Durchflusszytometrische Analysen zur Expression des Hitzeschockproteins Hsp70 auf der

252 Pages·2004·6.5 MB·German

by  Hantschel Markus

Universität Regensburg
Naturwissenschaftliche Fakultät IV- Chemie und Pharmazie
Institut für Pharmazie

Inaugural-Dissertation

Thema:

DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN
ZUR EXPRESSION DES HITZESCHOCKPROTEINS HSP70 AUF DER ZELLOBERFLÄCHE
VON
KOLOREKTALEN PRIMÄRTUMOREN UND HEPATISCHEN METASTASEN,
MAGENKARZINOMEN, BRONCHIALKARZINOMEN, KOPF-HALS-TUMOREN UND
AKUTEN MYELOISCHEN LEUKÄMIEN

vorgelegt von
Markus Hantschel

Erstgutachter: Prof. Dr. A. Buschauer
Zweitgutachter: Prof. Dr. G.Multhoff

Regensburg, 2004

Mit Genehmigung der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV-
Chemie und Pharmazie
der Universität Regensburg

Die Arbeit wurde eingeleitet von: Prof. Dr. G. Multhoff

Das Promotionsgesuch wurde eingereicht am: 13. Mai 2004

Tag der mündlichen Prüfung: 30. Juni 2004

Prüfungsausschuß:

Prof. Dr. S. Elz (Vorsitzender)

Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)

Prof. Dr. G. Multhoff (Zweitgutachter)

Prof. Dr. G. Franz (3. Prüfer)
Danksagung

Mein großer Dank gilt Frau Prof. Dr. Gabriele Multhoff für die Überlassung des Themas.
Mein großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Armin Buschauer, Herrn Prof. Dr. Gerhard Franz und
Herrn Prof. Dr. Sigurd Elz dafür, eine externe pharmazeutische Promotion anzufertigen zu
können.
Mein großer Dank gilt den Mitgliedern ihrer Arbeitsgruppe für die angenehme menschliche
Atmosphäre: Catherina Groß, Gerald Thonigs, Lydia Rossbacher, Dr. Michael Hafner,
Matthias Gehrmann. Ebenso den „Nachbaren“ im Carrerás-Forschungsbau: Karin Fischer,
Monika Laumer, Sandra Vogl, Jana Heymann und Prof. Dr. Andreas Mackensen.
Mein großer Dank gilt den Ärzten für die Überlassung von Gewebeproben:
Prof. Dr. Olaf Arndt, Dr. Tobias Kleinjung, Dr. Karin Pfister, PD Dr. Helga Schmetzer, PD
Dr. Ulrich Rothe, PD Dr. Thomas Freitag, Dr. Friedrich Zimmermann.
Mein großer Dank gilt meinen promotionsstudentischen Kollegen Christin Schmidbauer und
Christian Moser für die noch folgende Auswertung der Resultate nach weiteren klinischen
Kriterien.
Mein großer Dank gilt Dr. Renate Hiefinger-Schindlbeck und Dr. Jürgen Hallbach für die
Erlaubnis, am Institut für Klinische Chemie im KMB am FACSCalibur Messresultate
auszuwerten.
Mein großer Dank gilt meinen Chefs Dr. Heike Alz, Zentralapotheke der Medizinischen
Hochschule Hannover und Dr. Hugo Krämer, Apotheke des Städt. Krankenhauses München-
Bogenhausen.
Mein großer Dank gilt meiner Familie für die in dieser Zeit von ihr erhaltene Unterstützung.
Für
Maximilian Hantschel

Der erste Schluck aus dem Becher der Natur
führt zum Atheismus,
aber auf dem Grund wartet Gott.

Werner Heisenberg
1

1 EINLEITUNG 11

1.1 PATHOLOGISCHE RELEVANZ DER
HITZESCHOCKPROTEINE 13

1.1.1 Intrazelluläre Funktionen der Hitzeschockproteine 13
1.1.2 Dysregulation von Hitzeschockproteinen in malignen Zellen 14
1.1.3 Expression von Hsp70 auf der Oberfläche humaner Tumorzelllinien 14

1.2 IMMUNOLOGISCHE BEDEUTUNG VON HSP70 16

1.2.1 Hsp70 auf Tumorzellen als Erkennungsstruktur für NK-Zellen 16
1.2.2 Modulation der Zytotoxizität natürlicher Killerzellen durch Hsp70 16
1.2.3 Als Ligand für NK-Zellen agierendes Epitop des Molekül Hsp70 18
1.2.4 Mögliche therapeutische Anwendungen des Hsp70-Peptid-Fragments 20

1.3 KLINISCHER HINTERGRUND DER UNTERSUCHTEN
MALIGNEN ERKRANKUNGEN 21

1.3.1 Kolorektales Karzinom 21
1.3.1.1 Definition 21
1.3.1.2 Epidemiologie 21
1.3.1.3 Histologie 21
1.3.1.4 Lokalisation kolorektaler Karzinome 21
1.3.1.5 Tumorstadien des kolorektalen Karzinoms 22
1.3.1.6 Ätiologie kolorektaler Karzinome 22
1.3.1.7 Hereditäre Formen kolorektaler Karzinome 23
1.3.1.8 Prognose des kolorektalen Karzinoms 24
1.3.1.9 Klinisch eingesetzte Tumormarker für das kolorektale Karzinom 25
1.3.2 Hepatische Metastasen nach kolorektalen Karzinomen 25
1.3.3 Magenkarzinom 26
2
1.3.3.1 Definition und Häufigkeit des Magenkarzinoms 26
1.3.3.2 Ätiologie 26
1.3.3.3 Histologische Klassifikation 26
1.3.3.4 Prognose des Magenkarzinoms 27
1.3.3.5 Klinisch relevante Tumormarker 28
1.3.3.6 Molekulare Marker bei Magenkarzinomen 28
1.3.4 Bronchialkarzinom 30
1.3.4.1 Definition 30
1.3.4.2 Epidemiologie 30
1.3.4.3 Klassifikationen bronchialer Tumore 31
1.3.4.4 Prognose des kleinzelligen Bronchialkarzinoms 34
1.3.4.5 Prognose des nichtkleinzelligen Bronchialkarzinoms 34
1.3.4.6 Klinisch relevante Tumormarker für bronchiale Tumore 34
1.3.4.7 Molekular-onkologische Marker für Bronchialtumore 35
1.3.5 Kopf-Hals-Tumore 38
1.3.5.1 Mundhöhlenkarzinom 38
1.3.5.2 Oropharynxkarzinom 38
1.3.5.3 Hypopharynxkarzinom 39
1.3.5.4 Larynxkarzinom 40
1.3.5.5 Molekulare Marker für Kopf-Hals-Tumore 41
1.3.6 Makropathologische Einteilung der Tumore 42
1.3.7 Akute myeloische Leukämie 43
1.3.7.1 Definition der akuten myeloischen Leukämie 43
1.3.7.2 Einteilung der akuten myeloischen Leukämie nach WHO 43
1.3.7.3 Häufigkeit der AML 44
1.3.7.4 Ätiologie 44
1.3.7.5 Zytologische Definition der AML 45
1.3.7.6 Häufigkeit der Subtypen der akuten myeloischen Leukämie 47
1.3.7.7 Molekulare Marker der akuten myeloischen Leukämie 47
1.3.7.8 Klinischer Stellenwert der wiederkehrenden genetischen Anomalien 49
1.3.7.9 Immunzytochemische Marker der akuten myeloischen Leukämie 50
3

1.4 UNTERSUCHUNG DES VORKOMMENS VON HSP70 AUF
HUMANEN TUMOREN 53

1.4.1 Mögliche analytische Verfahren 53
1.4.1.1 Messprinzip der Durchflusszytometrie 54
1.4.1.2 Pathologische Anwendungen der Durchflusszytometrie 54
1.4.1.3 Voraussetzungen für die Durchflusszytometrie an Gewebeproben 55
1.4.1.4 Erfordernisse an die immunphänotypische Bestimmung von Hsp70 als
Oberflächenmarker 55

2 MATERIAL UND METHODEN 57

2.1 PATHOLOGISCHE DATEN DER UNTERSUCHTEN
TUMORBIOPSIEN 58

2.1.1 Biopsien kolorektaler Karzinome und kolorektaler Normalmucosa 58
2.1.1.1 Stichprobenumfang bei kolorektalen Karzinomen und Normalgeweben 58
2.1.1.2 Tumorlokalisation der untersuchten kolorektalen Karzinome 58
2.1.2 Biopsien hepatischer Metastasen 59
2.1.3 Magenkarzinome 59
2.1.4 Bronchiale Tumorbiopsien 59
2.1.5 Kopf-Hals-Tumore und Normalgewebebiopsien 60
2.1.6 Tumorbiopsien für die Evaluation der Disaggregation 60

2.2 KLINISCHE VORGABEN DER AKUTEN MYELOISCHEN
LEUKÄMIE 61

2.2.1 Vergleichsgruppe nicht-leukämischen Knochenmarks 61
2.2.2 Patienten mit de novo akuter myeloischer Leukämie 61
2.2.3 Patienten mit sekundärer akuter myeloischer Leukämie 62
2.2.4 Patienten mit rezidivierter akuter myeloischer Leukämie 62
2.2.5 Knochenmarksaspirate von Patienten mit einer AML in Persistenz 62
4
2.2.6 Zytogenetische Merkmale der akuten myeloischen Leukämie 63
2.2.6.1 de novo akute myeloische Leukämie 63
2.2.6.2 Sekundäre akute myeloischer Leukämien 63
2.2.6.3 Rezidivierte akute myeloische Leukämie 64
2.2.6.4 Persistente akute myeloische Leukämie 64

2.3 EINZELZELLPRÄPARATION 65

2.3.1 Knochenmarksaspirate und periphere Blutproben 65
2.3.1.1 Isolation der mononukleären Zellen 65
2.3.1.2 Zellzahl- und Viabilitätsbestimmung 65
2.3.1.3 Übernacht-Recovery 66
2.3.1.4 Einfrieren von kultivierten mononukleären Zellen aus
Knochenmarksaspiraten 66
2.3.2 Analyse solider Gewebebiopsien 66
2.3.2.1 Makroskopische Konsistenzbestimmung solider Gewebebiopsien 66
2.3.2.2 Gewebedisaggregation 67
2.3.2.3 Vitaliätsbestimmung 67

2.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 68

2.4.1 Technische Voraussetzungen für die Durchflusszytometrie 68
2.4.2 Antikörperspektrum 69
2.4.2.1 Leukämische und nicht-leukämische Knochenmarksaspirate
und periphere Blutproben 69
2.4.2.2 Antikörperspektrum für solide Tumore und nicht-maligne
Vergleichsgewebe 71
2.4.3 Immunphänotypisierung von Knochenmarksaspiraten und peripheren
Blutproben 73
2.4.3.1 Anpassung der probenindividuelle Geräteeinstellungen 73
2.4.3.2 Aufzeichnung der durchflusszytometrischen Messung 76
2.4.3.3 Auswertung der Immunphänotypisierung 77
2.4.4 Immunphänotypisierung von Einzelzellen aus soliden Gewebebiopsien 77
2.4.4.1 Anpassung der Geräteeinstellungen 77
5
2.4.4.2 Aufzeichnung der durchflusszytometrischen Analyse 79
2.4.4.3 Auswertung der Analysen von Einzelzellen aus den Gewebebiopsien 79
2.5 STATISTISCHE UNTERSUCHUNGEN 81

2.5.1 Vergleiche zwischen klinisch distinkten Subtypen 81
2.5.2 Gruppenvergleiche zwischen Tumorbiopsien und nicht-malignen
Kontrollgeweben 81
2.5.3 Individualvergleiche zwischen Tumorbiopsie und normalem Gewebe 81
2.5.4 Relative Häufigkeiten Hsp70-positiver Aspirate und Biopsien 82
2.5.5 Berechnungen zur Validität der Hsp70-Bestimmung 82

3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 83

3.1 BASISEXPERIMENTE ZUR MANUELLEN
DISAGGREGATION VON SOLIDEN GEWEBEBIOPSIEN 85
3.1.1 Lichtmikroskopische Untersuchung der Zellsuspension 86
3.1.2 Optimierung der manuellen Disaggregation 87
3.1.2.1 Gesamtzellzahl 87
3.1.2.2 Bestimmung der Vitalität 88
3.1.3 Durchflusszytometrische Analyse der Vitalität 89

3.2 KOLOREKTALES KARZINOM 90

3.2.1 Makropathologische Untersuchung der Gewebebiopsien 90
3.2.2 Multiparametrische Analyse von vitalen Einzelzellen aus kolorektalen
Biopsien 90
3.2.2.1 Durchflusszytometrische Analyse einer Normalschleimhautbiopsie 91
3.2.2.2 Durchflusszytometrische Analyse der Tumorbiopsie 97
3.2.3 Quantative Untersuchungen zum Einfluss der makroskopischen
Konsistenz kolorektaler Karzinome auf die Immunphänotypisierung 102
3.2.3.1 Vitalität 102