteres
sexuales secundarios, si no también para el mantenimiento de la espermatogénesis,
sobretodo en la fase de meiosis. Se ha observado que la FSH es necesaria para iniciar el
proceso de espermatogénesis. Sin embargo, una vez que el proceso se pone en marcha al
inicio de la pubertad, la secreción de FSH parece que no es tan esencial para el
mantenimiento de la espermatogénesis, sino que es la testosterona la que adquiere
mayor importancia (Stabenfeldt y Edqvist, 1984). Así, una supresión de la secreción de
testosterona inhibe la conversión de las espermátidas en estadío 7 a espermátidas en