du peptide à la protéine

268 Pages·2008·4.88 MB·French

UNIVERSITE PARIS XI – ORSAY
ECOLE DOCTORALE RAYONNEMENT ET ENVIRONNEMENT

THESE

présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR EN CHIMIE
DE L’UNIVERSITE PARIS XI ORSAY

par

Aurélie JEANSON

Interaction des actinides avec
les acides aminés :
du peptide à la protéine

Thèse dirigée par : M. Christophe DEN AUWER

Soutenue le 26 Septembre 2008 devant la commission d’examen

Pr. Eric SIMONI Président
Mme. Valérie BRIOIS Rapporteurs
Pr. Peter FALLER
M. Eric ANSOBORLO Examinateurs
M. Christophe DEN AUWER
M. Christoph HENNIG
Mme. Claude VIDAUD Invitée
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UNIVERSITE PARIS XI – ORSAY
ECOLE DOCTORALE RAYONNEMENT ET ENVIRONNEMENT

THESE

présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR EN CHIMIE
DE L’UNIVERSITE PARIS XI ORSAY

par

Aurélie JEANSON

Interaction des actinides avec
les acides aminés :
du peptide à la protéine

Thèse dirigée par : M. Christophe DEN AUWER

Soutenue le 26 Septembre 2008 devant la commission d’examen

Pr. Eric SIMONI Président
Mme. Valérie BRIOIS Rapporteurs
Pr. Peter FALLER
M. Eric ANSOBORLO Examinateurs
M. Christophe DEN AUWER
M. Christoph HENNIG
Mme. Claude VIDAUD Invitée

R
EMERCIEMENTS

Cette thèse a été effectuée au LCAM*, laboratoire du pôle énergie nucléaire du
Commissariat à l’Energie Atomique (CEA) de Marcoule. Je tiens donc tout d’abord à
remercier Denis Guillaneux et Pascal Baron de m’avoir accueillie au sein de leur équipe afin
de mener à bien ce travail de recherche. Merci également à Bernard Berthier, directeur de
l'école doctorale Rayonnements et Environnement de l'Université Paris XI, dont ma thèse
dépendait. Toute ma gratitude à Valérie Moulin et CEA/MRTRA pour le soutien financier.

Je remercie également Christophe Den Auwer, directeur de thèse et encadrant, d’avoir
su me guider pendant ces trois ans de thèse, de sa pédagogie et de sa patience, et surtout de
m’avoir communiqué son enthousiasme et sa bonne humeur, notamment pendant les
longues nuits sur les synchrotrons…

Toute ma reconnaissance à tous les membres du jury de ma thèse pour avoir accepté de
s’intéresser à mon sujet, et pour m’avoir apporté des conseils pour l’amélioration de ce
manuscrit. Merci, donc, à Eric Simoni d’avoir présidé ce jury très plurydisciplinaire, à
Valérie Briois et Peter Faller d’avoir rapporté ce manuscrit, ainsi qu’à Eric Ansoborlo,
Christoph Hennig et Claude Vidaud d’avoir siégé au sein de ce jury.

Je tiens également à remercier toutes les personnes ayant collaboré de près ou de loin à
ces travaux de thèse : Stéphanie Coantic pour la synthèse des peptides, Claude Vidaud pour
son aide sur la manipulation de la transferrine, Sophie Dézard pour la synthèse du 15N-NTA,
Lucie Bonin et Philippe Moisy pour leur aide sur la spéciation des actinides, Claude Berthon
et Sébastien Petit pour les mesures RMN, Stéphane Esnouf pour les mesures RPE, Nicolas
Floquet, Philippe Guilbaud, Dominique Guillaumont et Olivier Pible pour leurs calculs de
chimie quantique et de dynamique moléculaire, ainsi que les équipes des laboratoires LN1
et L18 pour leur accueil et leur aide lors de mes expériences. Merci également à tous les
local contacts et responsables de lignes synchrotrons d’avoir accordé du temps à ce projet :
Christoph Hennig, Harald Funke, Andre Rossberg et Andreas Scheinost sur ROBL, Sakura
Pascarelli et Pier-Lorenzo Solari sur BM29, Jean-Louis Hazemann et Olivier Proux sur
FAME, ainsi que John Bargar, Steve Conradson, Juan Lezpa et Joe Rogers sur 11-2 et 10-2,

* Laboratoire de Conception des Architectures Moléculaire, Service de Chimie des Procédés de Séparation,
Département de RadioChimie et Procédés, CEA Marcoule, 30207 Bagnols sur Cèze
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à SSRL. Merci à tous de votre aide mais aussi de votre gentillesse qui rendait ces
expériences synchrotrons intenses et fatiguantes de vrais moments de plaisir. Tous mes
remerciements également à Philip Callow et Michel Ferrand pour leur intérêt et leur
motivation à participer à ce travail lors des expériences de diffusion de neutrons aux petits
angles.

Enfin, j’adresse mes remerciements à tous mes collègues et amis thésards, post-docs,
DRT, et mêmes permanents, de Marcoule et d’ailleurs, qui m’ont aidée à garder le moral
pendant ces trois ans, grâce à leur sympathie et leur humour, et aux réflexions
"philosophiques", sérieuses ou parfois un peu délirantes, que nous avons partagées.

Merci également à ma famille et à mes amis "d'avant" de leur soutien, et de s'être
occupés du ménage et de la cuisine pendant que je rédigeais ce manuscrit.
- 4 -
R
ESUME

Interaction des actinides avec les acides aminés : du peptide à la protéine

L'acquisition d'informations structurales sur des complexes d'actinides avec des
molécules d'intérêt biologique peut améliorer la compréhension des mécanismes de
transport des actinides dans les organismes vivants, et contribuer à élaborer de nouveaux
traitements décorporants.
Notre étude porte sur les cations Th(IV), Np(IV), Pu(IV) et sur l'uranyle(VI), qui
possèdent une grande affinité avec certains domaines protéiques, ainsi que sur le Fer(III),
cation naturel de ces systèmes. La chélation des actinides a été mise en évidence par
spectroscopie UV-visible-PIR, RMN, RPE et ultrafiltration. La détermination de la structure
du site de complexation a été entreprise grâce à des mesures SAX (EXAFS), et celle de la
structure tertiaire de la protéine par DNPA.
Une première approche a pour but de décrire les modes d'interaction entre les actinides
et les fonctions chimiques essentielles des protéines. Ainsi, le peptide Ac-
AspAspProAspAsp-NH a été étudié en tant que chélatant potentiel des actinides. Les
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espèces identifiées sont polynucléaires, avec des ponts µ-oxo ou µ-hydroxo. Le complexe
de fer est binucléaire, et les complexes d'actinides possèdent une nucléarité plus importante.
Le deuxième axe de recherche porte sur l'étude d'un cas réel de complexation des
actinides par une protéine : la transferrine. Les résultats montrent que la transferrine forme,
autour du pH physiologique, un complexe mononucléaire avec Np(IV) et Pu(IV), alors que
Th(IV) n'est pas complexé dans ces conditions. Les distances caractéristiques des complexes
M-transferrine (M = Fe, Np, Pu) ont été déterminées. La protéine semble être en
conformation fermée pour le Pu(IV), et ouverte pour Np(IV) et UO 2+.
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MOTS CLEFS : actinides(IV), peptides, transferrine, EXAFS
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S
UMMARY

Interaction of actinides(IV) with aminoacids: from peptides to proteins

Structural information on complexes of actinides with molecules of biological interest
is required to better understand the mechanisms of actinides transport in living organisms,
and can contribute to develop new decorporating treatments.
Our study is about Th(IV), Np(IV), Pu(IV) and uranyl(VI) cations, which have a high
affinity for some protein domains, and Fe(III), which is the natural cation of these biological
systems. In this work, chelation of actinides has been brought to light with UV-visible-NIR
spectroscopy, NMR, EPR, and ultrafiltration. Determination of the structure of the
complexation site has been underkaten with EXAFS measurements, and of the tertiary
structure of the protein with SANS measurements.
The first approach was to describe the interaction modes between actinides and
essential chemical functions of proteins. Thus, the Ac-AspAspProAspAsp-NH peptide was
2
studied as a possible chelate of actinides. Polynuclear species with µ-oxo or µ-hydroxo
bridges were identified. The iron complex is binuclear, and the actinide ones have a higher
nuclearity.
The second approach was to study a real case of complexation of actinide with a protein:
transferrin. Results show that around physiological pH a mononuclear complex is formed
with Np(IV) and Pu(IV), while transferrin does not complex Th(IV) in the same conditions.
Characteristic distances of M-transferrin complexes (M = Fe, Np, Pu) were determined.
Moreover, the protein seems to be in its close conformation with Pu(IV), and in its open
form with Np(IV) and UO 2+.
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KEY WORDS : actinides(IV), peptides, transferrin, aminoacids, EXAFS

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T M
ABLE DES ATIERES

LISTE DES ABREVIATIONS ..................................................................................- 7 -
INTRODUCTION...................................................................................................- 9 -
CHAPITRE 1 : TRANSPORT ET COMPORTEMENT DES ACTINIDES EN MILIEU
PHYSIOLOGIQUE : ETAT DE L'ART......................................................................- 13 -
1. Généralités ............................................................................................- 17 -
2. Etudes physiologiques..........................................................................- 22 -
3. Aspects moléculaires............................................................................- 29 -
CHAPITRE 2 : METHODOLOGIE..........................................................................- 33 -
1. Stratégie de synthèse et difficultés rencontrées.................................- 37 -
2. Méthodes d'analyse en laboratoire.....................................................- 47 -
3. Méthodes d'analyse mettant en jeu de grands instruments.............- 51 -
4. Conclusion.............................................................................................- 58 -
CHAPITRE 3 : COMPLEXATION DES ACTINIDES PAR LES PEPTIDES.....................- 59 -
1. Complexes d'actinide par des molécules d'intérêt biologique.........- 63 -
2. Etude de la complexation M – peptide...............................................- 71 -
3. Conclusion : Proposition d'un modèle structural.............................- 93 -
CHAPITRE 4 : ETUDE DE LA HOLOTRANSFERRINE..............................................- 97 -
1. Généralités sur la transferrine..........................................................- 101 -
2. Etude de la holotransferrine .............................................................- 106 -
3. Conclusion de l'étude de la holotransferrine...................................- 118 -
CHAPITRE 5 : COMPLEXATION DES ACTINIDES PAR LA TRANSFERRINE............- 121 -
1. Influence de la nature du métal sur l'interaction transferrine –
métal : Etat de l'art............................................................................- 125 -
2. Protection des actinides : étude structurale du complexe
An(NTA) ............................................................................................- 129 -
2
3. Caractérisation des complexes An – transferrine...........................- 138 -
4. Conclusion...........................................................................................- 158 -
CHAPITRE 6 : REFLEXION ET CONCLUSION GENERALE. STRUCTURE LOCALE /
STRUCTURE TERTIAIRE : APPLICATION A NOTRE SYSTEME D'ETUDE...............- 161 -
1. Quelques généralités sur les métaux en biologie.............................- 165 -
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2. Qui du cation ou de la molécule impose la géométrie de la sphère
de coordination ?................................................................................- 168 -
3. Cas de la transferrine : Adaptation au cation.................................- 171 -
4. Comparaison petite molécule – transferrine : Conclusion et
perspectives.........................................................................................- 174 -
REFERENCES...................................................................................................- 179 -

ANNEXES........................................................................................................- 187 -
Annexe A : Modes Opératoires...........................................................- 189 -
Annexe B : Matériel et Méthodes........................................................- 209 -
Annexe C : Validation des Modèles....................................................- 235 -
Annexe D : Paramètres de traitement des spectres EXAFS.............- 255 -

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